זיהוי ואפיון היסטולוגית, דיסקציה של האונות הערמונית עכבר במודלים תרבות חוץ גופית ספרואיד תלת-ממד

שיטה זו יכולה לעזור בתחילת מודלים עכבר מהונדסים גנטית של סרטן הערמונית וחקירה של מנגנון סרטן הערמונית באמצעות in vivo וניתוח במבחנה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת ניתוח מלא של מודל העכבר סרטן הערמונית, כל הדרך מניתוח רקמות לבידוד תאים ו culturing. לאחר חשיפת מערכת urogenital, או UGS, בחוזקה לתפוס את שלפוחית השתן עם מטלחים קהה בינוני, ולהרים את המערכת כולה מהבטן העכבר.

החלק זוג מספריים מתחת לשלפוחית השתן והערמונית כל הדרך אל עמוד השדרה כדי לבצע חתך דרך חוט השדרה, וחתוך דרך כל הקשרים הנותרים לחלל הבטן כדי לאפשר הסרה של UGS כולו. מעבירים את ה-UGS לצלחת פטרי באורך שישה ס"מ המכילה שניים עד שישה מיליליטר של PBS תחת מיקרוסקופ ניתוח. ולהשתמש בזוג מטלפים עדין ומספריים microdissection כדי לנקות בזהירות את כל השומן משני הצדדים הגביים הגחוניים של מערכת הרקמה מבלי לחיתוך כל רקמת הערמונית.

כאשר כל השומן הוסר, למשוך את שלפוחית השתן עם מלקחים בלו שלפוחית השתן בבסיסו. מניחים את הצד הגחון רקמה הנותרים למעלה ומחזיק צינור אחד מסתיים עם מלקחיים, בצע את הכלי לבסיס שלה עם מספריים ובלה את הכלי בבסיסו. הסר את אותו כלי בצד השני ולהכניס את המדפים בין ורידים מהותיים הערמונית כדי לאפשר חיתוך של כל רקמת חיבור סמוכה לפי הצורך.

לאחר מכן עקבו אחר הנוצים החשובים לבסיסם בשופכה והוציאו את כלי הדם מבלי לנקב אותם. כאשר שני הווסתים הוסרו, מניחים את הצד הגבי של הרקמה למעלה כך האונות הגביות הדומות כנפי פרפר גלויים. מחזיק כל אונה הגבית עם מדפים, לחתוך את הרקמה בבסיס שלה עם מספריים כדי לאסוף את האונות הגביות ולהפוך את הרקמה לצד הגחוני.

לאסוף את האונות הצדדיות, שהם קטנים ובדרך כלל לעטוף את השופכה בצד והם תקועים בין האונות הקדמיות, הגחון, הגב באותו אופן. לאסוף את האונות הגחון, אשר גדולים יותר האונות הרוחביות לשכב על השופכה גחון. ואז לחתוך ולהשליך את השופכה כדי לקצור את האונות הקדמיות.

כדי לעבד את רקמת הערמונית לתרבות תלת-מימדית, מעבירים את האונות לתבשיל באורך 10 ס"מ המכיל שניים עד שלושה מיליליטר של DMEM, ולהשתמש באזמל כדי לטחון את צינוריות הערמונית בצורה דקה ושקולה ככל האפשר. מעבירים את שברי הרקמה למכסה המנוע של תרבות הרקמה הסטרילית ומוסיפים את ת פתרון הרקמה לצינור חדש של 15 מיליליטר. הביאו את הנפח בצינור עד תשעה מיליליטר עם מדיום טרי, ומוסיפים מיליליטר אחד של פתרון מלאי קולגנס TenX לתערובת הרקמה.

לאחר המערבולת, דגירה הצינור עם רועד במשך שעתיים ב 37 מעלות צלזיוס כדי להשפיל את מטריצה חוץ תאית. בסוף הדגירה, לאסוף את הרקמה על ידי צנטריפוגה מחדש להשעות את גלולה בשני מיליליטר של חם 05% רצועות EDTA. לאחר חמש דקות של 37 מעלות צלזיוס כדי להקל על ההיצמדות מתא לתא ותא למטריצה, השתמש ראש צינור P1000 עם קצה לוח רחב כדי triturate הרקמה שמונה עד 10 פעמים כדי לשבור את כל הגושים.

חזור על הדיסוציאציה עם קצה ראש צינור P200. ואז לנטרל את טריפסין עם שלושה מיליליטר של מדיום שלם. מערבבים 500 יחידות של DNASE1 לתוך תרחיף הרקמה ולהעביר את הפתרון חמש עד 10 פעמים דרך מזרק חמישה מיליליטר מצויד מחט 18 מד, ואחריו חמש פעמים דרך מחט 20 מד.

כאשר לא נראים עוד חתיכות רקמה גדולות, מסננים את ההשעיה דרך מסנן של 40 מיקרומטר לצינור חרוטי של 50 מיליליטר, ואוסף את התאים באמצעות צנטריפוגה. עבור ציפוי תאים ותרבות, להשעות מחדש את גלולה ב 0.5 מיליליטר של מדיום צמיחת תא אפיתל הערמונית מלאה, ולהרומז על התאים חמש פעמים 10 לתאים החמישי למיליליטר של ריכוז בינוני צמיחת תא אפיתל הערמונית. מערבבים את התאים עם מטריצה חוץ תאית קרום מרתף בנפח של שניים עד שלושה נפח של יחס פתרון, צלחת המתלה התא במיכל תא הניסוי המתאים.

ואז למקם את התאים באינקובטור תרבות התא במשך 30 דקות. כאשר המטריצה החוץ-תאית התגבשה, מכסים את התרבות עם מדיום גידול תאי אפיתל מלא מחומם מראש של הערמונית, דואגים לא להפריע לתקע המטריצה החוץ-תאית של קרום המרתף. ואז להחזיר את התאים לאנקובטור תרבות התא במשך חמישה עד 10 ימים, מרענן מחצית המדיום כל יומיים עד שלושה ימים.

כדי לקצור כדורים, שאפו את המדיום בזהירות מבלי להפריע לתקע ג'ל מטריצה חוץ-תאית של קרום המרתף, והוסיפו מיליליטר אחד של פתרון Disbase עבור 100 מיקרוליטרים של מטריצה חוץ-תאית של קרום מרתף. באמצעות מגרד תא, לגרד לאורך החלק התחתון של הצלחת כדי להרים את ג'לים חוץ תאיים קרום המרתף מתחתית הצלחת לתוך supernatant, צינור את הפתרון כולו פעם אחת כדי לשבור את התקע לחתיכות קטנות יותר. חדירה את חתיכות מטריצה הסלולר הנוסף באינקובטור תרבות התא במשך שעה עד שעתיים עד מטריצה חוץ תאית קרום המרתף נמס לחלוטין.

ואז להעביר את ההשעיה התא לצינור 15 מיליליטר. ולאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה למניפולציה במורד הזרם. ערמונית העכבר מורכבת מארבעה זוגות של אונות הממוקמות באופן דורסי ומאוורר לווסיקלים והשופכה החשובים.

האונות הערמונית מורכבות פרופילי בלוטה מרובים, כל אחד מורכב לומן, מוקף בתאי אפיתל הפרשה. צורות האונות, ארגון התאים ואופי הפרשתן משתנים בין האונה לאונה. תאי הערמונית המבודדים מתחילים לגדול לאברנואידים כבר ארבעה ימים לאחר תרבות המטריצה החוץ-תאית של קרום המרתף.

במהלך הימים עד ששת הימים הבאים, רוב התאים גדלים לכדורים מוצקים עם שבריר מהעולמות המציגים לומן חלקי או מלא. הספרואידים גם מדגימים כתם בטא קטנין חזק בצמתים התא לתא כי במשותף לוקליזציה עם כתמי F-actin. בעת ניסיון הליך זה, חשוב מאוד לעקוב בקפדנות אחר שלבי המיקרו-דיסקטוריה.

לדוגמה, לבודד את האונות הערמונית בזמן שהם עדיין מחוברים השופכה, כך שאתה יודע איזו אונה היא אשר מבוסס על איפה הם ביחס השופכה. בעקבות הליך הניתוח, האונות המבודדות יכולות לשמש לניתוח במורד הזרם, כגון רצף RMA, כתמים מערביים או כשל חיסוני. טכניקת התרבות הראשונית 3D מאפשר לך לקבל תובנות נוספות לתוך מנגנון סרטן הערמונית, כי אתה יכול לפקח על החיים עם כדוריות עבור מורפולוגיה ושינויים בהתנהגות ולזהות כל שינויים neoplastic באותו.

לסיכום, זה ניתוח הערמונית ושיטות תרבות יכול להיות משולב יישומים שונים במורד הזרם כדי לספק מידע רב ערך לחקר המנגנון של סרטן הערמונית באמצעות מודלים עכבר מהונדסים גנטית.