Lentiviral בתיווך וקטור ריפוי גנטי של Hepatocytes לשעבר Vivo עבור השתלת עצמיים של החזירים

פרוטוקול זה נועד לתאר hepatocyte חזירי בידוד ו- ex-vivo המסירה הגן כדי לרפא את הדגמים של מחלות מטבוליות באמצעות השתלת תאים עצמיים. אף על פי המודל הזה נהנה יתרונות ייחודיים לטובת טיפול מוצלח, היישום הוא בסיס רלוונטי להתייחס אינדיקציות ומחלות נוספות.

ריפוי גנטי אקס ויוו והשתלת תאים אוטולוגיים לטיפול בשגיאות מולדות של חילוף החומרים בכבד היא חלופה חשובה לטיפול בהפרעות אלה. ומאפשר לנו לא רק לטפל בהפרעות אלה, אבל להבין את הביומסה הדרושה כדי להיות מסוגל להשיג תוצאה טיפולית. גישה זו גם מונעת את ההשלכות המשמעותיות של דיכוי המערכת החיסון והשלכות אחרות עם סוגים שונים של טיפולים.

בהקשר הנוכחי, אנו משתמשים בגישה זו לטיפול טירוסינמיה תורשתית מסוג 1. עם זאת, הרעיון הוא כי זו תהיה גישה פלטפורמה לטיפול שפע של מחלות כבד שונות עם שינוי מינימלי. חשוב להיות מסוגל לדמיין טכניקה זו כי יש כמה שונות כשמדובר לדמיין את היעילות של חיסון, אשר חיוני כדי לקבל hepatocytes קיימא להשתלה.

הליך כירורגי שבוצע על ידי רוברט קייזר וג'וזף לילגרד. בידוד תאים בביצוע זג'י דו, ברוס אמיוט. טיהור תא UAU ו ex vivo transduction של התאים נעשה על ידי קייטלין VanLith.

הכנת בעלי החיים והכנת OR נעשתה על ידי קארי אלן ולורי הילין. כדי לבצע את הכניסה הראשונית לאתר הנמל, בצעו צפלאד טכניקת חסון פתוחה לטבילה של חזיר חווה הרדמה, בן עד שלושה חודשים, גדול ולבן. היכרות עם 12 מילימטר trocar לתוך חלל הבטן, שבו peritoneum גלוי.

כאשר trocar הוא במקום, לעבור 5 מילימטר 30 מעלות היקף דרך יציאת הכניסה ולנפח את הבטן עם פחמן דו חמצני ל 15 מילימטרים של כספית. תחת הדמיה ישירה עם המצלמה לפרוסקופית, מקום 2 יציאות נוספות 5 מילימטר, טריאנגולציה על האונה השמאלית של הכבד. ולמקום את לפרוסקופ באחד הנמלים החדשים.

זהה את החלק הרוחבי השמאלי של הכבד בנקודה של סדק מרכזי של האונה השמאלית המפרידה בין הקטעים המדיאליים והשמאליים. ולהשתמש שדכן כירורגי כדי לאבטח את מבני כלי הדם ואת וריד הדם לאורך סדק זה. חוצים את הפרנצ'ימה דרך הסקור הזה באמצעות ירי רציף ועומסי כלי דם באורך 60, 45 או 30 מילימטר.

כאשר החלקה הושלמה, להעריך את הכבד קרן כדי להבטיח כבד נאותה ולהשתמש תופס אנדוסקופי שקית אחזור רקמה אנדוסקופית כדי לאחזר את החלק הכבד. עכשיו, להסיר את היציאות ולהשתמש תפר בגודל אפס בגודל מופרע עבור fascia קו האמצע. תפר ריצה 2-0 לשכבה העורית העמוקה.

ותפר פועל 4-0 לשכבה התת עורית, כדי לסגור את חתך היציאה 12 מילימטר בשלוש השכבות. לאחר מכן סגור את חמש היציאות מילימטר בשכבה אחת עם 2-0 תפרים. ושים רוטב סטרילי על החתכים.

לבידוד hepatocyte, ראשית לחבר משאבה פריסטואלית להגדיר כדי לספק את פתרונות הפיזור, מתוחזק באמבט מים 43 מעלות צלזיוס, לקטטרים להיות ממוקם בכלי הגדול, חשוף של החלק הכבד. ראש המשאבה צינורות עם פתרון תדלוק 2, עד עמדת תקע כדי לעבור בין תדלוק אחד חינם שתי פתרון משלוח לרקמה. ולהחליף את התרנגוק לעצור לתחנה אחת תחליף.

ואז ראש שאר סט צינורות. ממלא לחלוטין מלכודת בועה מוטבעת כדי למנוע החדרת בועות אוויר לתוך הרקמה. לאחר מכן, לעשות חתך רוחבי נקי, בניצב למחזור הדם כדי לחשוף חתכים של ענפי וריד הפורטל ואת ורידים בהיפול לצנתור.

ולהשתמש קטטר הולם נוח כדי לצנתר את הזמינות, ורידים חשופים. כאשר הקטטרים נמצאים במקום, לבלבל את רקמת הכבד המפוצלת עם תוספת חמה פתרון אחד בקצב זרימה של 100 מילימטר לדקה. מעבירים את צינור השקע מוריד לווריד כל 30 עד 60 שניות.

ושימוש בצינור פינוי כדי להסיר חיץ עודף ממגש הרקמות. לאחר רכיבה על אופניים דרך כל ורידים זמינים במשך 15 עד 20 דקות, לעבור תסות תרכובת שתיים באותם תנאים. שימוש במשאבת החזרה כדי למחזר את הפתרון תדלוק שני בחזרה למאגר, בקצב זרימה איטי יותר, עבור ניהול מחדש לתוך הרקמה.

בדוק את טמפרטורת פני השטח של מלכודת הבועה, או הכבד על כל חמש דקות כדי לאשר כי hepatocytes לא מתקררים. כאשר הכבד blanches לאחר כ 30 דקות של חיסון, להעביר את הרקמה למיכל סטרילי, עטוף וילון סטרילי, ולה מניחים את המיכל לתוך מכסה המנוע של תרבות התא כדי לשמור על סטריליות במהלך עיבוד hepatocyte. בידוד הקולגנס של hepatocytes ו ניתוק התא צריך להיעשות לחלוטין, כך שאתה לא מקבל גושים של התאים אשר מקטין את הכדאיות של התאים ואת תדירות ההעתקה.

להטביע את הכבד עם hepatocyte לשטוף בינוני ולגרור מספריים על פני החלק העליון של הרקמה כדי לשבש את קפסולת הכבד. לובש כפפות סטריליות, בעדינות לעסות את הכבד כדי לשחרר את hepatocytes לתוך המדיום. ולסנן את הרקמה על-טבעית, דרך גזה סטרילית, לתוך בקבוקי צנטריפוגה של 200 מיליליטר.

לאסוף את hepatocytes מסונן על ידי צנטריפוגה. בריכת התאים ב 150 מיליליטר של hepatocyte טרי לשטוף בינוני לתוך בקבוק יחיד 200 מיליליטר עבור 2 שטיפות נוספות. וספירת התאים לאחר הצנטריפוגה השלישית.

לאחר מכן, לדלל את התאים ל 1 פעמים 10 כדי hepatocytes התשיעי לכל ריכוז מלוחים מיליליטר. עבור autotransplantation של hepatocytes מבודד, להשתמש במתמר 2-5 מגה הרץ כדי לזהות את וריד הפורטל באמצעות אולטרסאונד ולכוון מחט חמישה אינץ ', 18-מד לכיוון הוורידי הפורטל הראשי, בקירוב זה bifurcation. לטעון את התאים לתוך מזרק 60 מיליליטר, על פי נפח התא הכולל לצרף את המזרק למחט, דואג לא להציג בועות.

לאחר מכן, לאט לדכא את הבוכנה מזרק להחדיר באופן ידני עד 1 10 כדי hepatocytes התשיעי דרך וריד הפורטל באמצעות קטטר עירוי כדי לפקח על הלחץ הנקבובי במהלך ההשתלה. כאשר כל התאים נמסרו, להסיר את קטטר ולפקח על וריד הפורטל לנוכחות של אירועים תרומבוטיים וזרימה קדימה על ידי אולטרסאונד. בקבוצה מייצגת של חמישה חזירים, שעברו כריתה בהיפוק, לרובם היו תשואות של יותר מ-10 עד ההפטוציטים התשיעיים עם כ-80% כדאיות.

מתן מספר מספיק של תאים עבור כל סוג של מניפולציה רצויה, כולל ריפוי גנטי. התרבות שלאחר מכן של החלק הלא מושתל של hepatocytes מוכן אלה, הפגין כדאיות טובה הידבקות עם מורפולוגיה hepatocyte טיפוסי 46 שעות לאחר ההעתקה שלהם ציפוי ראשוני. חריטה ראשונית תשתנה בהתאם למספר התאים שהוצתו מחדש במהלך ההשתלה.

ביופסיות מייצגות אלה מדגימות ציר זמן של הרחבת תאים מתוקנים בגנים. ייחודי למחלות, כגון טירוסינמיה תורשתית מסוג 1, שנהנות מלחץ נבחר חיובי לתאים בריאים. הרחבה זו הושלמה בדרך כלל 12 חודשים לאחר ההשתלה.

לאחר חיית נוקאאוט fumarylacetoacetate מושתלת השיגה כ -20% אוכלוסייה מחדש של hepatocytes מתוקן בתוך הכבד, רמות טירוסין יהיה לנרמל בהשוואה לבעלי חיים מסוג בר. בעוד שבעלי חיים לא מגובים מפגינים עלייה משמעותית הן בפוספטאז אלקליין והן בטרנסאמינאז אספרטט בהשוואה לבעלי חיים מסוג בר, ריפוי גנטי אקס ויוו מחזיר את רמות אנזימי הסרום האלה לנורמליות. יתר על כן, בריאות חילוף החומרים הכללית בכבד משובשת חזירי נוקאאוט מטופלים, כפי שצוין על ידי הגבהים באמוניה במחזור כי הם תוקנו לאחר אוכלוסייה מחדש עם hepatocytes מטופלים.

חשוב לזכור עם שימוש בטכניקה זו כדי לטפל ולתפעל את הרקמה בזהירות ומעט ככל האפשר. טיפול מוגבר או מניפולציה של הרקמה, מוביל להקטין את הכדאיות של התאים ולהקטין את התשואה. גישה זו יכולה להיות ישימה גם עבור אנשים המעוניינים ללמוד הפצת קשת וחוסר יעילות בגרף בטכניקות תיוג, באמצעות טכניקות אחרות מחוץ לפרוטוקולי ההשתנה הנגיפיים.

אל תשכח כי עבודה עם וקטורים ויראליים יכול להיות מסוכן, ולכן בעקבות נהלי בטיחות ביו נאותים, כמו גם ללבוש ציוד מגן אישי יש צורך בעת שימוש בטכניקות אלה.