Name: מדידת צריכת החמצן מיטוכונדריאלי הכבד ואת פרוטון הדליפה קינטיקה להעריך נשימה מיטוכונדריאלי ב בקר לחלב הולשטיין (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-30T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: חקור מדידת צריכת חמצן מיטוכונדריאלי בכבד וקינטיקת דליפת פרוטונים להערכת נשימה מיטוכונדריאלית בפרות חולשטיין. שיטה זו מאפשרת למדענים לחקור יעילות אנרגטית ובריאות מיטוכונדריאלית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי קרנות Alltech פתח משרד החקלאות דרך המרכז לבריאות בעלי חיים מזון ב- UC דיוויס בית הספר לרפואה וטרינרית.

כל השיטות, פרוטוקול ולימודי המתוארים כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של אוניברסיטת קליפורניה, דייוויס.
1. לקבל את ביופסיה של הכבד של פרה חלב הולשטיין
הערה: ביופסיה של הכבד צריכה להתבצע על-ידי וטרינר מורשה. ביופסיות כבד יכול להתבצע באתר חלב שבה ממוקמים הפרות. מניקות פרות חולבות ניתן להמשיך לחלוב בדרך כלל, חלב לא צריך להיות מופנמים של אספקת המזון לפני או אחרי הניתוח. מומלץ כי לפחות 4 אנשים נדרשים לבצע את ביופסית הכבד על פרה חלב: וטרינר לבצע את הביופסיה, מטפל בבעלי חיים עומדים על הירך של הפרה כדי להגן על אזור ביופסיה של וטרינר, טכנאי מעבדה בצד החיצוני של העט כדי להפוך פניו er כלים, חומרים, ביופסיה לטעום מן הוטרינר ולשמור על האזור נקי, אשר יכול להיות בחלק האחורי של הרכב (איור 1), טכנאי כדי לאחזר את דגימת כבד ולהתחיל מיטוכונדריאלי בידוד.
<ol><li>חודש אחד לפני ביופסיות כבד, לתת פרות חיסון clostridia. ליצור ערכות כירורגי על ידי מגבות כירורגי autoclaving, מכשיר ביופסיה, מחזיקי האזמל ציוד כירורגי.</li>
	<li>יום אחד לפני ביופסית הכבד, להחדיר את הפרה Ceftiofur הידרוכלוריד 0.044 מ"ל לק"ג משקל גוף subcutaneously בצוואר. צג טמפרטורה פרה, צריכת ותוצאות צואה לשימוש כקו תפקוד תקין.</li>
	<li>ליצור המיטוכונדריה בידוד מדיה (MIM) containining מ מ 220 מניטול, סוכרוז 70 מ מ, 20 מ מ HEPES EDTA 1 מ מ, BSA חינם של חומצת שומן 0.1% (w/v), pH 7.4 ב 4 º C. יהיה צורך כ- 30 מ לכל דגימה.</li>
	<li>לרסן את הפרה פיזית ניצול בפריחה עם מחבל התלייה לפי הצורך (איור 2). באמצעות את הלטר, לקשור את ראשה לצד השמאלי stanchion. במידת הצורך, מעצורים כימי (חריגות השירותים הווטרינריים הידרוכלוריד 100 מ"ג/מ"ל הרביעי-0.010-0.015 מ ג/ק ג משקל גוף) יכול לשמש.</li>
	<li>האזור של הביופסיה הוא למצוא את הזכות 10-11 לחלל הבין-צלעי (איור 3). לצייר קו ישר מן coxae פקעת נכון עד לנקודה של הכתף הימנית. הביופסיה היא איפה הקו מצטלב עם המרחב הבין-צלעי 10-11. לחטא את האזור של הפרה להיות ביופסיה על ידי גילוח שטח מרובע 10 ס מ (איור 4). לשטוף את האזור עם 10% providone סקראב (איור 5) בתנועות מעגליות. תרסיס אזור עם 70% אתנול פתרון (איור 6). אני חוזר שוטף providone ואתנול. הערה: הכבד הוא בעמדה שונה במקצת ב בקר לחלב הולשטיין לעומת בקר.</li>
	<li>להזריק לידוקאין 2% HCl (10-15 מ ל) באופן מקומי לאזור כדי לספק הרדמה של העור, כבסיס שריר, רקמת חיבור (איור 7). חזור על providone ו-70% אתנול שוטף. הערה: קצות העצבים בעור, שרירים, אבל האיברים הפנימיים לא, אז רק anesthestic מקומית נדרשת. לכל היותר, הפרה רק להרגיש קצת לחץ וכאב לא במהלך ההליך ביופסיה.</li>
	<li>עושים 1-2 ס מ דקירה-חתך דרך העור של המרחב הבין-צלעי 10-11 (איור 8). לעבור מכשיר ביופסיה בכבד שור Schackelford-קורטני דרך העור ולכוון את המכשיר ביופסיה בכיוון הגולגולת קלה והמשיכו דרך הסרעפת ואת לתוך הכבד (איור 9, איור 10). להשיג דגימה 1 g של הכבד ולהסיר את המכשיר (איור 11). סגור את העור עם תפר השמה (איור 12).</li>
	<li>המקום הכבד מדגם צינור חרוטי עם מם מספיק כדי לכסות את הדגימה, על הקרח לבידוד המיטוכונדריה מיידית</li>
	<li>החתך הסימון עבור כל אדמומיות, נפיחות, חום, או כאב תוך 24 שעות של ביופסיה, להחדיר את הפרה Ceftiofur הידרוכלוריד 0.044 מ"ל לק"ג משקל גוף subcutaneously בצוואר פעם ביום למשך 3 הימים (איור 13). צג טמפרטורה של הפרה, צריכת ותוצאות צואה מדי יום במשך שבוע לאחר ביופסיה של הכבד. אם מתפתח חום, המשך אנטיביוטיקה שיקול דעתו של הוטרינר. הערה: אם פרה הוא מפגין סימנים של כאב, כגון בעיטות החתך, recumbancy, אודם, חום או התגובה לגעת בתוך 1 h לאחר הביופסיה בכבד, זריקה הרביעי 1 מ"ג/ק"ג משקל גוף של flunixin meglumine ניתן להקל על כאב ודלקת. זריקה שנייה יכולה להינתן אם יש צורך בכך.</li>
	<li>הסרת התפרים 7 ימים לאחר ביופסיה.</li>
</ol>2. בידוד המיטוכונדריה מן הכבד לפרה
<ol><li>בהקדם האפשרי לאחר המדגם הכבד מוסר הפרה, לשטוף את דגימת כבד במם (שלב 1.3) כדי להסיר תאי דם אדומים, דק מינצ הדגימה עם מספריים. הכבד צריך להיות טחון בתוך צוננת המכיל מספיק מדיה בידוד כדי לשמור את הרקמה לחות.</li>
	<li>מקום הכבד טחון לתוך בקבוקון זכוכית 30 מ עם המרוסקים טפלון על סיווג 0.16 מ"מ מודגרות בקרח, המכיל מם (1:4 w/v).</li>
	<li>Homogenize כבד מדגם שהעקב טפלון-500 סל ד עבור דקה עם קווים 4/min. הערה: homogenate הכבד נשמרת על הספל וגדוש קרח במם במהלך התהליך כולו, ואת כל השלבים הבאים צנטריפוגה הושלמו ב 4 ° C</li>
	<li>צנטריפוגה homogenate ב 500 g x 10 דקות, למחוק צניפה, להעביר את תגובת שיקוע שפופרת צנטרפוגה צוננת, ואז centrifuge את תגובת שיקוע שנוצר ב g 10,000 x 10 דקות להשיג בגדר מיטוכונדריאלי.</li>
	<li>Resuspend לרחוץ בגדר ב 10 מ"ל של מים עם חומצת שומן BSA חינם, צנטריפוגה-g 8100 x עבור 10 דקות להשליך תגובת שיקוע.</li>
	<li>Resuspend לרחוץ בגדר ב 10 מ"ל של MIM בלי חומצת שומן BSA חינם, צנטריפוגה-g 8100 x עבור 10 דקות להשליך תגובת שיקוע.</li>
	<li>להשעות את צניפה ב- µL 200 אמצעי בידוד ומניחים על הקרח עד המשמש צריכת החמצן של פרוטון הדליפה מבחני קינטי.</li>
	<li>לקבוע ריכוז חלבון של המתלה גלולה (דילול 1/100) באמצעות ערכת (BCA) חומצה Bicinchoninic לכל הפרוטוקול של היצרן עם BSA התקנית. כל חלבון הוא נחשב מיטוכונדריאלי חלבון.</li>
</ol>3. מדידת צריכת החמצן מיטוכונדריאלי (מצב המדינה ו 3-4)
<ol><li>יצירת מדיה צריכת חמצן (OCM) מ- 120 מ"מ אשלגן כלורי, 5 מ מ ח'2PO4, 5 מ מ MgCl2, 5 מ מ Hepes ו 1 מ"מ EGTA, pH 7.4 ב 30 ° C עם 0.3% defatted BSA. יהיה צורך כ- 3 מ לכל דגימה. גם להכין פתרון של 8 oligomycin μg/מ"ל אתנול.</li>
	<li>דגירה OCM ב 30 º C. להגדיר את הנשימה קאמרית, משאבת חמצן האלקטרודה לפי הוראות היצרן (oxygraph system). התוכנה oxygraph כבר צריך להיות מותקן במחשב.</li>
	<li>מקום 1 מ"ל של OCM אל החדר נשימה ומערבבים נמרצות. פעולה זו תסייע להבטיח כי הפתרון יהיה רווי האוויר.</li>
	<li>להוסיף 0.35 מ ג חלבון חלבון מיטוכונדריאלי לתא נשימה ולשמור על טמפרטורה 30 ° C.</li>
	<li>צריכת החמצן התקליטים במשך כ 5 דקות. ריכוז החמצן oxygraph רשומות מערכת כל כך כמו מגביר נשימה, ריכוז חמצן פוחתת. כאשר צריכת חמצן הופך קבוע (קו ישר יורדת), צריכת החמצן התקליטים (שיפוע של קו = ריכוז חמצן/שעה). זה צריכת חמצן בסיסית.</li>
	<li>להוסיף µL 1.25 של 4 מ מ פתרון rotenone לעכב מתחם אני ולאחר מכן להוסיף 5 µL של 1 מ' פתרון succinate להגיע ריכוז סופי בקנה הנשימה של 5 מ מ succinate. זהו מצב 4 נשימה.</li>
	<li>להוסיף 1 µL של 100 מ מ פתרון ADP להגיע ריכוז סופי בקנה הנשימה של 100 μM. ריכוז חמצן יקטן (נשימה מוגבר) ולאחר מכן לאחר כ 5 דקות הופך להיות קו ישר. להקליט את צריכת החמצן (שיפוע של קו = ריכוז חמצן/שעה). זהו מצב 3 נשימה.</li>
	<li>אופציונלי: בסוף המרוץ, להוסיף FCCP (הנפח הכולל של 0.2 μM) לזירוז נשימה מקסימלי. לתעד את הנשימה למשך בערך 5 דקות (בערך). כאשר צריכת חמצן הופך צריכת חמצן מתמדת, להקליט. זה צריכת חמצן מירבית.</li>
	<li>לחשב באמצעות המשוואה צריכת החמצן המדינה 3 יחס בקרת הנשימה (RCR) / המדינה צריכת חמצן 4.</li>
	<li>תשאף את כל הפתרונות מתוך נשימה. יש לשטוף את החדר כמה פעמים עם מים יונים כפול.</li>
</ol>4. מדידת פוטנציאל ממברנה מיטוכונדריאלי (MMP) וכוח מניע פרוטון (PMF)
<ol><li>להכין תמיסת nigericin 80 ננוגרם למ"ל אתנול. הערה: הכימיקלים האלה הם מומס באתנול, כל מאמץ כדי להגביל את כמות האתנול הנוספים μL פחות מ- 1, מאז אתנול יכול לנתק את מערכת התחבורה אלקטרון ולגרום mitchondrial לקוי.</li>
	<li>לאחר שטיפה ביסודיות את התא עם מים יונים כפול, מקום 1 מ"ל של OCM אל החדר נשימה ומערבבים נמרצות עם פס מגנטי מערבבים. פעולה זו תסייע להבטיח כי הפתרון יהיה רווי האוויר. הוסף מתיל-triphenyl-phosphonium אלקטרודה (TPMP +) רגיש לקנה ההתקנה. TPMP + אלקטרודה אמור להיות מחובר מד pH, ערכים הנקראות מד pH.</li>
	<li>להוסיף 0.35 מ ג חלבון מיטוכונדריאלי תא נשימה.</li>
	<li>הוסף µL 1.25 של 4 מ מ פתרון rotenone לעכב נשימה מורכבת אני רשומה למשך 2-5 דקות (בערך). כאשר צריכת חמצן הופך צריכת חמצן מתמדת, להקליט.</li>
	<li>הוסף μL 0.56 של 8 μg/mL oligomycin לפתרון הסופי ריכוז µg 2.8 oligomycin /0.35 מ"ג חלבון מיטוכונדריאלי לעכב ADP ניצול. לתעד את הנשימה למשך 2-5 דקות (בערך). כאשר צריכת חמצן הופך צריכת חמצן מתמדת, להקליט.</li>
	<li>הוסף 0.112 μL 80 ננוגרם למ"ל nigericin פתרון לבטל את ההדרגה pH על פני קרום פנימי מיטוכונדריאלי. לתעד את הנשימה למשך 2-5 דקות (בערך). כאשר צריכת חמצן הופך צריכת חמצן מתמדת, להקליט. הערה: Rotenone, oligomycin משמשים כדי לחסום תעבורה אלקטרונים בשרשרת במתחם ו- ATP סינתאז, בהתאמה. Nigericin נוספת כדי להמיר transmembrane H + צבע הדרגתי K + שניתן למדידה עם אלקטרודה.</li>
	<li>היכונו עיקול רגיל TPMP + על-ידי הוספת 5 µL של 10 מ מ TPMP + פתרון מיטוכונדריאלי הדגירה. חזור על שלב זה ארבע פעמים נוספות עד ריכוז מוחלט של 2.5 μM TPMP + נוספה.</li>
	<li>ליזום נשימה על-ידי הוספת 5 μL של 1 מ' succinate לתא.</li>
	<li>להקליט את הנשימה עד שהשגת עקבות יציב ולאחר מכן titrate את המערכת על-ידי הוספת malonate. תוספות של malonate צריך להיות 0.5 µL, 1 µL, 1.5 µL, 3.0 µL, 6.0 µL, µL 9.0, ואז 12.5 µL של 0.1 מ מ Malonate פתרון כדי להשיג תוספות רצופים של ריכוז malonate בחדר דגירה של 0.1 0.2 0.3, 0.6, 1.2, 1.8 ו- 2.5 מ מ.</li>
	<li>לאסוף נתונים שתי אלקטרודות (חמצן, TPMP+). תוכנה רכישת נתונים ממערכת oxygraph ניתן לאסוף בו זמנית מדידות של צריכת החמצן מיטוכונדריאלי ואת מיטוכונדריאלי קרומית אפשרית ולבחון שינויים בצריכת חמצן בזמן אמת. איור 14 מראה איך oxygraph רישום צריכת החמצן בהמשך הניסוי.</li>
	<li>לחשב MMP ב mV בהתבסס על משוואת נרנסט: MMP = יומן 61.5 ([TPMP +] נוסף – חיצוניים [TPMP +]) x TPMP+ מחייב תיקון / (0.001 x מ"ג למ"ל חלבון x [TPMP +]) TPMP + מחייב תיקון של 0.4 mg/µL של חלבון מיטוכונדריאלי-1 משמש. דוגמה החישוב מתבסס על ריכוזי בפרוטוקול: MMP = יומן x 61.5 (5 מיקרומטר – 2 מיקרומטר) x 0.4 / (0.001 x 0.35 מ ג חלבון מיטוכונדריאלי/mL x 2 מיקרומטר) MMP = 198.9 mV</li>
	<li>הערכת PMF ידי גרף של MMP לעומת צריכת החמצן (איור 15). PMF המדווח צריכת חמצן פוטנציאל הממברנה של 165 mV. הערה: Titrating את השרשרת אלקטרון תחבורה עם malonate (0.1-2.5 מ מ) מראה את התגובה קינטי של פרוטון דליפה MMP. לאחר מכן, התוויית MMP נגד צריכת החמצן קובע קינטיקה הדליפה פרוטון. PMF נקבעת על-ידי חישוב צריכת חמצן קרום נפוצות פוטנציאליים (165 mV).</li>
	<li>בסוף ההפעלה האחרונה של המדגם, להוסיף FCCP (הנפח הכולל של 0.2 μM) כדי לגרום נשימה מקסימלי ולשחרר TPMP + לתיקון בסיסית.</li>
	<li>תשאף את כל הפתרונות מתוך נשימה. יש לשטוף את החדר כמה פעמים עם מים יונים כפול. בסופו של היום, התא צריך גם לשטוף כמה פעמים עם אתנול.</li>
</ol>

<ol><li>Brand, M. D., Divakaruni, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+and+physiology+of+mitochondrial+proton+leak%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">The regulation and physiology of mitochondrial proton leak.</a> Physiology. 26, 192-205 (2011).</li>
<li>Stephenson, E. J., Hawley, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+function+in+metabolic+health%3A+A+genetic+and+environmental+tug+of+war%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial function in metabolic health: A genetic and environmental tug of war.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1840, 1285-1294 (2014).</li>
<li>Bartlett, K., Eaton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+B+oxidation%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial B oxidation.</a> European Journal of Biochemistry. 271, 462-469 (2004).</li>
<li>Acetoze, G., Kurzbard, R., Klasing, K. C., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. Oxygen Consumption, Respiratory Control Ratio (RCR) and Mitochondrial Proton Leak of broilers with and without growth enhancing levels of minerals supplementation challenged with Eimeria maxima (Ei). Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition. 101, e210-e215 (2016).</li>
<li>Wallace, D. C., Fan, W. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1567724909001536">Energetics, epigenetics, mitochondrial genetics.</a> Mitochondrion. 10, 12-31 (2010).</li>
<li>Paradies, G., Petrosillo, G., Paradies, V., Ruggiero, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress%2C+mitochondrial+bioenergetics+and+cardiolipin+in+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radicals+in+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress, mitochondrial bioenergetics and cardiolipin in aging.</a> Free Radicals in Biology and Medicine. 48, 1286-1295 (2010).</li>
<li>Acetoze, G., Champagne, J., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+mitochondrial+oxygen+consumption+and+efficiency+of+milk+production+in+lactating+Holstein+cows+supplemented+with+Copper%2C+Manganese+and+Zinc%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Animal+Physiology+Animal+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Liver mitochondrial oxygen consumption and efficiency of milk production in lactating Holstein cows supplemented with Copper, Manganese and Zinc.</a> Journal of Animal Physiology Animal Nutrition. 102, e787-e797 (2017).</li>
<li>Brown, D. R., DeNise, S. K., McDaniel, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiratory+metabolism+and+performance+of+cattle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiratory metabolism and performance of cattle.</a> Journal of Animal Science. 66, 1347-1354 (1988).</li>
<li>Golden, M. S., Keisler, J. W., H, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+mitochondrial+function+and+residual+feed+intake+in+Angus+steers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">The relationship between mitochondrial function and residual feed intake in Angus steers.</a> Journal of Animal Science. 84, 861-865 (2006).</li>
<li>Lancaster, P. A., Carstens, G. E., Michal, J. J., Brennan, K. M., Johnson, K. A., Davis, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationships+between+residual+feed+intake+and+hepatic+mitochondrial+function+in+growing+beef+cattle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Relationships between residual feed intake and hepatic mitochondrial function in growing beef cattle.</a> Journal of Animal Science. 92, 3134-3141 (2014).</li>
<li>Acetoze, G., Weber, K. L., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. <a target="_blank" href="https://www.hindawi.com/archive/2015/194014/abs/">Relationship between liver mitochondrial respiration and proton leak kinetics in low and high RFI steers from two lineages of RFI Angus bulls.</a> ISRN Vet Sci. 2015 (194014), (2015).</li>
<li>Halliwell, B., Gutteridge, J. M. C. Protection against oxidants in biological systems: The superoxide theory of oxygen toxicity. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHalliwell%2C+B+%22Free+Radicals+in+Biology+and+Medicine%22">Free Radicals in Biology and Medicine</a>. , Oxford University Press. Oxford. 186-187 (1989).</li>
<li>National Research Council. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Nutrient+Requirements+of+Dairy+Cattle%22">Nutrient Requirements of Dairy Cattle</a>. , 7th revised edition, National Academy Press. Washington, DC. (2001).</li>
<li>Ramsey, J. J., Harper, M. E., Weindruch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restriction+of+energy+intake%2C+energy+expenditure%2C+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Restriction of energy intake, energy expenditure, and aging.</a> Free Radical Biology and Medicine. 29, 946-968 (2000).</li>
<li>Mehta, M. M., Weinberg, S. E., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+control+of+immunity%3A+beyond+ATP%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial control of immunity: beyond ATP.</a> Nature. 17, 608-620 (2017).</li>
<li>Kirby, D. M., Thorburn, D. R., Turnbull, D. M., Taylor, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+assays+of+respiratory+chain+complex+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Biochemical assays of respiratory chain complex activity.</a> Methods in Cell Biology. 80, 93-119 (2007).</li>
<li>Alex, A. P., Collier, J. L., Hadsell, D. L., Collier, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Milk+yield+differences+between+1x+and+4x+milking+are+associated+with+changes+in+mammary+mitochondrial+number+and+milk+protein+gene+expression%2C+but+not+mammary+cell+apoptosis+or+SOCS+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dairy+Science%22%5BJournal%5D)">Milk yield differences between 1x and 4x milking are associated with changes in mammary mitochondrial number and milk protein gene expression, but not mammary cell apoptosis or SOCS gene expression.</a> Journal of Dairy Science. 98, 4439-4448 (2015).</li>
<li>Lossa, S., Lionetti, L., Mollica, M. P., Crescenzo, R., Botta, M., Barletta, A., Liverini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+high-fat+feeding+on+metabolic+efficiency+and+mitochondrial+oxidative+capacity+in+adult+rats%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Effect of high-fat feeding on metabolic efficiency and mitochondrial oxidative capacity in adult rats.</a> British Journal of Nutrition. 90, 953-960 (2003).</li>
<li>Boily, G., Seifert, E. L., Bevilacqua, L., He, X. H., Sabourin, G., Estey, C., Moffat, C., Crawford, S., Saliba, S., Jardine, K., Xuan, J., Evans, M., Harper, M. E., McBurney, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SirT1+regulates+energy+metabolism+and+response+to+caloric+restriction+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">SirT1 regulates energy metabolism and response to caloric restriction in mice.</a> PloS One. 3 (3), e1759(2008).</li>
<li>Chen, Y., Hagopian, K., Bibus, D., Villaba, J. M., Lopez-Lluch, G., Navas, P., Kim, K., McDonald, R. B., Ramsey, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+dietary+lipid+composition+on+liver+mitochondria+from+mice+following+1+month+of+calorie+restriction%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience+Reports%22%5BJournal%5D)">The influence of dietary lipid composition on liver mitochondria from mice following 1 month of calorie restriction.</a> Bioscience Reports. 33, 83-95 (2013).</li>
<li>Chacko, B. K., Kramer, P. A., Ravi, S., Benavides, G. A., Mitchell, T., Dranka, B. P., Ferrick, D., Singal, A. K., Ballinger, S. W., Bailey, S. M., Hardy, R. W., Zhang, J., Zhi, D., Darley-Usmar, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bioenergetic+health+index%3A+a+new+concept+in+mitochondrial+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Science%22%5BJournal%5D)">The bioenergetic health index: a new concept in mitochondrial translational research.</a> Clinical Science. 127, 367-373 (2014).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

הנקודה שבה רוב בפרוטוקול קבלת מדגם מייצג רקמת הכבד, מתחיל את ניתוקה של המיטוכונדריה בהקדם האפשרי לאחר ביופסיה. וריאציה במדידות נשימה הוא נמוך (טבלה 1) בשל תקופה קצרה בתחבורה ציבורית פרה למעבדה. כדי לצמצם את זמן תחבורה, מעבדה קטנה הוקם במשרד של החלב, דגימות הכבד גורשו למעבדה office כפי נאסף כל כך המיטוכונדריה היו מבודדים בתוך 10 דקות של ביופסיה. התקנה ובדיקה של נשימה קאמרית, אלקטרודות (חמצן, TPMP +) עם מד pH נהגה הרשומה הבדלים פרוטון מעברי צבע יום לפני איסוף ועיבוד דגימות יכול למנוע תקלות כגון חסר מידות מ...

המיטוכונדריה הם מאוד רגיש ללחץ, הסביבה התאית שלהם יכול לתרום למגוון רחב של מחלות מטבוליות. צריכת החמצן פרוטון דליפת בתוך המיטוכונדריה אינדיקטורים של המיטוכונדריה בריאות בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. בשיטות המתוארות הזה יעילות אנרגיה מיטוכונדריאלי הערכה של נייר באמצעות RCR מבוסס על צריכת חמצן עם וללא דליפה פרוטון. תוצאות אלו יכול להסביר 30% מהאנרגיה איבד ניצול מזין1. שינויים דליפת חמצן צריכת ואת פרוטון יכול לזהות בתפקוד מיטוכונדריאלי אשר תורם למחלות מטבוליות ותוצאות יעילות אנרגיה ירד. שיטות אלה יכולים לשמש גם כדי לבחון את ההשפעה של טיפולים שונים על נשימה מיטוכונדריאלי. המטרה הכוללת של מדידת צריכת החמצן מיטוכונדריאלי וקינטיקה הדליפה פרוטון הוא להעריך תפקוד מיטוכונדריאלי ויעילות אנרגטית.
בעיות בתפקוד הכבד מיטוכונדריאלי כבר קשור למחלות רבות בבקר לחלב. היכולת של חילוף החומרים הסלולר כדי לעבור בין הפחמימות, השומנים דלקים להתמודדות עם גירעון האנרגיה הנקה מוקדם מושפעת את המספר והתפקוד של המיטוכונדריה בתא2. ליקויים ביכולת של המיטוכונדריה להסתגל הביקוש אנרגיה וβ-חמצון מוגבר יכול להוביל להצטברות של השומנים תאיים הקשורים עם תנגודת לאינסולין, עלול להוביל להיווצרות של כבד שומני בפרות חלב הנקה מוקדם. המיטוכונדריה, כמו האתר של הגוף קטון בייצור ושימוש, יכול לשחק תפקיד מפתח ketosis פרות חלב3. חוסר המיטוכונדריה או בתפקוד מיטוכונדריאלי תשפיע על דלק זמינות לפריפריה, יבואו לידי ביטוי שינויים צריכת חמצן או RCR.
שינויים בצריכת החמצן מיטוכונדריאלי בתגובה לדלקת. בת שבע יום פטם חולקו באופן אקראי לקבוצת נגוע Eimeria maxima ו שליטה קבוצה4. פטם זה לא עברה כגון האתגר היה צריכת חמצן נמוכה בשל דליפת פרוטון RCR גבוה המציין כי המיטוכונדריה הכבד להגיב לאתגר המערכת החיסונית על ידי הגדלת הדליפה פרוטון. בעת דליפת פרוטון ומגיבים הפקת מינים חמצן פעם אחת נחשב סימן של חוסר תפקוד ממברנה מיטוכונדריאלי, פוגעת יעילות אנרגטית, עכשיו זה ידוע שזה חשוב עבור ייבוא של חלבונים וסידן לתוך המיטוכונדריה5 , ובשביל הדור של חום1.
דליפת אלקטרונים בשרשרת הנשימה הופכת המיטוכונדריה רגישים ייצור מינים חמצן תגובתי, נזק חמצוני מיטוכונדריאלי קרום חלבונים, שומנים, דנ א מיטוכונדריאלי. כמו גיל המיטוכונדריה, נזק יכול להצטבר במיוחד כדי mtDNA גורם נוסף תפקוד חילוף החומרים מיטוכונדריאלי6 ו ולרגישות רבה יותר של הפרה למחלות. בפועל, חיות משק רבות אכלו רמות גבוהות של תוספי מזון כגון Cu, Zn, Mn כדי להגביר את הפונקציה נוגד חמצון. אולם, האכלה רמות גבוהות של Cu, Zn, Mn ירד ייצור החלב, גדלה צריכת חמצן בשל פרוטון דליפה (4 מצב הנשימה)7.
מחקרים קודמים על התפקיד של הפונקציה מיטוכונדריאלי ביעילות אנרגיה בבקר התמקדה שינויים צריכת החמצן מיטוכונדריאלי פרוטון הדליפה. אך מעט מחקרים פורסמו ב בקר לחלב והשווה רוב המסמכים יעילות הייצור בצורה של צריכת המזון שיורית (RFI) לפונקציה מיטוכונדריאלי ב בקר. השתנות בנשימה מיטוכונדריאלי המחירים נבחנו על ידי מדידת מצב 3, 4 והמדינה RCR ב הכבדים של פרות הולשטיין מניקות והן מניקות בשר פרות (אנגוס, Brangus והרפורד)8. החוקרים לא מצאו קשר בנשימה מיטוכונדריאלי עם צמיחה או חליבה תכונות עבור בקר אבל דיווחת מתאם בין נשימה מיטוכונדריאלי חליבה תכונות עבור Holsteins. שני מחקרים, RFI נמשל ב בקר תעריפי נשימה מיטוכונדריאלי (המדינה 3, 4 והמדינה RCR) שרירים המיטוכונדריה9,10. נשימה מיטוכונדריאלי המחירים השתנו בתגובה DMI, המחירים הנמוכים היו קשורים עם שוורים בשר פחות יעילה. במחקר אחר, RFI של שוורים מתוך שוורים RFI גבוה או נמוך הושוו עם שיעורי נשימה מיטוכונדריאלי וקינטיקה הדליפה פרוטון בין שתי הקבוצות של רומא11. ההבדלים היו בגלל רווח המאשרת למסקנה לזכות אינה לא ההשפעה נשימה מיטוכונדריאלי ב בקר.
בנייר זה, ניסוי בחינת הכבד RCR בתגובה 3 חמצון מינרלים להאכלת בקר לחלב מניקות מדגימה השימוש בשיטות למדידת צריכת החמצן במהלך המדינה 4 ואת המדינה 3 נשימה ומערכת PMF.

<table><tbody><tr><td><ביופסיית כבד חזקה></חזקה></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><חזקה>ציוד</חזקה></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>שקלפורד-קורטני מכשיר ביופסיית כבד בקר</td><td>מכשיר Sontec Instruments Englewood CO</td><td>1103-904</td><td></td></tr><tr><td>תפר</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>19-037-516</td><td></td></tr><tr><td>מחטי תפרים</td><td></td><td></td><td>NA NA כלול עם אזמל תפרים</td></tr><tr><td></td><td>סיגמא - Aldrich</td><td>S2896 / S2646</td><td># לידית ולהבים</td></tr><tr><td>מגבות ניתוח</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>50-129-6667</td><td></td></tr><tr><td>צינורות פלקון 50 מ"ל</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה</td><td>סיגמא - אולדריץ'</td><td>Z168750</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל מזרקים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>22-314387</td><td></td></tr><tr><td>מחטי הזרקה (22, 2 1/2)</td> <td>VWR</td><td>MJ8881-200342</td><td></td></tr><tr><td>הלטר פרה</td><td>אספקת טרקטור ושות '</td><td></td><td></td>101966599</tr><tr><td>צמר גפן ספוגית</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>14-959-102</td><td></td></tr><tr><td>ריבועי גזה כותנה (4x4)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>22-246069</td><td></td></tr><tr><td>מספריים רפואיים</td><td>סיגמא - אולדריץ'</td><td>Z265969</td><td></td></tr><tr><td><חזק>כימיקלים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>חיסון קוקסידיוזיס 0.75 בקבוק/פרה</td><td></td><td></td><td>מסופק על ידי </td></tr><tr>חיסון <td></td><td></td> וטרינרי נגד<td>קלוסטרידיה</td><td>מסופק על ידי וטרינר</td></tr><tr><td>ביופסיית כבד אנטיביוטיקה excenel 2 סמ"ק/100 פאונד למשך 3 ימים</td><td></td><td></td><td>מסופק על ידי הווטרינר</td></tr><tr><td>Providone Scrub</td><td>Aspen Veteterinary Resources</td><td>21260221</td><td></td></tr><tr><td>אתנול 70%</td> <td>Sigma - Aldrich</td><td>793213</td><td></td></tr><tr><td>קסילזין הידרוכלוריד 100 מ"ג/מ"ל IV ב-0.010-0.015 מ"ג/ק"ג משקל</td><td></td><td></td> גוף <td>מסופק על ידי וטרינר</td></tr><tr><td>2% לידוקאין הידרוכלוריד (10-15 מ"ל)</td><td></td><td></td><td>מסופק על ידי וטרינר</td></tr><tr><td>הזרקה של 1 מ"ג/ק"ג IV של פלוניקסין מגלומין</td><td></td><td></td><td>מסופק על ידי וטרינר</td></tr> <tr><td><חזק>בידוד מיטוכונדריה (כבד)</חזק><</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>חזק>ציוד</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>בקבוקון ויטון 30 מ"ל עם עלי טפלון של 0.16 מ"מ</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>02-911-527</td><td></td></tr><tr><td>מנוע הומוגנייזר</td><td>קול פארמר</td><td>EW-04369-10</td><td></td></tr><tr><td>הומוגנייזר בדיקה</td><td>קול פארמר</td><td>EW-04468-22</td><td></td></tr><tr><td>פיפטה אוטומטית (10 מ"ל)</td><td>קול פארמר</td><td>SK-21600-74</td><td></td></tr><tr><td>(500 מ"ל) עם קרח</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>FB100600</td><td></td></tr><tr><td>מיקרופוגה מקוררת</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>75-002-441EW3</td><td></td></tr><tr><td>צינורות מיקרופוגה (1.5 מ"ל)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>AM12400</td><td></td></tr><tr><td><חזק>כימיקלים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr>ערכת <tr><td>בדיקת חלבון חומצה ביצינצ'ונינית (BCA) (מיקרו-פלטות לקורא צלחות)</td><td>abcam</td><td>ab102536</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>סיגמא - אולדריץ'</td><td>S7903-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>T1503-1KG</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>EDS-1KG</td><td></td></tr><tr><td>BSA (ללא חומצות שומן)</td> <td>סיגמא - Aldrich</td><td>A7030-50G</td><td></td></tr><tr><td>מניטול</td><td>סיגמא - Aldrich</td><td>M4125-1KG</td><td></td></tr><tr><td>סיגמא מים נטולי יונים</td><td>- Aldrich</td><td>38796</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>H3375-500G</td><td></td></tr><tr><td>השתמש ליצירת מצעי בידוד מיטוכונדריה: 220 מ"מ מניטול, 70 מ"מ סוכרוז, 20 מ"מ HEPES, 20 מ"מ Tris-HCl, 1 מ"מ EDTA, ו-0.1% (w/v) ללא חומצות שומן BSA, &nbsp; pH 7.4 ב-4 מעלות; C, יחזיק מעמד יומיים במקרר</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><חזק>אספקת חמצן מיטוכונדריאלית</חזקה></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><חזקה>ציוד</חזקה></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>הגדרת אוקסיגרף + אלקטרודת חמצן מסוג קלארק</td><td>Hansatech (PP Systems)</td> משאבת מים מווסתת <td>חום OXY1</td><td></td></tr><tr><td></td><td>MLE2001</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אלקטרודת חמצן מסוג קלארק</td><td>NA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NA Autopipette (1 מ"ל)</td> <td>קול פארמר</td><td>SK-21600-70</td><td>כלול עם Oxy1</td></tr><tr><td>מוט ערבוב מגנטי קטן</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>14-513-95</td><td></td></tr><tr><td>מיקרופיפטה (10 &mu; L)</td> <td>Cole Parmer</td><td>SK-21600-60</td><td></td></tr><tr><td>מד pH</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>חזק>כימיקלים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>סיגמא - Aldrich</td><td>P9333-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>H3375-500G</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>P5655-1KG</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>M1028-100ML</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>E3889-100G</td><td></td></tr><tr><td>השתמש לייצור מדיית צריכת חמצן מיטוכונדריאלית: 120 מ"מ KCL, 5 מ"מ KH2PO4, 5 מ"מ MgCl2, 5 מ"מ Hepes ו-1 מ"מ EGTA, &nbsp; pH 7.4 ב-30 מעלות; C עם 0.3% BSA</td><td></td><td></td><td></td>רוטנון נטול שומן</tr><tr><td>(תמיסה של 4 מ"מ)</td><td>סיגמא - אולדריץ'</td><td>R8875-5G</td><td></td></tr><tr><td>סוקסינט (תמיסה של 1 מ')</td><td>סיגמא - אולדריץ'</td><td>S3674-250G</td><td></td></tr><tr><td>ADP (תמיסה של 100 מ"מ)</td><td>סיגמא - אולדריץ'</td><td>A5285-1G</td><td></td></tr><tr><td>אוליגומיצין (תמיסה של 8 &mu; גרם/מ"ל באתנול)</td><td>סיגמא - Aldrich</td><td>75351</td><td></td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>C2920</td><td></td></tr><tr><td><>חזקפוטנציאל ממברנה מיטוכונדריאלית וכוח מניע פרוטון</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><חזק>ציוד</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TPMP אלקטרודה</td><td>World Precision Instruments.</td><td>DRIREF-2</td><td></td></tr><tr><td><חזק>תמיסות כימיות אינן צריכות להיות טריות אך יש לשמור אותן במקפיא בין ריצות</חזקות></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מלונט (תמיסה של 0.1 מ"מ)</td><td>סיגמא - אולדריץ'</td><td>M1296</td><td></td></tr><tr><td>אוליגומיצין (8 &mu; גרם/מ"ל באתנול), שומרים במקפיא</td><td>סיגמא - Aldrich</td><td>75351</td><td></td></tr><tr><td>ניגריצין (80 ננוגרם/מ"ל באתנול), שומרים במקפיא</td><td>סיגמא - Aldrich</td><td>N7143</td><td></td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>C3920</td><td></td></tr><tr><td>TPMP</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>T200</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת TPMP: 10 מ"מ TPMP, 120 מ"מ KCL, 5 מ"מ Hepes ו-1 מ"מ EGTA, &nbsp; pH 7.4 ב-30 מעלות; C עם 0.3% BSA</td><td></td><td></td><td></td> נטול שומן</tr></tbody></table>

מדידת צריכת החמצן מיטוכונדריאלי הכבד ואת פרוטון הדליפה קינטיקה להעריך נשימה מיטוכונדריאלי ב בקר לחלב הולשטיין

Measuring Liver Mitochondrial Oxygen Consumption and Proton Leak Kinetics to Estimate Mitochondrial Respiration in Holstein Dairy Cattle

צריכת החמצן, פרוטון מניע כוח (PMF) ויש דליפת פרוטון המידות של נשימה מיטוכונדריאלי, או כמה טוב המיטוכונדריה הם מסוגלים להמיר NADH ו FADH ATP. מאז המיטוכונדריה הם גם האתר הראשי עבור השימוש החמצן וחמצון מזין פחמן דו-חמצני ומים, איך ביעילות הם להשתמש בחמצן, מייצרים ATP ישירות מתייחס יעילות חילוף החומרים התזונתיים, דרישות התזונתי של החיה, ו בריאות של החיה. מטרת שיטה זו היא לבחון את הנשימה מיטוכונדריאלי, אשר יכול לשמש כדי לבחון את ההשפעה של תרופות שונות, דיאטות and השפעות סביבתיות על חילוף החומרים מיטוכונדריאלי. התוצאות כוללות צריכת החמצן הנמדדת נשימה התלויים פרוטון (המדינה 3) ומערכת פרוטון הדליפה התלויים נשימה (4 המדינה). היחס של המדינה 4 3 / המדינה נשימה מוגדר יחס בקרת הנשימה (RCR) ולייצג מיטוכונדריאלי יעילות אנרגטית. פרוטון מיטוכונדריאלי הדליפה היא תהליך המאפשר פיזור של פוטנציאל הממברנה מיטוכונדריאלי (MMP) על ידי זרחון חמצוני uncoupling מ- ADP להפחתת היעילות של סינתזת ATP. חמצן ו- TRMP + אלקטרודות רגיש עם מצעים מיטוכונדריאלי, מעכבי שרשרת האלקטרונים תחבורה משמשות למדידת מצב 3 ו- 4 מצב נשימה, ממברנה מיטוכונדריאלי PMF (או פוטנציאל לייצר ATP), דליפת פרוטון. מגבלות לשיטה זו הם כי רקמת הכבד חייבים להיות טריים ככל האפשר, ביופסיות וכל מבחני חייב להתבצע תוך פחות מ 10 h. זה מגביל את מספר דוגמאות אשר ניתן לאסוף ולהשתמש שעובדו על-ידי אדם אחד ביום אחד כדי כ 5. עם זאת, רק 1 גרם של רקמת הכבד נדרש, כך בבעלי חיים גדולים, כגון בקר לחלב, כמות הדגימה הצורך הוא קטן יחסית לגודל כבד, יש מעט זמן ההחלמה הדרוש.

תוצאות חיוביות מציג קינטיקה הדליפה RCR ופרוטון מוצגים בטבלה 1 ו- 15 איור, בהתאמה. ב מחקר7, RCR ו חלבון הדליפה קינטיקה נמדדו ב פרות הולשטיין-70 יום בחלב אחרי הפרות היו הואכלו 1 של 5 רמות שונות של Zn, Cu, Mn במשך 28 ימים. המדינה 4, נשימה מקסימלית הפרוטונים תלויי-דליפה, הייתה נטייה להיות מושפעת צריכת מינרלים Cu, Mn ו- Zn (p &lt; 0.1). מצב 3 נשימה (ATP המרבי מגורה נשימה) ו RCR = מצב 3 / 4 המדינה (בקרת הנשימה יחס) ...

כאן, אנו חולקים שיטות למדידת צריכת החמצן מיטוכונדריאלי, הגדרת המושג של energetics תזונתי, פרוטון הנזילה, הגורם העיקרי של חוסר היעילות בדור מיטוכונדריאלי של ATP. תוצאות אלו יכול להסביר 30% מהאנרגיה שקוע ניצול מזין כדי לעזור להעריך תפקוד מיטוכונדריאלי.

Oxygen consumption, proton motive force (PMF) and proton leak are measurements of mitochondrial respiration, or how well mitochondria are able to convert ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האנרגטיות, כגון בריאות המיטוכונדריאלית, יעילות אנרגטית ושימוש באנרגיה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי צריכת חמצן של מיטוכונדריה מבודדת נמדדת ישירות. אין צורך לתקן את התוצאות עבור תהליכים מטבוליים תאיים אחרים.החלטנו לראשונה להמשיך בשיטה זו בבקר חלב כשרצינו לבחון כיצד יעילות המיטוכונדריה משפיעה על יעילות המזון. הדגמת וידאו של שיטה זו היא קריטית כמו השלבים בבידוד המיטוכונדריאלי קשה ללמוד כי הם צריכים להיות עקביים ומדויקים. בהקדם האפשרי לאחר דגימת הכבד מוסר מן הפרה לשטוף את המדגם בתקשורת בידוד המיטוכונדריה כדי להסיר את תאי הדם האדומים.שימוש במספריים מרכך דק את הרקמה לתוך מקור מקורר המכיל מספיק מדיית בידוד כדי לשמור על הרקמה לחה. מעבירים את הכבד הטחון לבקבוקון זכוכית 30 מיליליטר המכיל תקשורת בידוד מיטוכונדריה. הוסף עלה טפלון כי יש אישור של 0.16 מילימטרים וזה כבר דגירה בקרח הומוגנית דגימת הכבד ב 500 סל"ד במשך דקה אחת עם ארבע משיכות לדקה.לאחר מכן, להעביר את homogenate לצינור המכיל תקשורת בידוד מיטוכונדריה ולמקם את זה לתוך מקור ארוז קרח. הומוגני צנטריפוגה ב 500 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. השליכו את גלולת הכדור והעברו את העל-טבעי לצינור צנטריפוגה צונן.צנטריפוגה supernatant וכתוצאה מכך ב 10, 000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות כדי להשיג את גלולת המיטוכונדריה. יש להתריע ולשטוף את גלולה ב-10 מיליליטר של מדיית בידוד מיטוכונדריה עם BSA נטול חומצות שומן. ואז צנטריפוגה ב 8, 100 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.השליכו את העל-טבעי והשקיעו מחדש את גלולת הכדור ב-200 מיקרוליטרים של מדיית בידוד. מניחים את זה על קרח עד מוכן לשימוש עבור צריכת החמצן ואת דליפת פרוטונים מים קינטיים. לקבוע את ריכוז החלבון של ההשעיה גלולה באמצעות ערכת חומצה ביצינצ'ונית לכל הוראות היצרן באמצעות BSA כסטנדרט.תחילה, צור מדיה לצריכת חמצן כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הדגירה את אמצעי צריכת החמצן ב 30 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, להגדיר את תא הנשימה, משאבה ואלקטרודה חמצן עבור מערכת oxygraph על פי הוראות היצרן.ואז למקם מיליליטר אחד של תקשורת צריכת חמצן לתא הנשימה. לאחר מכן מוסיפים 0.35 מיליגרם של חלבון מיטוכונדריאלי לתא. מערבבים במרץ כדי להבטיח כי הפתרון הופך רווי באוויר ולשמור על טמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס.תקליט את צריכת החמצן במשך כחמש דקות. כאשר צריכת החמצן הופכת קבועה המיוצגת על ידי קו ישר יורד, רשום זאת כצריכת החמצן הבסיסית. הוסף 1.25 microliters של פתרון רוטנון ארבעה מילימולר כדי לעכב אחד מורכב, ולאחר מכן להוסיף חמישה microliters של פתרון אחד succinate טוחן כדי להגיע לריכוז סופי של חמישה סוצ'ילרים succinate בתא הנשימה.זוהי צריכת חמצן IV המדינה. לאחר מכן, להוסיף מיקרוליטר אחד של פתרון ADP 100 מילימולר כדי להגיע לריכוז סופי של 100 micromolar בתא הנשימה. צריכת החמצן תרד למשך כחמש דקות ולאחר מכן תהפוך לקו ישר.רשום את צריכת החמצן הזו כנשימה השלישית. חשב את יחס בקרת הנשימה כמפורט בפרוטוקול הטקסט. ואז לשאוף את כל הפתרונות מתוך תא הנשימה.שוטפים את התא מספר פעמים במים כפולים. ראשית, להכין פתרון של 80 ננוגרם למיליליטר של ניז'רין באתנול הגבלת כמות האתנול הוסיף פחות ממיקרוליטר אחד. כמו כן, להכין פתרון של שמונה מיקרוגרם לכל אוליגומיצין מיליליטר באתנול.לאחר שטיפה יסודית של התא במים כפולים, מניחים מיליליטר אחד של מדיית צריכת החמצן בתא הנשימה ומערבבים במרץ עם בר ערבוב מגנטי. מוסיפים 0.35 מיליגרם חלבון מיטוכונדריאלי לתא הנשימה. הוסף אלקטרודה רגישה למתיל טריפנילפוספוניום למערך התאים כדי לוודא שהצד השני מחובר כראוי למטר pH.הוסף 1.25 microliters של פתרון רוטנונה ארבעה מילימולר לעכב I.Record מורכב הנשימה במשך שתיים עד חמש דקות. רשום את ערך צריכת החמצן כאשר הוא הופך קבוע. לאחר מכן, להוסיף 0.56 microliters של פתרון אוליגומיצין כדי לעכב ניצול ADP.הקלט את הנשימה במשך כשתיים עד חמש דקות. רשום את ערך צריכת החמצן כאשר הוא הופך קבוע. לאחר מכן להוסיף 0.112 microliters של 80 ננוגרם לכל פתרון ניז'רין מיליליטר כדי לבטל את שיפוע ה- pH על פני הממברנה הפנימית המיטוכונדריאלית.הקלט נשימה במשך שתיים עד חמש דקות ושים לב לערך צריכת החמצן כאשר הוא הופך קבוע. הוסף חמישה microliters של 10 מילימולר מתיל טריפנילפוספוניום פתרון הדגירה המיטוכונדריאלית כדי להתחיל להכין עקומה סטנדרטית. חזור על תוספת זו ארבע פעמים נוספות עד ריכוז כולל של 2.5.מיקרומולר נוסף. לאחר מכן, להוסיף חמישה microliters של פתרון אחד לחות succinate לתא ליזום נשימה. הקלט את הנשימה עד להשגת עקבות יציבות.לאחר מכן הוסף מלונט כדי להפוך את המערכת כמפורט בפרוטוקול הטקסט. במחקר זה, RCR ו קינטיקה דליפת פרוטון נמדדים בחלב של פרות חולבות הולשטיין 70 ימים לאחר פרות חלב הוזנו עם רמות שונות של נחושת, אבץ, מנגן במשך 28 ימים. המדינה הרביעית הנשימה נתפסת להיות הגבוה ביותר בפרות נתון רמות נמוכות של מנגן, עדיין הוא הנמוך ביותר בפרות שליטה, המציין כי מנגן ממלא תפקיד חשוב במזעור נשימה תלויי דליפת פרוטון.ניתוח הנשימה תלוית דליפת הפרוטון בלחץ דם מגלה כי נשימה זו היא הגדולה ביותר בפרות שטופלו במנגן נמוך, והנמוך ביותר בפרות שליטה. תוצאות אלה מאשרות כי הקבוצה מנגן נמוך יש את המדינה הגדולה ביותר IV נשימה בעוד קבוצת הביקורת יש את הנמוך ביותר. בעוד יעילות ההזנה גבוהה יותר בהיגוי אנגוס שנולדו שוורים RFI נמוך מאשר שוורים גבוהים RFI, זה לא בא לידי ביטוי RCR המיטוכונדריאלי או קינטיקה דליפת פרוטון.בעת ביצוע הליך זה חשוב לשמור את כל הבקבוקונים והבקבוקונים על הקרח תוך עיבוד המיטוכונדריה. לאחר התפתחותה טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום תזונת החלב לחקור את התפקיד של יעילות המיטוכונדריה ביעילות ההזנה ותפקוד המיטוכונדריאלי בכבד. אל תשכח כי עבודה עם רוטנונה יכול להיות מסוכן, אמצעי זהירות כגון לבישת כפפות, הגנה על העיניים PPE הנכון תמיד צריך להילקח בעת ביצוע הליך זה.

measuring-liver-mitochondrial-oxygen-consumption-proton-leak-kinetics

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

מקור:אלטרה ליאו1, לואיזה קרדוסו1, סבין שמיט1, אריך גניגר11אורובורוס אינסטרומנטססרטון זה מסביר כיצד שטף החמצן משמש להערכת נשימה מיטוכונדריאלית בתאי יונקים חיים וחדירים. הוא מדגים את השימוש הרציף בדיגיטונין, סובסטרטים מטבוליים, ADP, מצמד ומעכב לאפיון מצבי נשימה שונים. פרופיל שטף החמצן המתקבל חושף את תפקוד המיטוכונדריה ויעילות צימוד האנרגיה בתנאים מוגדרים.

מדידות שטף חמצן להערכת נשימה מיטוכונדריאלית בתאים חיים וחדירים

השיטות המוצגות מספקות הוראות שלב אחר שלב לביצוע אוסף של בדיקות ספירומטריות מבוססות מיקרו-צלחת באמצעות מיטוכונדריה מבודדת מכמויות מינימליות של שרירי שלד עכבר. מבחנים אלה מסוגלים למדוד שינויים/התאמות מכניסטיות בצריכת החמצן המיטוכונדריאלית במודל נפוץ של בעלי חיים.

באמצעות מבודד המיטוכונדריה מכמויות מינימליות של שרירי שלד עכבר למדידות נשימה microplate תפוקה הגבוה

respirometry ברזולוציה גבוהה משמש לקביעת צריכת חמצן המיטוכונדריה. זוהי טכניקה פשוטה כדי לקבוע מתחמי שרשרת הנשימה במיטוכונדריה '(I-IV) מחירי נשימה, קיבולת מערכת תחבורת אלקטרון מקסימלי המיטוכונדריה, ויושרת הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה.

ברזולוציה גבוהה Respirometry להעריך תפקוד מיטוכונדריאלי permeabilized ו תאים שלמים

בנייר זה, מתוארת שיטה למדידת צריכת החמצן באמצעות respirometry ברזולוציה גבוהה ב- thoraxes permeabilized של דרוזופילה. טכניקה זו דורשת כמות מזערית של רקמות לעומת הטכניקה בידוד מיטוכונדריאלי קלאסי, התוצאות המתקבלות רלוונטיים יותר מבחינה פיזיולוגית.

מדידה של צריכת חמצן מיטוכונדריאלי של סיבי Permeabilized דרוזופילה באמצעות כמויות מינימליות של רקמות

תכננו ובנינו מעבדה ניידת למדידת קצב הנשימה במיטוכונדריה מבודדת של חיות בר שנלכדו בשדות. כאן, אנו מתארים את העיצוב וההתאמה של מעבדה מיטוכונדריאלית ניידת ואת פרוטוקולי המעבדה הקשורים.

פיתוח מעבדה ניידת לפיזיולוגיה מיטוכונדריאלית למדידת אנרגיה מיטוכונדריאלית בתחום

נשימה ברזולוציה גבוהה המוצמדת לחיישנים פלואורסצנטיים קובעת את צריכת החמצן המיטוכונדריה ואת ייצור מיני החמצן הריאקטיבי (ROS). הפרוטוקול הנוכחי מתאר טכניקה להערכת שיעורי הנשימה המיטוכונדריאליים וייצור ROS בעצב הסיאטי החודר.

הערכת תפקוד המיטוכונדריה בעצב הסיאטי על ידי נשימה ברזולוציה גבוהה

אנו מתארים פרוטוקולים הדרגתיים המודדים את הנשימה המיטוכונדריאלית של נויטרופילים עכבריים ואנושיים ותאי HL60 באמצעות מנתח שטף חוץ-תאי מטבולי.

מדידה בזמן אמת של הפרופיל הביו-אנרגטי המיטוכונדריאלי של נויטרופילים

לסוסים יש יכולת פעילות אירובית יוצאת דופן, מה שהופך את שרירי השלד של הסוסים לרקמה חשובה הן לחקר הפיזיולוגיה של פעילות גופנית של סוסים והן לפיזיולוגיה של המיטוכונדריה של יונקים. מאמר זה מתאר טכניקות להערכה מקיפה של תפקוד המיטוכונדריה בשרירי השלד של סוסים.

פלואורו-רספירומטריה ברזולוציה גבוהה של שרירי השלד של סוסים

במאמר זה אנו מציגים אוסף של בדיקות למדידה ישירה של תפקוד המיטוכונדריה בתאי יונקים ללא תלות ביכולתם לצרוך חמצן מולקולרי.

בדיקות שאינן תלויות בחמצן למדידת תפקוד המיטוכונדריה ביונקים

במאמר זה אנו מתארים שיטה מקיפה למדידת זרחן חמצוני מיטוכונדריאלי בסיבי שריר שלד טריים משריר אדם או עכבר. שיטה זו מאפשרת כימות בזמן אמת של נשימה מיטוכונדריאלית והערכת העדפת דלק וגמישות מטבולית תוך שמירה על רשתות מיטוכונדריאליות קיימות ושלמות הממברנה.

מדידת נשימה מיטוכונדריאלית בסיבי שרירי שלד של בני אדם ועכבר על ידי ספירומטריה ברזולוציה גבוהה

חקור מדידת צריכת חמצן מיטוכונדריאלי בכבד וקינטיקת דליפת פרוטונים להערכת נשימה מיטוכונדריאלית בפרות חולשטיין. שיטה זו מאפשרת למדענים לחקור יעילות אנרגטית ובריאות מיטוכונדריאלית.

מדידת צריכת החמצן מיטוכונדריאלי הכבד ואת פרוטון הדליפה קינטיקה להעריך נשימה מיטוכונדריאלי ב בקר לחלב הולשטיין

גלה סרטונים נוספים