שימוש של שבבי Microfluidic פלסטיק מראש ממדר נוירונים מאתר העיקרי

מכשירים מיקרופלואידיים המשמשים למדר נוירונים הפכו לכלי סטנדרטי במדעי המוח, המאפשר לחוקרים לתפעל פיזית וכימית אזורים תת-תאיים של נוירונים כולל סומאטה, אקסונים, דנדריטים וסינפלזות. התקני תרבות ממודרים אלה יכולים לעזור לענות על שאלות רבות בתחום מדעי המוח, כגון, כיצד אקסונים מתרחבים במהלך הפיתוח כדי ליצור סינפסות, כיצד הסינפסות משפצות ורפורמה בעקבות נזק לאקסון וכיצד תנאים פתולוגיים יכולים להפיץ באופן טרנס-אלפביתי במחלות כגון אלצהיימר. פרוטוקול זה מתאר את השימוש בשבב רב-קומפרמנט מפלסטיק שהורכב מראש עבור מידור תאי העצב העיקריים של חולדות בתרבות.

היתרון העיקרי של שימוש בשבבים אלה הוא שהם מספקים שיטה קלה לשימוש ומשוחזרת מאוד למדר נוירונים. יתרון נוסף הוא כי שבבים אלה מניבים צמיחה בריאה וארוכת טווח של נוירונים ואקסונים מבודדים מאשר מכשירים ממודרים קודמים מבוססי סיליקון והם תואמים באותה מידה עם מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה. מערכות מודל אחרות, כולל תאי גזע אנושיים, מסוגלות גם הן להיות מתורבתות בתוך שבב המידור שהורכב מראש.

כדי להתחיל, מניחים שבב סטרילי, רב קומפילמנט לתוך צלחת פטרי. הוסף 100 microliters של פתרון מראש לציפוי לבאגם השמאלי העליון של השבב ולאפשר לו לזרום דרך הערוץ הראשי לתוך הסמוך היטב. לאחר מכן, מלאו את הבאר השמאלית התחתונה של השבב ב-100 מיקרוליטרים של פתרון הקידוד מראש.

הפעם, המתן חמש דקות כדי לאפשר לפתרון לזרום דרך המיקרו-חריצים. עכשיו, להוסיף 100 microliters של פתרון precoding לבא הימני העליון ולאפשר לו לזרום דרך הערוץ הראשי לתוך באר סמוכה. לאחר 90 שניות, ממלאים את באר הימנית התחתונה ב-100 מיקרוליטרים של תסנובת הקידוד מראש ומורידים את השבב למשך 10 דקות.

בזהירות זווית קצה פיפטה, הרחק הערוץ הראשי ושופע את הפתרון מכל באר. לאחר מכן, מיד להוסיף 150 microliters של PBS לתוך העליון-שמאל גם ולחכות 1 וחצי דקות. לאחר מכן, הוסיפו 150 מיקרוליטרים של PBS ל הבאר השמאלית התחתונה והמתינו חמש דקות כדי לאפשר לנוזל לזרום דרך המיקרו-חריצים.

לאחר מכן, הוסף 150 מיקרוליטרים של PBS ל הבאר הימנית העליונה והימין התחתון, בסדר הזה. לאחר 10 דקות, שוב שאפו את ה- PBS וחזרו על שלבי הכביסה בפעם השנייה. לאחר הכביסה השנייה, שאפו את ה-PBS מה בארות כמו קודם על ידי הליכה על קצה הפיפט, הרחק מפתיחת הערוץ.

לאחר מכן, להוסיף 100 microliters של 0.5 לערבב לכל פתרון פולי-D-Lysine mil, ל באר השמאלית העליונה של השבב. המתן כ ודקה וחצי ולאחר מכן מלא את באר השמאלית התחתונה ב- 100 מיקרוליטרים של פתרון Poly-D-Lysine. חזור על תהליך זה בחצי הימני של השבב.

סגור את צלחת פטרי. לאחר מכן, מניחים את השבב באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. לאחר הדגירה, לשטוף את השבב פעמיים עם PBS כפי שתואר קודם לכן.

לאחר מכן, שאף את PBS מהמכשיר. מיד, להוסיף 100 microliters של מדיה תרבות התא ל הבאר השמאלית העליונה של השבב. לאחר הדקה וחצי, הוסיפו מדיה לתחתון השמאלי היטב.

המתן חמש דקות כדי לאפשר למדיה לזרום דרך החריצים הזעירים ולאחר מכן חזור על תהליך המילוי בצד ימין של השבב. הכן השעיית תא של נוירונים היפוקמפוס עכברוש ניתק על פי פרוטוקולים הוקמה. הסר את רוב המדיה בכל באר של השבב אבל להשאיר את הערוצים מלאים.

לאחר מכן, מיד לטעון חמישה microliters של ההשעיה התא לתוך הבאר הימנית העליונה ועוד חמישה microliters של השעיית תאים באר הימנית התחתונה. בעת טעינת התאים, הצבע על קצה הפיפסה לכיוון הערוץ הראשי. לאחר טעינת התאים, להעביר את השבב לשלב מיקרוסקופ ולוודא כי הנוירונים נמצאים בערוץ הראשי.

לאחר המתנה של חמש דקות להצמדת התאים, הוסיפו כ-150 מיקרוליטרים של מדיית תרבות עצבית לכל אחת מה בארות הימניות העליונות והתחתונות. לאחר מכן, הוסף 150 מיקרוליטרים של מדיה לכל אחת מה בארות השמאליות העליונות והתחתונות. מכסים את צלחת פטרי ומ מניחים את השבב במגש לח ב-5% פחמן דו-חמצני, חממה של 37 מעלות צלזיוס.

ראשית, הסר 20 מיקרוליטרים מה באר השמאלית התחתונה של תא האקסונאלי והצב אותו לתוך באר הימנית העליונה של התא סומטי. המתן שתי דקות לזרימה בתוך כל ערוץ כדי לצייד. לאחר מכן, להסיר 50 microliters של מדיה מן התא האקסונאלי, ולהוסיף 0.3 microliters של אחד מילימול Alexa Fluor 488 הידרזיד למדיה זו.

פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב את הפתרון ולאחר מכן להחזיר את התקשורת המכילה את הצבע הפלואורסצנטי בחזרה לתוך תא האקסון. בשלב זה, מניחים את השבב על המיקרוסקופ והתמונה כרצונם. כדי לבצע אקסוטומיה בתוך השבב, ראשית, להסיר את המדיה מן התא האקסוני, שמירה על קצה פיפטה הרחק מהכניסה של הערוץ הראשי.

אחסן את המדיה שהוסרה בצינור צנטריפוגה לעת עתה. לאחר מכן, מניחים את פיפטה השאיפה ליד, או הכניסה של הערוץ הראשי של התא האקסונאלי ושואף את התא האקסוני לחלוטין. המשך לשוגם את האזור למשך שעה עד שתי דקות.

החלף את תא האקסונאלי במדיה המאוחסנת. ודא כי הפתרון מוסר לחלוטין מהתא ואת האקסונים מנותקים על ידי התבוננות המדגם תחת מיקרוסקופ. לאחר מכן, לכסות את השבב ולהחזיר אותו לחממה.

כדי להתחיל immunostaining פלואורסצנטי, להסיר את רוב התקשורת מהשבב, שמירה על התאים הפנימיים hydrated. מיד, להוסיף 100 microliters של פתרון קיבעון ל בארות העליונות של תאים אקסונאליים סומטיים. לאחר דקה אחת, מוסיפים 100 מיקרוליטרים של פתרון קיבוע ל הבאר התחתונה ומקבעים את התאים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.

הסר את רוב הפתרון מן בארות מיד, להוסיף 150 microliters של PBS לכל בארות העליון של תאים אקסונאליים סומטיים. המתן שתי דקות עד שה- PBS יזרום לתוך בארות התחתונות, ולאחר מכן, הסר את ה- PBS ושטוף את בארות פעמיים נוספות באמצעות אותו תהליך. לאחר שטיפה האחרונה, להסיר את רוב PBS מן הבארים של השבב ומיד, להוסיף 150 microliters של PBS עם 0.25% טריטון x-100 לכל הבארים העליונות של התאים האקסונאליים והסומטיים.

המתן 15 דקות ולאחר מכן, להסיר את רוב הנוזל מן בארות. מיד, להוסיף 150 microliters של פתרון חסימה לכל בארות העליון של תאים אקסונאליים סומטיים. לאחר 15 דקות, להסיר את רוב הנוזל מן הבארות מיד, להוסיף 100 microliters של פתרון הנוגדן העיקרי, לכל הבארות העליונות של תאים אקסונאליים סומטיים.

מכסים את השבב כדי למזער את האידוי ולהידגר את התאים בנוגדן העיקרי במשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לשטוף את השבב על ידי הסרת רוב הפתרון ומיד הוספת 150 microliters של PBS לכל בארות העליון של התאים האקסונאליים והסמטיים. לאחר חמש דקות, להסיר את PBS משתי בארות ולחזור על לשטוף פעמיים נוספות.

עכשיו, להסיר את רוב הנוזל מן בארות מיד, להוסיף 100 microliters של נוגדנים משניים PBS, לכל בארות העליון של תאים אקסונאליים סומטיים. מכסים את השבב כדי למזער את האידוי ולהידגר את השבב במשך שעה בטמפרטורת החדר. כפי שהוצג קודם לכן, לשטוף את השבב שלוש פעמים עם PBS אז, לטעון ולדמיין את השבבים כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה.

מוצג כאן, הוא השוואה זה לצד זה של נוירונים גדל על שבבי פלסטיק והתקני PDMS. צמיחה עצבית דומה בתוך שתי הפלטפורמות עד 15 ימים בתרבות, אבל בגילאי תרבות ארוכים יותר, אקסונים מבודדים בתוך שבב הפלסטיק, נראים בריאים יותר עם פחות מכות. כדי להמחיש עוד יותר אקסונים בתוך התאים האקסונאליים, דגימות אלה היו גם immunostained עבור בטא tubulin III, אשר מראה צמיחה אקסונאלית בריאה בתוך שבבי פלסטיק ב 22 ימים בתרבות.

כתמים נוספים עם דגימות של 24 יום מראה נוירונים הגדלים בשבבי הפלסטיק כדי לבטא הן את סמנים סינפטיים סינפטית סינפסית, vGlut1 ו vGat. הנה שני סמנים סינפטיים בשילוב עם מדרדר שכותרתו נוירונים mCherry. כדי להדגים את התאמתו של שבב זה ללימודי פציעה והתחדשות אקסון, נוירונים מדרדר שכותרתו דימוי לפני ו 24 שעות לאחר אקסוטומיה.

נורת נסיגה ואקסון התחדשות שניהם ניכרים בעקבות אקסוטומיה. תוצאות אלה שוות ערך לנתונים שפורסמו באמצעות התקנים מבוססי PDMS. שבבי multicompartment קלאסיים מספקים אפשרות קלה לשימוש למדר נוירונים המספקים תרבות נוירונים לטווח ארוך, אשר נשארים קיימא במשך יותר משלושה שבועות.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לזרוע מספר מתאים של נוירונים ולוודא החממה שלך הוא לח היטב במהלך התרבות.