ראמאן תהודה משופרת השטח פיזור Nanoprobe Ratiometry לגילוי סרטן השחלות מיקרוסקופיים באמצעות חומצה פולית קולטן מיקוד

סרטן השחלות טפסים גרורות לאורך כל חלל הצפק. כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי להפוך, שימוש חומצה פולית-קולטן ממוקד תהודה משופרת משטח nanoprobes פיזור ראמאן לגלות נגעים עם ירידה לפרטים גבוהה באמצעות הדמיה רציומטרי. Nanoprobes מנוהלים intraperitoneally חי לעכברים, הדימויים נגזר לתאם עם היסטולוגיה.

שיטה זו מעסיקה יישום אקטואלי של חלקיקים כדי תמונה גידולים מיקרוסקופיים, במיוחד ממאירות כי עדיין אין גישה כלי הדם, כגון גרורות של סרטן השחלות. טכניקה זו היא יחסמטרי, הדמיה ממוקדת חלקיקים לא ממוקדים בסריקה אחת כדי להפחית אותות שווא ולחשוף את ההיקף האמיתי של הגידול. חלקיקים אלה יכולים להינתן על ידי הזרקה תוך-לידתית או תוך ורדי עבור הדמיה דיוק גבוה של סרטן השחלות וסוגי גידולים רבים אחרים.

עבור סינתזת ליבת ננו-סטאר זהב מניחים בקבוק חרוט המכיל 800 מיליליטר של תווי חומצה אסקורבית טריים המוכנים על צלחת ערבוב מגנטית בארבע מעלות צלזיוס וגורמים למערבולת יציבה. הוסיפו במהירות שמונה מיליליטר של תוסף חומצה טטריכלורואורית טרי למערבולת. בתוך שניות ננו-כוכבים ייוושו והפתרון יניח צבע כחול כהה.

יוצקים את ההשעיה ננו-כוכב לתוך צינורות חרוט 50 מיליליטר עבור צנטריפוגה ולשאוף את כל אבל האחרון 200 microliters של supernatant מכל צינור בסוף הספין. השתמש micropipette כדי resuspend חלקיקים בכל צינור לפני בריכת כל חלקיקים בקלטת דיאליזה אחת. ואז דיאליזה חלקיקים לפחות שלושה ימים נגד שני ליטרים של מים deionized שינוי המים מדי יום.

עבור היווצרות מעטפת סיליקה, תחילה להוסיף 10 מיליליטר של isopropanol, 500 microliters של TEOS, 200 microliters של מים deionized, ו 60 microliters של צבע לצינור חרוט 50 מיליליטר. ותוסיף שלושה מיליליטר של אתנול, ו-200 מיקרוליטר של אמוניום הידרוקסיד לצינור של 15 מיליליטר. לאחר מכן, sonicate ננו-כוכבים דיאליזה לפזר את כל האשכולות ולהוסיף 1.2 מיליליטר של nanostars לצינור.

מניחים את הצינור 50 מיליליטר על מערבל מערבולת ו לגרום מערבולת יציבה. הוסף במהירות את פתרון כוכב הננו לצינור 50 מיליליטר עם כחמש שניות נוספות של ערבוב לפני העברת הצינור במהירות לשייקר במשך 15 דקות ב 300 סל"ד בטמפרטורת החדר. שני הצינורות חייבים להיות משולבים במהירות ותחת nixing מתמיד כדי להבטיח כי תגובת silication קורה על nanostars כדי למזער את ייצור סיליקה חינם.

בסוף הדגירה למלא את הצינור עם אתנול כדי להרווה את התגובה ולאסוף את nanostars על ידי צנטריפוגה. שאף את כל אבל על 500 microliters האחרונים של supernatant דואג לא להפריע גלולה ולתלות מחדש את חלקיקים במיליליטר אחד של אתנול טרי. ואז להעביר את הפתרון צינור צנטריפוגה 1.5 מיליליטר עבור ארבעה מיליליטר אחד של שטיפות אתנול על ידי צנטריפוגה, resuspending את גלולה על ידי ultrasonication במשך כשנייה אחת בין כל לשטוף.

כדי להציג תיול למשטחי החלקיק, לאחר הכביסה האחרונה תדלוק את גלולה במיליליטר אחד של 85%אתנול, 10%3-mercaptopropyl-trimethoxysilane, ו 5% פתרון מים deionized עבור דגירה של שעה עד שעתיים בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, לשטוף את חלקיקים פונקציונלי thiol על ידי צנטריפוגה כפי שצוין, resuspending את גלולה על ידי ultrasonication בין שטיפות. עבור נוגדן פונקציונלי נגד חומצה פולית קולטן ננו להגיב 200 מיקרוגרם של נוגדן חלבון מחייב אנטי פולאט עם עודף טוחנת פי עשרה של PEG cross-linker ב 500 microliters של מאגר HEPES.

לאחר 30 דקות לרכז את הנוגדן על ידי צנטריפוגה במסנן צנטריפוגלי, שחזור הנוגדן על ידי היפוך המסנן לתוך צינור חדש עבור צנטריפוגה נוספת. לאחר מכן מערבבים את חלקיקי התיול עם הנוגדן המרוכז ומדגירה את התערובת לפחות 30 דקות בטמפרטורת החדר. כדי ליצור גשושי נאנו לא ממוקדים להוסיף חמישה מיליגרם methoxy-הסתיים PEG 5000 maleimide מומס ב- DMSO כדי חלקיקים פונקציונליים תיול ב 500 microliters של מאגר HEPES עבור דגירה לפחות 30 דקות בטמפרטורת החדר.

להזרקת גשושי נאנו, יש לסובב את שני הטעמים של גשושי הנאנו ולתלות מחדש את הכדורים במאגר MES טרי בריכוז של 600 פיקומולרים. מערבבים את הננו-חלקיקים ועומסים מיליליטר אחד של הפתרון שנוצר למזרק אחד של מיליליטר המצויד במחט של 26 מד לכל עכבר ומזריקים את כל עוצמת הקול לתוך הבטן של כל עכבר. לאחר מכן לעסות בעדינות את הבטן כדי להפיץ את חלקיקים לאורך חלל הלידה.

לאחר 25 דקות לפחות לאבטח את הגפיים של בעל חיים מוזרק המתת יתד על פלטפורמה כירורגית ולהשתמש מדפים משוננים ומספריים ניתוח כדי להסיר את העור כדי לחשוף את peritoneum. חגר את ההצבה. חבר את המדפים צפי לפלטפורמה ולשטוף את החלק הפנימי של חלל צפי עם לפחות 60 מיליליטר של PBS.

לאחר מכן העבר את הפלטפורמה לספקטרופוטומטר אמן עם תצורה אופטית זקופה ושלב ממונע ותמונה הבטן תחת פרמטרי ההדמיה המתאימים. זה חיוני כי מישור מוקד לסריקת Raman הוא על פני השטח של רוב הקרביים. אם האיברים יצאו מהמטוס, האות הנרכש לא יהיה שימושי.

למטרות בקרת איכות ניתן לאפיין את הננו-חלקיקים במגוון שיטות במהלך תהליך הסינתזה, כולל מיקרוסקופ אלקטרוני שידור, פיזור אור דינמי, ניתוח מעקב חלקיקים וספקטרוסקופיה סופגת אולטרה סגולה גלויה. מדידות ראמאן חושפות את נוכחות הספקטרום הייחודי של כל טעם של ננו-חלקיק לאורך הסינתזה. תשואות תגובה וריכוזים אופייניים תלויים מאוד בטכניקת הצינור במהלך שלבי הכביסה.

ספקטרום אמן יכול להיות מעובד כדי להסיר את הפלואורסצנטיות מנורמל לאזור היחידה כדי לפצות על עוצמת האות לפני החלת הריבועים הקלאסיים לפחות. למרות הציונים הקלאסיים הכי פחות בריבוע על כל ספקטרום התייחסות גשושית לא בנפרד מספקים את המיקומים הספציפיים של הגידולים, היחסים נקודתיים לחשוף את נוכחותו של התפשטות מיקרוסקופית מופץ. בעת ניסיון הליך זה חשוב לזכור לאמת את חלקיקים בכל שלב של הסינתזה כמו איכות הננו חלקיקים משפיע מאוד על התוצאות הסופיות.

טכניקה זו מדגימה את הפוטנציאל של חוקרים להשתמש בגשושי נאנו SERRS לגילוי סמנים הקשורים לגידולים במודלים של בעלי חיים ורקמות מטופלים סחוות עם רמה גבוהה של דיוק מיקרוסקופי.