Name: טיהור של Trypanosomes חוץ-תאית, כולל אפריקה, מן הדם על ידי אניון-מחליפי (Diethylaminoethyl-תאית עמודות) (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 26 s
Description: למדו שיטת טיהור טריפנוזומים אפריקאים מדם באמצעות עמודת מחליף אניונים DEAE cellulose. טכניקה זו משפרת אבחון מחלת השינה ומספקת טפילים מטוהרים למחקר ביוכימי ותרופתי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לכל חברי UMR 177 INTERTRYP IRD CIRAD אוניברסיטת דה בורדו. מחקר זה נתמך על ידי מימון פנימי של האוניברסיטה של בורדו ויוצקים תמיכה את ANR, LABEX ParaFrap ANR-11-LABX-0024, ומן האגודה le développement de la en רשרש parasitologie et médecine tropicale, דה שירות coopération et d'action התרבות דה l'Ambassade דה פראנס א' בנגי (Centrafrique).

חקירות תאמו ההנחיות על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה (NIH פרסום מס 85±23, תוקן 1996). פרוטוקולים אושרו על ידי ועדת האתיקה המקומית שלנו.
1. בעלי חיים
<ol><li>לשמור על עכברים שוויצרי (של-1) נשים בגילאי 8-10 שבועות, g 20-25, בחיה דיור מתקן חמישה עשר ימים לפני כל ניסוי. בית אותם בתיבות מאוורר שנשמרים מוגן, טמפרטורה (22 מעלות צלזיוס), לחות (50%) שלט חדר, עם 12 שעות הפעלה/כיבוי מחזור אור.</li>
	<li>מעניק חיות חינם גישה מזון ומים. מזעור כאב, סבל ומצוקה ולספק העשרה של הסביבה.</li>
	<li>לשימוש למגורים, עם קירות ברור הכלובים, העשרה עם מקלות עץ, קרטון מנהרות. בעדינות לצייר חיה לתוך מנהרה להעביר אותה מן הכלוב על כף היד.</li>
	<li>לבצע פיקוח יומי כדי להעריך סימנים של השתטחות, בידוד חברתי, פגיעת גוף, שערה הסתור או חוסר הטיפוח.</li>
	<li>שוקלים כל בעל חיים פעם אחת בשבוע. ביצוע הבדיקות הרגילות על-ידי וטרינר.</li>
	<li>נגד טפילים טבעי, לאסוף את הדם על פסגת ההר של parasitemia ועל טפילים גרימת מוות בעלי חיים, לאסוף דם יום לפני מותו המשוער. הערה: כל ניסויים עם מדבקים מבוצעים בחדרים ייעודי, על פי הנחיות האוניברסיטה אישרה.</li>
</ol>2. מאגרים, ההכנות מדיה
<ol><li>שוקלים את כל החומר ולהוסיף מים מזוקקים על המאגרים הבאים:<ol>
<li>להכין תמיסת מלח מרוכזת באגירה פוספט (2x): נה2HPO4 (נטול מים) (MW 141.96 ג'י) 10.14 g NaH2PO4∙2H2O (MW 156.01 g) 0.62 g NaCl (MW 58.44 ג'י) 2.55 g מזוקקים H2O ל- 1 ליטר</li>
		<li>הכן באגירה פוספט תמיסת מלח-גלוקוז: נה2HPO4 (נטול מים) (MW 141.96 ג'י) 5.39 g NaH2PO4∙2H2O (MW 156.01 ג'י) 0.31 g NaCl (MW 58.44 ג'י) 1.70 g גלוקוז (MW 180 גרם) 10 גרם מזוקקים H2O ל- 1 ליטר</li>
		<li>להכין 1 מ' ח'2PO4.</li>
		<li>להכין מאגר • תנאי: תוספת באגירה פוספט תמיסת גלוקוז עם פניצילין (100 U/mL), סטרפטומיצין (100 µg/mL), פנול אדום (5 µg/mL).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. הכנת DEAE-תאית
<ol><li>תוכנית בסביבות 5 שעות להכנת DEAE-תאית.</li>
	<li>לשטוף 100 גר' DEAE-תאית עם מים מזוקקים בבקבוקון עם צוואר צר ולאפשר ליישב, ולאחר מכן למחוק חלקיקים. חזור על שוטף עד תגובת שיקוע ברור.</li>
	<li>להוסיף 3 L מרוכז 2 x Phosphate-Buffered מלח ומערבבים.</li>
	<li>להתאים את ה-pH ל 8.0 עם 1 מ' ח'2PO4 ולמחוק את תגובת שיקוע.</li>
	<li>לשטוף פעמיים עם מים מזוקקים ולהשאיר להתיישב.</li>
	<li>רוחצים את אפשר כדי ליישב פעמיים עם 3 ליטר Phosphate-Buffered תמיסת מלח-גלוקוז ולמחוק את supernatants.</li>
	<li>למדוד את עוצמת הקול של תאית, להוסיף אמצעי שווה של Phosphate-Buffered מי מלח-גלוקוז, להפיץ לתוך בקבוקי פלסטיק ולאחסן ב-20 ° C.</li>
</ol>4. טפילים
<ol><li>לאסוף זנים trypanosome באזורים אנדמיים של האדם ושל בעלי החיים trypanosomiasis. שמור טפילים קפוא חנקן נוזלי. הערה: Trypanosoma musculi הוא פתוגניים שאינם בני אדם והוא trypanosome חוץ-תאית השתמשו להחליף בבטחה trypanosomes פתוגניים שונים שמוכר.</li>
	<li>במקרה של חקירות מעבדה הדורשים פתוגנים אנושי, להתמודד עם ניסויים עם טיפול ייעודי הביולוגי המתאים בטיחות ותנאים רמה (BSL) אמצעי זהירות; BSL2 gambiense נולד ב- ט ו BSL3 עבור rhodesiense נולד ב- טי. בתנאי שדה, נוצר מנהג מיקרוביולוגית: לאבטח דגימה, pipetting מכני, טיהור תכופים של משטחים, ועיקור פסולת.</li>
</ol>5. העכבר זיהום
<ol><li>במהירות להפשיר טפילים באמבט מים בטמפרטורה 37 º c</li>
	<li>להתבונן טיפה של דם נגוע המופשרים עם מיקרוסקופ. להעריך את הכדאיות טפיל על ידי מדידת אחוז תאי טופסי17.</li>
	<li>להזריק טפילים intraperitoneally לתוך עכברים (0.5 מ"ל לכל העכבר). בכל יום, לאחר הפגיעה, לאסוף 20 µL של זנב דם על ידי מחט דקירה ולצפות תחת מיקרוסקופ. הערכת parasitemia על פי Lumsden והרברט18 על ידי ספירת טפילים במספר שדות מיקרוסקופ, או באמצעות שימוש של haemocytometer.</li>
	<li>Parasitemia מגיעה לסף מסוים המוגדר עבור כל זן, לאסוף את הדם (1 מ"ל/עכבר) במאגר • תנאי (5 מ ל/עכבר) המכיל הפרין (10 U/mL). הערה: העבודה המקורי של הרומן של לנהאם ו גודפרי דיווח שהכוח יוניים אופטימלית של פוספט buffered גלוקוז מלוחים עבור מספר מינים מארח/טפיל פתרון מניות pH 8.0.</li>
</ol>6. טפיל ההפרדה
הערה: כל ניסויים מנקודה זו ואילך חייב להיעשות בשכונה תרביות רקמה לבש כפפות. חדר טמפרטורה ולחות במעבדות השתמשו היו 22 ° C ו- 45% בהתאמה. בתנאי שדה, טפיל ההפרדה בהצלחה בוצעה ב 34 מעלות צלזיוס.
<ol><li>הכנס מזרק 10 מ"ל תמיכה אנכי ולהוסיף מעגלי לחתוך קודם לכן, פיסת נייר סינון, צמר זכוכית או ספוג תאית.</li>
	<li>שופכים את התאית DEAE לתוך המזרק עד רמת 8 מ ל מתמלאת, ולאחר מכן לשטוף עם 25 מ"ל • תנאי המאגר.</li>
	<li>בזהירות להוסיף 2 מ"ל של דם מדולל בחלק העליון של העמודה ולאחר מכן להוסיף • תנאי בינוני. באופן קבוע להוסיף מאגר • תנאי על-פי המעבר של trypanosomes.</li>
	<li>לאסוף טיפות קולחים העמודות בשפופרת צנטרפוגה ולבדוק באופן קבוע הנוכחות של טפילים עם מיקרוסקופ.</li>
	<li>כאשר טפילים כבר לא זוהו ב למסקנות עמודה, centrifuge את הצינור (1,800 x g, 10 דקות, ב 4 ° C במעבדה, בטמפרטורת הסביבה בתנאי שדה).</li>
	<li>הסר את תגובת שיקוע, להשעות הטפילים ב 1 מ"ל של המדיום הרלוונטי הנדרש לשלב החקירה הבא.</li>
	<li>לספור טפילים עם hemocytometer ו לדלל אותם בינוני המתאים במידת הצורך.</li>
</ol>

<ol><li>Büscher, P., Cecchi, G., Jamonneau, V., Priotto, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+African+trypanosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Human African trypanosomiasis.</a> Lancet. 390 (10110), 2397-2409 (2017).</li>
<li>Lejon, V., Bentivoglio, M., Franco, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+African+trypanosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+Clinical+Neurology%22%5BJournal%5D)">Human African trypanosomiasis.</a> Handbook of Clinical Neurology. 114, 169-181 (2013).</li>
<li>Giordani, F., Morrison, L. J., Rowan, T. G., De Koning, H. P., Barrett, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+animal+trypanosomiases+and+their+chemotherapy%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">The animal trypanosomiases and their chemotherapy: a review.</a> Parasitology. 143 (14), 1862-1889 (2016).</li>
<li>Aksoy, S., Buscher, P., Lehane, M., Solano, P., Van Den Abbeele, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+African+trypanosomiasis+control%3A+Achievements+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Human African trypanosomiasis control: Achievements and challenges.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (4), e0005454(2017).</li>
<li>Büscher, P., Deborggraeve, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+can+molecular+diagnostics+contribute+to+the+elimination+of+human+African+trypanosomiasis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">How can molecular diagnostics contribute to the elimination of human African trypanosomiasis?</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (5), 607-615 (2015).</li>
<li>Truc, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atypical+human+infections+by+animal+trypanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Atypical human infections by animal trypanosomes.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (9), e2256(2013).</li>
<li>Lumsden, W. H., Kimber, C. D., Evans, D. A., Doig, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypanosoma+brucei%3A+miniature+anion-exchange+centrifugation+technique+for+detection+of+low+parasitaemias%3A+adaptation+for+field+use%5BTitle%5D)+AND+%22Transactions+of+the+Royal+Society+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">Trypanosoma brucei: miniature anion-exchange centrifugation technique for detection of low parasitaemias: adaptation for field use.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73 (3), 312-317 (1979).</li>
<li>Büscher, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Models+of+Mini+Anion+Exchange+Centrifugation+Technique+%28mAECT%29+and+Modified+Single+Centrifugation+%28MSC%29+for+sleeping+sickness+diagnosis+and+staging%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Improved Models of Mini Anion Exchange Centrifugation Technique (mAECT) and Modified Single Centrifugation (MSC) for sleeping sickness diagnosis and staging.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 3 (11), e471(2009).</li>
<li>Lanham, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+trypanosomes+from+the+blood+of+infected+rats+and+mice+by+anion-exchangers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Separation of trypanosomes from the blood of infected rats and mice by anion-exchangers.</a> Nature. 218 (5148), 1273-1274 (1968).</li>
<li>Lanham, S. M., Godfrey, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+salivarian+trypanosomes+from+man+and+other+mammals+using+DEAE-cellulose%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Isolation of salivarian trypanosomes from man and other mammals using DEAE-cellulose.</a> Experimental Parasitology. 28 (3), 521-534 (1970).</li>
<li>Humphrey, P. A., Ashraf, M., Lee, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+trypanosomes+in+vivo%2C+host+body+weight+gains%2C+and+food+consumption+in+zinc-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Growth of trypanosomes in vivo, host body weight gains, and food consumption in zinc-deficient mice.</a> Journal of the National Medical Association. 89 (1), 48-56 (1997).</li>
<li>Lowry, J. E., Leonhardt, J. A., Yao, C., Belden, E. L., Andrews, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+C57BL%2F6+mice+by+Trypanosoma+musculi+modulates+host+immune+responses+during+Brucella+abortus+cocolonization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Wildlife+Diseases%22%5BJournal%5D)">Infection of C57BL/6 mice by Trypanosoma musculi modulates host immune responses during Brucella abortus cocolonization.</a> Journal of Wildlife Diseases. 50 (1), 11-20 (2014).</li>
<li>Vincendeau, P., Daëron, M., Daulouede, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+antibody+classes+and+Fc+receptors+responsible+for+phagocytosis+of+Trypanosoma+musculi+by+mouse+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Identification of antibody classes and Fc receptors responsible for phagocytosis of Trypanosoma musculi by mouse macrophages.</a> Infection and Immunity. 53 (3), 600-605 (1986).</li>
<li>Vincendeau, P., Daëron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypanosoma+musculi+co-express+several+receptors+binding+rodent+IgM%2C+IgE%2C+and+IgG+subclasses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Trypanosoma musculi co-express several receptors binding rodent IgM, IgE, and IgG subclasses.</a> Journal of Immunology. 142 (5), 1702-1709 (1989).</li>
<li>Holzmuller, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+and+pathogenicity+patterns+of+Trypanosoma+bruceigambiense+field+isolates+in+experimentally+infected+mouse%3A+differences+in+host+immune+response+modulation+by+secretome+and+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+Infections%22%5BJournal%5D)">Virulence and pathogenicity patterns of Trypanosoma bruceigambiense field isolates in experimentally infected mouse: differences in host immune response modulation by secretome and proteomics.</a> Microbes and Infections. 10 (1), 79-86 (2008).</li>
<li>Holzmuller, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+do+parasites+and+their+excreted-secreted+factors+modulate+the+inducible+metabolism+of+L-arginine+in+macrophages%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">How do parasites and their excreted-secreted factors modulate the inducible metabolism of L-arginine in macrophages?</a> Frontiers in Immunology. 9, 778(2018).</li>
<li>Abrahamson, I. A., Da Silva, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-dependent+cytotoxicity+against+Trypanosoma+cruzi%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">Antibody-dependent cytotoxicity against Trypanosoma cruzi.</a> Parasitology. 75 (3), 317-323 (1977).</li>
<li>Herbert, W. J., Lumsden, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypanosoma+brucei%3A+a+rapid+%26%2334%3Bmatching%26%2334%3B+method+for+estimating+the+host%27s+parasitemia%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Trypanosoma brucei: a rapid &#34;matching&#34; method for estimating the host's parasitemia.</a> Experimental Parasitology. 40 (3), 427-431 (1976).</li>
<li>Dauchy, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypanosoma+brucei+CYP51%3A+Essentiality+and+Targeting+Therapy+in+an+Experimental+Model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Trypanosoma brucei CYP51: Essentiality and Targeting Therapy in an Experimental Model.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (11), e0005125(2016).</li>
<li>Raz, B., Iten, M., Grether-Bühler, Y., Kaminsky, R., Brun, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Alamar+Blue+assay+to+determine+drug+sensitivity+of+African+trypanosomes+%28T.+b.+rhodesiense+and+T.+b.+gambiense%29+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Tropica%22%5BJournal%5D)">The Alamar Blue assay to determine drug sensitivity of African trypanosomes (T. b. rhodesiense and T. b. gambiense) in vitro.</a> Acta Tropica. 68 (2), 139-147 (1997).</li>
<li>Albright, J. W., Albright, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+growth+of+Trypanosoma+musculi+in+cell-free+medium+conditioned+by+rodent+macrophages+and+mercaptoethanol%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+for+Parasitology%22%5BJournal%5D)">In vitro growth of Trypanosoma musculi in cell-free medium conditioned by rodent macrophages and mercaptoethanol.</a> International Journal for Parasitology. 10 (2), 137-142 (1980).</li>
<li>Gobert, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-Arginine+availability+modulates+local+nitric+oxide+production+and+parasite+killing+in+experimental+trypanosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">L-Arginine availability modulates local nitric oxide production and parasite killing in experimental trypanosomiasis.</a> Infection and Immunity. 68 (8), 4653-4657 (2000).</li>
<li>De Muylder, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Trypanosoma+brucei+kinesin+heavy+chain+promotes+parasite+growth+by+triggering+host+arginase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">A Trypanosoma brucei kinesin heavy chain promotes parasite growth by triggering host arginase activity.</a> PLoS Pathogens. 9 (10), e1003731(2013).</li>
<li>Nzoumbou-Boko, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypanosoma+musculi+Infection+in+Mice+Critically+Relies+on+Mannose+Receptor-Mediated+Arginase+Induction+by+a+TbKHC1+Kinesin+H+Chain+Homolog%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Trypanosoma musculi Infection in Mice Critically Relies on Mannose Receptor-Mediated Arginase Induction by a TbKHC1 Kinesin H Chain Homolog.</a> Journal of Immunology. 199 (5), 1762-1771 (2017).</li>
<li>Bonhivers, M., Nowacki, S., Landrein, N., Robinson, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+of+the+trypanosome+endo-exocytotic+organelle+is+cytoskeleton+mediated%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Biogenesis of the trypanosome endo-exocytotic organelle is cytoskeleton mediated.</a> PLoS Biology. 6 (5), e105(2008).</li>
<li>Albisetti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+the+flagellar+pocket+collar+and+the+hook+complex+via+a+novel+microtubule-binding+protein+in+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Interaction between the flagellar pocket collar and the hook complex via a novel microtubule-binding protein in Trypanosoma brucei.</a> PLoS Pathogens. 13 (11), e1006710(2017).</li>
<li>Cross, G. A. M., Klein, R. A., Linstead, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+amino+acids+by+Trypanosoma+brucei+in+culture%3A+L-threonine+as+a+precursor+for+acetate%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">Utilization of amino acids by Trypanosoma brucei in culture: L-threonine as a precursor for acetate.</a> Parasitology. 71 (2), 311-326 (1975).</li>
<li>Bringaud, F., Rivière, L., Coustou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+metabolism+of+trypanosomatids%3A+adaptation+to+available+carbon+sources%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Energy metabolism of trypanosomatids: adaptation to available carbon sources.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 149 (1), 1-9 (2006).</li>
<li>Mazet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+the+central+metabolism+of+the+bloodstream+forms+of+Trypanosoma+brucei%3A+production+of+acetate+in+the+mitochondrion+is+essential+for+the+parasite+viability%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Revisiting the central metabolism of the bloodstream forms of Trypanosoma brucei: production of acetate in the mitochondrion is essential for the parasite viability.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (12), e2587(2013).</li>
<li>Coutton, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+CFAP43+and+CFAP44+cause+male+infertility+and+flagellum+defects+in+Trypanosoma+and+human%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Mutations in CFAP43 and CFAP44 cause male infertility and flagellum defects in Trypanosoma and human.</a> Nature Communications. 9 (1), 686(2018).</li>
<li>Cnops, J., Magez, S., De Trez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escape+mechanisms+of+African+trypanosomes%3A+Why+trypanosomosis+is+keeping+us+awake%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">Escape mechanisms of African trypanosomes: Why trypanosomosis is keeping us awake.</a> Parasitology. 142 (3), 417-427 (2015).</li>
<li>Barrett, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics-Based+Approaches+to+the+Isolation+of+African+Trypanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens%22%5BJournal%5D)">Microfluidics-Based Approaches to the Isolation of African Trypanosomes.</a> Pathogens. 6 (4), (2017).</li>
<li>Taylor, A. E., Lanham, S. M., Williams, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+methods+of+preparation+on+the+infectivity%2C+agglutination%2C+activity%2C+and+ultrastructure+of+bloodstream+trypanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Influence of methods of preparation on the infectivity, agglutination, activity, and ultrastructure of bloodstream trypanosomes.</a> Experimental Parasitology. 35 (2), 196-208 (1974).</li>
<li>Gutteridge, W. E., Cover, B., Gaborak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+blood+and+intracellular+forms+of+Trypanosoma+cruzi+from+rats+and+other+rodents+and+preliminary+studies+of+their+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">Isolation of blood and intracellular forms of Trypanosoma cruzi from rats and other rodents and preliminary studies of their metabolism.</a> Parasitology. 76 (2), 159-176 (1978).</li>
<li>Cruz-Saavedra, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Trypanosoma+cruzi+metacyclic+trypomastigotes+by+ion+exchange+chromatography+in+sepharose-DEAE%2C+a+novel+methodology+for+host-pathogen+interaction+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Purification of Trypanosoma cruzi metacyclic trypomastigotes by ion exchange chromatography in sepharose-DEAE, a novel methodology for host-pathogen interaction studies.</a> Journal of Microbiological Methods. 142, 27-32 (2017).</li>
<li>Lemesre, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lasting+protection+against+canine+visceral+leishmaniasis+using+the+LiESAp-MDP+vaccine+in+endemic+areas+of+France%3A+double-blind+randomised+efficacy+field+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Long-lasting protection against canine visceral leishmaniasis using the LiESAp-MDP vaccine in endemic areas of France: double-blind randomised efficacy field trial.</a> Vaccine. 25 (21), 4223-4234 (2007).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

Trypanosomes מטוהרים מייצגים אמצעי רב עוצמה ללמוד אימונולוגיה, ביוכימיה, הסלולר וביולוגיה מולקולרית. מרחבים פתוחים של נתונים ותוצאות הושגו מן trypanosomes, אשר סייעה ואז לקבל מידע אחרים התאים האיקריוטים30. Trypanosomes הם גם הנושא של מחקר חשוב ומעניין כי הם פיתחו מנגנונים רבים זה מאפשר להם לשרוד ולצמוח בתוך שתי סביבות שונות: וקטור זבובים, המארח בתרבית של23, 31. דווח על טכניקות שונות כדי לבודד trypanosomes, סקירה על גישות מיקרופלואידיקה בא...

השיטה המובאת המתוארים כאן מאפשר ההפרדה של trypanosomes, טפילים אחראי על בעלי חיים ועל האדם מחלת השינה (כובע), מהדם. השיטה הטובה ביותר לאבחנה של השלב הראשון הכובע, יתר על כן שיטה זו טיהור טפיל היתרי החקירה סרולוגית ומחקר חזקים.
כובע נגרמת על ידי זבובים ששודרו Trypanosoma brucei gambiense ו- rhodesiense נולד ב- טי1. אלה טפילים protozoan הכפל extracellularly למחזור הדם, הלימפה, וכן נוזלים interstitial בשלב הראשון של המחלה (שלב hemolymphatic). השלב השני (שלב meningoencephalitic) מתחיל כאשר טפילים לחצות את מחסום הדם מוח; סימנים נוירולוגיים, כולל הפרעת שינה, אשר נתן את השם "מחלת השינה" למחלה זו, אופייניים זה שלב2. קשורים trypanosomes (evansi ט congolense ט, ט vivax, brucei נולד ב- ט) הסוכנים סיבתי של חיה אפריקאית trypanosomosis (AAT)3.
ארגון הבריאות העולמי (WHO) שמטרתו לחסל את הכובע כבעיה בריאות הציבור על ידי 2020 להפסיק שידור על-ידי 20304. המבוא האחרונות של בדיקות אבחון מהירה כולל אבחון משופר סרולוגית1,4,5. פותחו מספר בדיקות אבחון מולקולרי אך תפקידם בתוכנית האבחון השדה טרם בוטלה הוקמה5. הם משמשים לזיהוי תת המינים של brucei קבוצה של trypanosomiasis טיפוסיות הנגרמת על ידי טפילים אחראי בבעלי חיים trypanosomosis6.
זיהוי הטפיל חיוני עבור אבחון, טיפול ומעקב, סרולוגיה יכול לתת תוצאות שליליות כוזב חיובי ו- false למרבה הצער1. בהתבוננות ישירה microscopical protists hemoflagellate אלה קשה במקרים הכובע הנגרמות על-ידי gambiense נולד ב- ט', (יותר מ- 95% מהמקרים) כמו parasitemias נמוכה גם הכלל, ואילו כובע נגרם על-ידי rhodesiense נולד ב- ט', גדול מספר טפילים נמצאים לעתים קרובות הדם. טכניקות ריכוז שונות היו בשימוש, כגון ירידה עבה, צינור קפילרי צנטריפוגה (CTC), אבל ההפרדה של טפילי הדם לפי עמודה של אניון-מחליף (DEAE תאית) ואחריו צנטריפוגה, התבוננות מיקרוסקופית גלולה, היא השיטה הכי רגיש (בסביבות 50 טפילים/מ"ל של דם יכולה להתגלות)1,7. כתוצאה מכך, הטיהור של trypanosomes בשיטה זו אניון-מחליפי (DEAE תאית) הוא הטוב ביותר, נכון להיום, שיטת הפניה עבור להמחיש ובידוד טפילי הדם לאבחון את הכובע. בתנאי שדה, עמודה מיני DEAE תאית שימש בהצלחה והנחה מספר שיפורים יש תצפית microscopical7,8.
שיטת ההפרדה trypanosome מדם, המתוארים להלן, תלוי תשלום משטח טפיל, פחות שלילית יותר בתרבית של תאי דם9. מעניין, שיטה זו פותחה לפני 50 שנה, בשנת 1968 על ידי ד ר שילה לנהאם, ונותרה תקן הזהב זיהוי, הכנת trypanosomes למחזור הדם. זה מהיר, לשחזור עבור salivarian trypanosomes ממגוון רחב של יונקים, המתיר את האבחנה של שני בעלי חיים ועל האדם trypanosomiasis10.
כדי להשיג טפילים חי, מטוהרים, דם נגוע נוסף על גבי עמודת מחליף אניון. תנאים כרומטוגרפיה (בעיקר ה-pH, כוח יונית של מאגרי/מדיה) צריך להיות מותאם לכל מין trypanosome, באופן כללי יותר, כל שילוב של בתרבית של תאי דם, trypanosomes10. • תנאי מאגר מכוון בדיוק pH 8 trypanosomes ביותר אפריקאי10. שיטה זו מיטיבה את הריכוז של טפילים נמצאו בדם של חולים, כי parasitemias יכול להיות נמוך מדי יזוהו על-ידי התבוננות מיקרוסקופית לבד, והוא גם מאפשר חקירות מעבדה. עבודה עם trypanosomes טרי מבודד, על דם של חיות נגועות, באמצעות טכניקה זו, היא יותר רלוונטי לחקירה שונים מאשר מחקרים עם טפילים תרבותי בתנאים axenic במעבדה לתקופה בלתי מוגבלת.
קשרי גומלין מארח-טפיל נלמדים בצורה הטובה ביותר עם הטפיל מדביק המארח הטבעי שלו, לכן, ט musculi, טפיל מאתר טבעי, אשר הוא נציג של trypanosomes חוץ-תאית, יש יתרונות רבים כמו זיהום מאתר כרוך חיות מעבדה קטנה לא דורשת תנאי רמת (BSL) בטיחות חומרים מסוכנים. ט musculi לא הורג עכברים immunocompetent, בניגוד מינים רבים אחרים Trypanosoma , כולל האדם פתוגנים. ט musculi לא יחוסלו בעכברים תא T-מקופח, parasitemias ניתן להגדיל אצל עכברים נגועים על ידי שינוי צריכת מוצרי מזון, חומרי מזון11. הטפיל הזה שמחליש את התגובה החיסונית זיהומים שיתוף עם אחרים פתוגנים12. ט musculi של עכברים נגועים הבדלים נספח תרבותי musculi ט, לדוגמה, הביטוי של קולטני ממברנה Fc אבוד בתרבויות axenic ט musculi , לעומת טפילים מכל עכברים נגועים13 , 14. גורמים מופרש Excreted (ESF) הם גם איכותית באופן כמותי פחות בא לידי ביטוי בתרבויות axenic trypanosome ו שונים בין זנים שבודדו אזורים אנדמיים15. ESF הם אנטיגנים הראשון להיות מוצגת בפני המערכת החיסונית המארח, אז יש תפקיד חשוב במארח הראשונית התגובה החיסונית16.
אצל בעלי חיים נגועים השפעול לחקירות מעבדה, פרוטוקול זה מקלה על ניסויים מספר רב יותר של טפילים, צמצום מספר עכברים הנדרש במיוחד כאשר באמצעות בעלי חיים immunosuppressed. Glycoproteins משטח variant (VSGs) הנמצאים בשימוש במבחן התלכדות כרטיס עבור Trypanosomiasis (CATT) בעת ההקרנה ההמונית וגופם מטוהר עדיין מן trypanosomes אשר מופצים בחולדות. שני מהירה בדיקות אבחון (קלטות עטופה בנפרד) זמינים כעת לשימוש בשטח, עדיין משתמשים מקור דגם זיהומיות של יליד VSGs, לא במבחנה תרבותי trypanosomes1,4, 5. ההתקדמות במחקר של trypanosome אימונולוגיה, ביולוגיה יש שניתנו לשיירה מאז אלה טפילים תאית מטוהר DEAE ניתן להשיג בקלות בכמויות גדולות ממחשבים מארחים טבעי או השפעול נגוע, ובחודש מסוים, מכרסמים.

<table><tbody><tr><td>10 מ"ל פיפטות&nbsp;</td><td>פלקון</td><td>357,551</td><td></td></tr><tr><td>2 מ"ל פיפטות&nbsp;</td><td>פלקון</td><td>352,507</td><td></td></tr><tr><td>צינור צנטריפוגה 50 מ"ל</td><td>פלקון</td><td>352,070</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>4K15</td><td></td></tr><tr><td>תאית DEAE</td><td>סנטה קרוז</td><td>s/c- 211213</td> נייר סינון <td>100 גרם</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Whatman</td><td>1,001,125</td><td></td></tr><tr><td>בקבוק תחתון שטוח צוואר צר</td><td>דוראן</td><td>21 711 76</td><td>6000 מ"ל</td></tr><tr><td>גלוקוז&nbsp;</td><td>VWR</td><td>101174Y</td><td>500 גרם</td></tr><tr><td>הפרין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>H3149-50KU</td><td>5 000 U</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>VWR</td><td>120 26936.260</td><td>500 G</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>אולימפוס</td><td>CH-20</td><td></td></tr><tr><td>כיסויי מיקרוסקופ</td><td>Thermofisher CB00100RA020MNT0</td><td></td><td></td>מדעי</tr><tr><td>שקופיות</td> <td>מיקרוסקופThermofisher Scientific</td><td>AGAA000001</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4&nbsp;</td><td>VWR</td><td>100 28026; 260</td><td>500 גרם</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>VWR</td><td>27800.291</td><td>1 ק"ג</td></tr><tr><td>NaH2PO4&nbsp;</td><td>VWR</td><td>110 33616; 262</td><td>500 גרם</td></tr><tr><td>בקבוקי מדיה מפלסטיק Nalgene גודל 125 מ"ל</td><td>Thermofisher scientific</td><td>342024-0125</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקי מדיה מפלסטיק Nalgene גודל 500 מ"ל</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>342024-0500</td><td></td></tr><tr><td>פיפטת פסטר</td><td>VWR</td><td>BRND125400</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין 10,000 UI/Streptomycin 10,000 & מיקרו; g</td><td>EUROBIO</td><td>CABPES01 OU</td><td>100 מ"ל</td></tr><tr><td>פנול אדום</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>P0290</td><td>100 מ"ל</td></tr><tr><td>מזרק&nbsp;</td><td>Dutscher</td><td>SS+10S21381</td><td></td></tr><tr><td>קולט אדים לתרבית רקמות</td><td>Thermoelectro Corporation</td><td>MSC-12</td><td></td></tr><tr><td>Trypanosoma brucei brucei</td><td>מכון לרפואה טרופית (אנטוורפן, בלגיה).</td><td></td><td>ANTAT 1.1</td></tr><tr><td>Trypanosoma brucei gambiense</td><td>Institute of Tropical Medicine (אנטוורפן, בלגיה).</td><td></td><td>ITMAP 1893</td></tr><tr><td>Trypanosoma musculi</td><td>בית הספר להיגיינה ורפואה טרופית של לונדון (בריטניה)</td><td></td><td>Partinico II</td></tr></tbody></table>

טיהור של trypanosomes חוץ-תאית, כולל אפריקה, מן הדם על ידי אניון-מחליפי (diethylaminoethyl-תאית עמודות)

Purification of Extracellular Trypanosomes, Including African, from Blood by Anion-Exchangers (Diethylaminoethyl-cellulose Columns)

שיטה זו מאפשרת ההפרדה של trypanosomes, טפילים אחראי על בעלי חיים ועל האדם מחלת השינה (כובע), של דם נגוע. השיטה הטובה ביותר לאבחנה של השלב הראשון הכובע, יתר על כן שיטה זו טיהור טפיל היתרים סרולוגית ומחקר חקירות.
כובע נגרמת על ידי זבובים ששודרו Trypanosoma brucei gambiense , ט rhodesiense ב. Trypanosomes קשורים הם הסוכנים סיבתי של trypanosomiasis בעלי חיים. Trypanosome זיהוי חיוני עבור כובע אבחון, טיפול ומעקב. בטכניקה המתוארת כאן הטכניקה זיהוי הטפיל רגיש ביותר, המותאמים לתנאי שדה לאבחון של gambiense נולד ב- ט' הכובע, יכול להסתיים בתוך שעה אחת. הדם הוא שכבות על גבי עמודת מחליף אניון (DEAE תאית) בעבר מותאם pH 8, מאגר • תנאי נוסף. תאי הדם טעונים מאוד שלילית הם הספוחה אל העמודה ואילו trypanosomes טעונים שלילית פחות עוברים. Trypanosomes שנאספו מגורען על ידי צנטריפוגה, שנצפה על ידי מיקרוסקופ. יתר על כן, טפילים מוכנות ללא נזק תאי תוך שמירה על infectivity שלהם.
Trypanosomes מטוהרים נדרשים לבדיקת אימונולוגי; הם משמשים trypanolysis וזמינותו, תקן הזהב בסרולוגיה כובע. טפילים מוכתם מנוצלים ב המבחן התלכדות כרטיס (CATT) עבור השדה סרולוגיה. אנטיגנים של trypanosomes מטוהרים, כגון גליקופרוטאין השטח משתנה, exoantigens, משמשים גם immunoassays שונים. ההליך המתואר כאן מיועד trypanosomes אפריקה; כתוצאה מכך, כרומטוגרפיה תנאים צריך להיות מותאם לכל זן trypanosome, באופן כללי יותר, הדם של כל מיני יונקים המארח.
מרתק פתוגנים אלו בקלות מטוהרים וזמין לשימוש בהביוכימי, מולקולרית ותא ביולוגיה ללימודי כולל תרבות משותפת עם התאים המארחים לחקור קשרי גומלין מארח-טפיל ברמה של קולטני ממברנה איתות, ג'ין ביטוי; סמים בדיקות חוץ גופית בתוך; חקירה של ג'ין מחיקה, מוטציה או ביטוי על תהליכי חילוף החומרים, cytoskeletal להן והישרדות טפיל.

Trypanosomes מטוהרים היו בשימוש בבדיקות התרופות. טפילים מועברים לתוך בארות תרבות המכיל דילולים טורי תרופות ספציפיות, או לבד או מעורב19. תצפיות מיקרוסקופיות, הערכת תנועתיות מהווה סמן של הכדאיות, יכול להתבצע כאשר רק כמה דוגס נבדקות, בעוד AlamarBlue תא הכדאיות וזמינותו היא שיטה מצוינת עבור מבחני תנועתיות גדול במהלך סמים הקרנה20. ההשפעה של pentamidine, תרופה הפניה המשמשת בטיפול הכובע, מוצג באיור1.
<p class="jove...

שיטה זו של הפרדה trypanosome הדם תלויה שלהם תשלום משטח שלילי פחות מאשר בתרבית של תאי דם. דם נגוע להציב, שטופלו על עמודת מחליף אניון. שיטה זו, הכי מתאים אבחון של מחלת השינה, מספקת טפילים מטוהרים לחקירות חיסוניות, ביולוגיים, ביוכימיים, פרמצבטיקה וביולוגיה מולקולרית.

טיהור של Trypanosomes חוץ-תאית, כולל אפריקה, מן הדם על ידי אניון-מחליפי (Diethylaminoethyl-תאית עמודות)

This method allows the separation of trypanosomes, parasites responsible for animal and human African trypanosomiasis (HAT), from infected blood. This is ...

טריפנוזומים אפריקאים אחראים על טריפאנוזומיה אפריקאית אנושית, או מחלת שינה ו trypanosomiasis אפריקאי בעלי חיים. טריפנוזומים הגורמים למחלות שינה הם טפילים פרוטיסטיים המועברים זבוב tsetse נוכחים מוקדים גיאוגרפיים רבים באפריקה שמדרום לסהרה. גילוי הטפיל חיוני לאבחון, טיפול ומעקב.סרולוגיה יכולה לתת תוצאות שליליות שגויות ולצערי, כוזבות. כדי לסייע באיתור בדם, יש לרכז את הנסיפנוזומים. נעשה שימוש בטכניקות ריכוז טפילים שונות.השיטה הרגישה ביותר היא הפרדת טפילים מדם על ידי טור של מחליף אניון, תאית DEAE ואחריו צנטריפוגה ותצפית מיקרוסקופית. כתוצאה מכך, שיטת תאית DEAE היא הטובה ביותר ונשארת עד כה, שיטת הייחוס להדמיה ובודדה של טפילים מדם לאבחון טריפנוזומיאזיס אפריקאי אנושי, במיוחד בתנאי שדה. שיטה זו, האבחון ההולם ביותר עבור טריפנוסומיאזיס אפריקאי מספק גם טפילים מטוהרים עבור חקירות ביולוגיות, ביולוגיות, ביוכימיות, תרופות וביולוגיות מולקולריות.כל החקירות תואמות את המדריך לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדה וההסכם הושג מהרשויות הצרפתיות וכל הפרוטוקולים בהם נעשה שימוש אושרו על ידי ועדת האתיקה המקומית שלנו. לשקול כל חומר על פי הפרוטוקול בכתב. מוסיפים מים מזוקקים ומתאימים בדיוק ל-pH 8 עם אשלגן דיהידרוגן פוספט כדי ליצור את הפתרונות הבאים במאגר, מלוחים מרוכזים של מאגר פוספט 2X.מוסיפים מים מזוקקים וגלוקוז לגלוקוז מלוחים במאגר פוספט. עבור 100 מיליליטר של חיץ אלוטיון, להוסיף 100 יחידות למיליליטר של פניצילין, 100 מיקרוגרם למיליליטר של סטרפטומיצין, וחמישה מיקרוגרם מיליליטר של פנול אדום לפוספט גלוקוז מלוחים במאגר. 100 גרם של תאית DEAE נשטף תחילה עם שלושה ליטרים של מים מזוקקים ולאחר מכן עזב להתיישב.חלקיקים עדינים מושלכים. הכביסה חוזרת על עצמה עד שהעל-טבעי מתבהר. פוספט מרוכז אגף מלוחים 2X מתווסף ואת תאית DEAE הוא עורר.ה- pH מותאם לשמונה עם אשלגן פוספט אחד. לאחר מכן התאית נשטפת פעמיים במים מזוקקים ופעמיים עם גלוקוז מלוחים במאגר פוספט. תאית DEAE וגלוקוז מלוחים במאגר פוספט מעורבבים בכמויות שוות.סגסוגת רבעים ומאוחסנת בטמפרטורת החדר או ארבע מעלות צלזיוס או במינוס 20 מעלות צלזיוס לאחסון ממושך. דם נגוע טריפנוזום מאוחסן בחנקן נוזלי. ליטר סגסוגת של מיליליטר אחד מופשר בטמפרטורת החדר.טפילים נאספים בקפידה מההקפאה באמצעות מחט ומזרק מיליליטר אחד. הכדאיות של טפילים מופשרים מוערכת על ידי תנועתיות כפי שהודמיה על ידי תצפית מיקרוסקופית אור לפני ההדבקה. טפילים מוזרקים לחללים הציוניים של שני עכברים, 500 מיקרוליטרים לעכבר.כל יום לאחר זיהום, טפיל מוערך על ידי איסוף טיפת דם מהזנב עם מחט נבדק על ידי מיקרוסקופיה. כאשר הטפיל הוא ברמה מתאימה, דם נגוע נאסף. מזרק 10 מיליליטר נתמך מלחציים או מחזיקים ופיסת נייר סינון חתוכה מראש מתווספת.תאית DEAE מוכנה נשפכת לתוך המזרק עד לרמה של שמונה או תשעה מיליליטר. העמודה נשטפת עם מאגר האלוטיון. שני מיליליטר של דם נגוע ממוקם בקפידה על גבי העמוד ו trypanosomes נאספים בעמודה eluate בצינור צנטריפוגה 50 מיליליטר.חיץ אלוטיון מתווסף באופן קבוע על פי המעבר של טריפנוזומים. המעבר של טריפנוזומים דרך העמוד נבדק על ידי לקיחת טיפה של עמודה מרוממת במרווחי זמן קבועים והתבוננות טריפנוזומים באמצעות מיקרוסקופיה קלה. כאשר טריפנוזומים אינם נצפו עוד באלואט, הצינור חרוט הוא צנטריפוגה ב 1, 800 פעמים G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.העל-טבעי מושלך ונסיפנוזומים במשטח נספרים בהמוציטומטר. טריפנוזומים שנאספו מדוללים לאחר מכן במדיום הנדרש לחקירה המתוכננת. שיטה זו, האבחון ההולם ביותר עבור טריפנוסומיאזיס אפריקאי מספק טפילים מטוהרים עבור חקירות ביולוגיות, ביולוגיות, ביוכימיות, פרמצבטיות ומולקולריות.מחקרים אלה פותחו כי DEAE תאית טפילים מטוהרים ניתן להשיג בקלות בכמויות גדולות מן המארחים נגועים באופן טבעי או ניסיוני ובמיוחד, מכרסמים. יכולת הקיום Trypanosome בנוכחות סוכני תרופות מוערכת על ידי תצפית מיקרוסקופית. כדאיות טפיל קשורה תנועתיות ולכן, ניתן לבדוק על ידי העין תחת מיקרוסקופ אור ב 40 פעמים או הגדלה גבוהה יותר.כדאיות טפיל מוערך על ידי מדידת אחוז צורות מוטיבציה. דילולים של תרכובות הבדיקה מתווספים לתוך כל באר של צלחת תרבות רקמה 96 היטב בעוד בארות שליטה מטופלים מדומה. כל ריכוז מוערך ב- triplicate.מספר הטפילים קיימא עבור כל דילול מושווה למספר הטפילים בארות שליטה. ההשפעות של Pentamidine, תרופת ייחוס, בשימוש בטיפול טריפנוזומיאזיס אפריקאי אנושי מוצג דמות זו. תרבויות מקרופאג' טריפנוזיות מאפשרות חקירה של אינטראקציה בין טפילים מארחים ברמה התאית.ב תרבויות טפיל מקרופאג, טריפנוזומים תאיים נוספים לגרום לייצור של ארגיניאז מקרופאג כי הידרוליזה ארגינין כדי ornithine. Ornithine הוא מבשר של פוליאמינים ו trypanothione, חיוני להישרדות טפיל וצמיחה. יתר על כן, דלדול ארגינין מקטין את הייצור של תחמוצת החנקן trypanocidal.לאחר מכן, תוספת של מעכב ארגינאז, S-L-ציסטאין לתרבויות שיתוף מפחית באופן דרמטי מקרופאג המושרה צמיחת טפיל. אינדוקציה ארגיניאז מתווך על ידי טריפנואז מופרש או מופרש גורמים. גורם גרימת ארגינאז זה זוהה כקינסין אורתיני.הקינסין נקשר לקולטנים קשירה lectin סוג C. ארגינז הוא המושרה ומייצר ornithine אשר מעדיף צמיחת טפיל. ארגינאז אינו מושרה על ידי kinesin מקרופאגים מתורבת עם 12.5 מילימולרית mannose או מקרופאגים מעכברים שבו קולטני mannose מקרופאג נמחקו.דוגמאות נוספות של ביולוגיה של התא ניסויים ביוכימיים באמצעות תאית DAEA טריפנוזומים מטוהרים מוכחים במחקרים שבהם חלבונים ציטוסקלטליים חדשניים כגון BILBO1 זוהה. BILBO1 נדרש עבור ביוגנזה של מבנים ציטוסקלטליים חשובים והישרדות טפילים. לכן, BILBO1 מייצג יעד חשוב להתערבות טריפנוזומים פתוגניים.תמונה המציגה תיוג immunoflourescence של צורת תרבות מחזור הדם, טריפאנוסומה ברוסי תא נבדק עם נוגדן נגד BILBO1 מוצג באיור זה. בנוסף, חילוף החומרים של גלוקוז ותרנין תוארו באמצעות טריפנוזומים מטוהרים תאית DEAE והאנזימים המעורבים בתהליכים אלה אומתו באופן ניסיוני. ייצוג סכמטי של חילוף החומרים של גלוקוז ותרונין ב טריפנוזומים שנוצרו במחזור הדם מוצג בנתון זה.טיהור של טריפנוזומים אפריקאים מדם על ידי חילופי אניון עמודי תאית DEAE עם השיפורים האחרונים נשאר תקן הזהב לגילוי trypanosome, לא רק מארחים טבעיים עם parasitemias נמוך באזורים אנדמיים, אלא גם עבור הדרישה של טפילים במספרים גדולים לחקירות ניסיוניות. חקירות אפשרו זיהוי של מולקולות trypanosome לשחק תפקידים חיוניים הישרדות טפיל וצמיחה. מטרות מזוהות עשויות לייצג את הבסיס לחיסון עתידי עם אנטיגנים פוטנציאליים הן לבני אדם והן לבעלי חיים בגישה בריאותית אחת.

purification-extracellular-trypanosomes-including-african-from-blood

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

אמא הוא חלבון ייחודי הקשור Magnetosome אשר הוצגה להיות מעורב ההפעלה magnetosome. כאן אנו מציגים את הפרוטוקול טיהור של אמא המחיקה מוטציה (MamAΔ41)...

טיהור של מ magneticum מסננים השגריר-1 Magnetosome חלבון Associated MamAΔ41

בסרטון זה, אנו מדגימים טכניקת כרומטוגרפיה של חילופי אניונים לטיהור S100A12 חלבון קושר סידן אנושי בהתבסס על מטען פני השטח נטו של החלבון מתרבית Escherichia coli.

טיהור חלבונים מבוסס כרומטוגרפיה של Anion-Exchange: טכניקת הפרדה לבידוד חלבון מעניין מליזט חיידקי על בסיס מטען נטו

סרטון זה מדגים את טכניקת הכרומטוגרפיה של חילופי קטיונים לבידוד חלבון רקומביננטי מחלבון תא החרק ליזט.

כרומטוגרפיית חילופי קטיונים: טכניקה לבידוד חלבון רקומביננטי מטרה מליזט תאי חרקים בהתבסס על מטען פני שטח נטו

סרטון זה מדגים את טכניקת הכרומטוגרפיה של אי הכללת גודל (SEC) לטיהור שלפוחיות חוץ-תאיות חיידקיות (EVs) מסנין התרבית של Mycobacterium tuberculosis (Mtb). הטכניקה משתמשת בעמוד שרף נקבובי כדי להשיג שברים מטוהרים של כלי רכב חשמליים. החלקיקים הנקבוביים מאפשרים באופן סלקטיבי לחלבונים קטנים יותר להיכנס לנקבוביות, וכתוצאה מכך ההדבקה איטית יותר. במקביל, כלי רכב חשמליים אינם נכנסים לנקבוביות בשל גודלם הגדול יותר והם מדוללים ראשונים.

טכניקת כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל לטיהור שלפוחיות חוץ-תאיות מיקובקטריאליות

מדידת פונקצית נוגדן היא מפתח להבנה חסינות למלרית falciparum Plasmodium. שיטה זו מתארת ​​את הטיהור של merozoites קיימא, ומדידה של phagocytosis opsonization תלוי על ידי cytometry זרימה.

טיהור תשואה גבוהה של<em&gt; Falciparum Plasmodium</em&gt; Merozoites לשימוש בOpsonizing נוגדן מבחני

שיטת טיהור הזיקה הטנדם (TAP) שימשה רבות לבידוד קומפלקסים מקומיים מתמצית תאית, בעיקר איקריוטית, עבור פרוטאומיקה. כאן, אנו מציגים פרוטוקול שיטת TAP המותאם לטיהור קומפלקסים מקומיים למחקרים מבניים.

טיהור של מכלולי Native לחקר מבני בשיטת תג טנדם זיקה

פרוטוקול זה מתאר את הטיהור של F1-ATPase משלב חרקים בתרבית של Trypanosoma brucei. ההליך מניב מורכב מאוד טהור, הומוגנית, פעיל מתאימים ללימודי אנזימטי מבניים.

בידוד F1-ATPase מ פרוטיסטים טפילי Trypanosoma brucei

פרוטוקול זה מבודד ושלפוחיות שלפוחית (EVs) הרחק מריטונים עם יעילות גבוהה ותשואה על ידי שילוב משקעים EV, צפיפות הדרגתי מעבר הצבע, ולכידת חלקיקים כדי לאפשר זרימת עבודה יעילה והפחתה של התחלת דרישות נפח, וכתוצאה מכך ההכנות לשימוש בכל מחקר EV.

טיהור של תשואה גבוהה לחילוץ ההכנות הרחק וירוס

פרוטוקול זה מתאר שיטת טיהור ל-רקומביננטי הסידן מחייב חלבון בחינם S100A12 והוא המושרה היונים שלה עבור גירוי מונוציט אנושי.

טיהור של האדם S100A12 ואת היונים שלה הנגרמת Oligomers עבור גירוי תא החיסון

הפרוטוקול מתאר את ההכנה של עמודי כרומטוגרפיית זיקה של קרום התא (CMAC) עם שברי קרום תאים משותקים המכילים חלבוני קולטן B טרנס-ממברנה tropomyosin kinase פונקציונליים. כמו כן מוסבר השימוש בעמודות CMAC בזיהוי מטבוליטים צמחיים מיוחדים המקיימים אינטראקציה עם קולטנים אלה ונוכחים בתערובות טבעיות מורכבות.

עמודי כרומטוגרפיה של זיקה לממברנת התא לזיהוי מטבוליטים מיוחדים של צמחים המקיימים אינטראקציה עם קולטן Tropomyosin Kinase משותק B

חיידקים מפרישים שלפוחיות חוץ-תאיות בגודל ננומטר (EVs) הנושאות מולקולות ביולוגיות ביו-אקטיביות. מחקר EV מתמקד בהבנת הביוגנזה שלהם, תפקידם באינטראקציות ובמחלות בין מיקרובים למיקרובים ולמיקרובים מארחים, כמו גם ביישומים הטיפוליים הפוטנציאליים שלהם. זרימת עבודה לבידוד מדרגי של כלי רכב חשמליים מחיידקים שונים מוצגת כדי להקל על סטנדרטיזציה של מחקר EV.

בידוד וטיהור מדרגיים של שלפוחיות חוץ-תאיות מ-Escherichia coli וחיידקים אחרים

למדו שיטת טיהור טריפנוזומים אפריקאים מדם באמצעות עמודת מחליף אניונים DEAE cellulose. טכניקה זו משפרת אבחון מחלת השינה ומספקת טפילים מטוהרים למחקר ביוכימי ותרופתי.

טיהור של Trypanosomes חוץ-תאית, כולל אפריקה, מן הדם על ידי אניון-מחליפי (Diethylaminoethyl-תאית עמודות)

גלה סרטונים נוספים