הפוך שעתוק לולאה-בתיווך איזותרמי הגברה (RT-המנורה) Assay Zika וירוס, ניקיון בגנים שתן, סרום, ודוגמאות יתוש
14 בספטמבר 2018
פרוטוקול זה מספק שיטה יעילה, בעלות נמוכה לזהות וירוס Zika או שליטה מטרות בדגימות שתן וסרום אנושי או יתושים על ידי שעתוק במהופך בתיווך לולאה איזותרמי הגברה (RT-המנורה). שיטה זו אינה דורשת בידוד RNA והוא יכול להיעשות תוך 30 דקות.
שיטה זו יכולה לקבוע במהירות אם דגימות מכילות וירוס זיקה. זה שימושי עבור נשים בהריון, זוגות מנסים להרות, או מעקב אחר אוכלוסיות יתושים מקומיות בסיכון לזיהום זיקה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שזה מהיר, קל, אינו דורש ציוד יקר, והוא יכול להיעשות ללא צעד בידוד RNA.
ההשלכות של טכניקה זו להרחיב לקראת אבחון של זיהום זיקה, כי זיהום במהלך ההריון קשורה הפלה, לידה שקטה, ומומים מולדים חמורים אחרים, מומים מולדים נוירולוגיים מולדים. למרות שיטה זו יכולה לספק תובנה לתוך זיקה, זה יכול להיות מיושם גם על מחלות זיהומיות אחרות כגון דנגי, chikungunya, או וירוס הנילוס המערבי באמצעות פריימרים ספציפיים לנגיף. כדי להתחיל, reconstitute כל פריימר RT-LAMP במים כיתה מולקולרית לריכוז סופי של 100 micromolar.
בקצרה מערבולת הפתרון פריימר כדי להבטיח את הפתרון הוא הומוגני. צנטריפוגה במשך כחמש שניות במהירות המרבית כדי לאסוף את הפתרון פריימר. לאחר מכן הכינו תערובת פריימר RT-LAMP 10x כמתואר בטבלה 2 של פרוטוקול הטכנולוגיה.
וורטקס בקצרה כדי להבטיח הומוגניות. וצנטריפוגה לזמן קצר במהירות מקסימלית כדי למנוע כל אובדן. לאחסן את פריימרים במינוס 20 מעלות צלזיוס, בין שימושים, הימנעות כל מחזורי הפשרה הקפאה.
לדגימות שתן אנושיות, יש להשתמש בשתן טרי, שתן קפוא או שתן בחומר משמר. להפשיר דגימות קפואות על קרח לפני השימוש. דגימות סרום אנושיות צריכות להיות טריות או קפואות, בעוד שקווי תאים נגועים ב- ZIKV צריכים להכיל lysates מדיה או תאים מותנים.
לבסוף, עבור יתושים Aedes aegypti, להשתמש פקות שלמות, טרי או קפוא. להפשיר כל אוכלוסיות יתושים קפואות על קרח. מניחים יתוש בודד ב 100 microliters של PBS.
באמצעות טיפ P10 פיפטה למחוץ את היתוש 10 פעמים, הומוגניזציה אותו כדי ליצור ליזאט יתוש גס. בקצרה צנטריפוגה lysate הגולמי כדי גלולה כל פסולת ולהשתמש supernatant לניתוח RT-LAMP במורד הזרם. כדי להתחיל, הכן תגובת ערבוב מאסטר RT-LAMP על קרח עבור כל פריימר להגדיר לשמש, כמו חלוקה לרמות על ידי טבלה שלוש בפרוטוקול של טק.
Vortex כל מדגם כדי להבטיח שהוא מעורבב היטב. ואז לסובב אותם בקצרה למטה כדי למנוע אובדן נפח. עבור כל תגובה, פיפטה 23.0 microliters של RT-LAMP מאסטר לערבב לתוך צינור PCR 200 מיקרוליטר.
לאחר מכן, הוסף שני מיקרוליטרים של מדגם כדי להביא את הנפח הכולל ל 25.0 microliters. השתמש במים כיתה מולקולרית עבור שליטה שלילית, וודא לכלול שליטה חיובית. באופן אופציונלי, כלול תגובת בקרת ספציפיות של arbovirus הקשורים כגון וירוס דנגי, כמתואר בפרוטוקול של טק.
באמצעות בלוק חום, אמבט מים, או תרמוצ'ילר, מחממים את הדגימות ב 61 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. לאחר מכן, להגדיל את החום ל 80 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות כדי לחמם לנטרל את הפולימראז. בצע את ניתוח RT-LAMP בשטח סגור נפרד.
מדללים את צבע חומצת הגרעין הפלואורסצנטית 1 עד 10 במאגר TAE. הוסף שני micorliters של פתרון צבע חומצת גרעין פלואורסצנטי 12 micorliters של תגובת RT-LAMP. להעריך את התגובות RT-LAMP חזותית על ידי חיפוש נוכחות של שינוי צבע.
באופן אופציונלי, השתמש במצלמה כדי לצלם תמונות של תגובות RT-LAMP על רקע לבן. לאחר מכן, למקם את הדגימות תחת 302 ננומטר אור UV כדי לאשר את נוכחותם של מוצרי RT-LAMP על ידי פלואורסצנטיות. השתמש במצלמה כדי לצלם תמונה של התוצאה.
כדי להתחיל לבצע אלקטרופורזה לשפוך 2% ג'ל agarose במאגר 1x TAE עם כתם חומצת גרעין להדמיה. הוסף חמישה מיקרוליטרים של סולם דנ"א בנתיב הראשון כדי להשוות את המשקולות המולקולריות. עבור כל תגובת RT-LAMP, יש לערבב 13 מיקרוליטרים של תערובת תגובת RT-LAMP עם שני מיקרוליטרים של צבע טעינת דנ"א.
טען את תערובת ה-15 מיקרוליטר הזו. מפעילים את הג'ל ב-90 וולט במשך 90 דקות או עד שהרצועות מופרדות. תמונה עם 302 ננומטר אור UV.
בסיום, יש להיפטר מתגובות RT-LAMP בשקיות אטומות כפולות. במחקר זה, שלוש שיטות שונות מנוצלות כדי לנתח תגובות RT-LAMP. בעת שימוש חומצת גרעין פלואורסצנטית צבע תגובות חיוביות להיות צהוב-ירוק בצבע, בעוד תגובות שליליות מופיעות כתום.
צבע זה גם תוצאות אות פלואורסצנטי כאשר דגימות נרגשים על ידי אור UV. לבסוף, תגובות RT-LAMP ניתן לרוץ על ג'ל אגרוז. לתגובות חיוביות של RT-LAMP יהיה דפוס פסים, בעוד שלתגובות שליליות לא יהיו להקות דנ"א.
שיטות אלה משמשות להדגים את הספציפיות של תגובת ZIKV RT-LAMP. רק לשליטה המולקולרית של ZIKV יש תגובת RT-LAMP חיובית. יתר על כן, בעוד ZIKV מזוהה הן בשתן והן בסרום של חולה עם זיהום ZIKV ידוע, זה לא נראה בחולה שליטה אסימפטומטית ללא זיהום ZIKV.
הדגימות נבדקות לאחר מכן עבור rRNA 18S אנושי. רק הדגימות שנלקחו מחולים נראים חיוביים עבור 18S rRNA. דגימות יתושים ניתן לבדוק באופן דומה עבור ZIKV או בקרת איכות RT-LAMP AEDAE.
רק השליטה המולקולרית החיובית עבור ZIKV והיתוש הנגוע ב- ZIKV נראים חיוביים עבור ZIKV. עם זאת כל היתושים חיוביים עבור AEDAE על ידי RT-LAMP. לאחר השליטה, טכניקה זו יכולה להיעשות בתוך פחות מ -30 דקות אם היא מבוצעת כראוי.
חשוב לזכור שתגובות RT-LAMP נוטות לתגובות חיוביות שגויות. שלבי מניעה כוללים שימוש ב- DNA תרמולאבילי uracil בתגובות, שימוש בזרימת עבודה מצדדים, ביצוע ניתוח בחלל נפרד, והפחתת צינורות הגברה פוסט זמן פתוחים. בעקבות הליך זה ניתן לבצע שיטות אחרות כמו QPCR על מנת לענות על שאלות נוספות, כמו כמה עותקים הנגיף, או מטרות אחרות, נמצאים המדגם.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה צריך הבנה טובה של איך להשתמש RT-LAMP כדי לזהות וירוס זיקה ובקרות היעד בשתן האנושי בסרום, כמו גם יתושים. אל תשכח כי עבודה עם וירוס זיקה וכתם חומצת גרעין יכול להיות מסוכן מאוד, אמצעי זהירות כגון לבישת כפפות תמיד צריך לנקוט בעת ביצוע הליך זה. בהתחשב הקשר של זיהום וירוס זיקה עם מומים מולדים, נשים בהריון, מנסה להרות, או שותפים של נשים אלה, צריך למזער באופן משמעותי את החשיפה למעבדה שלהם וירוס זיקה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מספק שיטה מהירה וחסכונית לזיהוי נגיף הזיקה (Zika virus) בדגימות של שתן אנושי, סרום או ביתושים, באמצעות הגברה איזותרמית מתווכת לולאה עם שעתוק הפוך (RT-LAMP). יתרונה של הטכניקה הוא שאינה דורשת בידוד RNA וניתן להשלימה תוך כ-30 דקות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- וירולוגיה
- מחלות זיהומיות
- טכניקות אבחנתיות
רקע
- נגיף הזיקה מהווה סיכונים בריאותיים משמעותיים, במיוחד במהלך ההיריון.
- הדבקה עלולה להוביל למומים מולדים ולפגמים נוירולוגיים חמורים.
- שיטות אבחנה נוכחיות עשויות להיות גוזלות זמן ויקרות.
- RT-LAMP מציעה חלופה מהירה לזיהוי נגיף הזיקה.
מטרת המחקר
- לספק כלי אבחוני מהיר לזיהוי נגיף הזיקה.
- להקל על ניטור אוכלוסיות פשפשים הנמצאות בסיכון להידבקות בזיקה.
- לתמוך בבריאות הרבייה באמצעות סיוע באבחון זיהום בנגיף הזיקה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הגברה איזותרמית מתווכת לולאה עם שעתוק הפוך (RT-LAMP).
- ניתוח דגימות משתן אנושי, סרום ויתושים.
- שימוש בפריימרים ספציפיים לנגיף לצורך זיהוי.
- זמן עיבוד מהיר של כ-30 דקות.
תוצאות עיקריות
- גילוי יעיל של נגיף הזיקה בסוגי דגימות שונות.
- השיטה הוכחה כידידותית למשתמש וכלכלית.
- היעדר הצורך בבידוד RNA מפשט את התהליך.
- פוטנציאל ליישום עבור נגיפים אחרים כגון דנגי וצ'יקונגוניה.
מסקנות
- RT-LAMP הוא כלי מבטיח לאבחון מהיר של נגיף זיקה.
- השיטה יכולה לשפר את מאמצי הניטור של נגיף זיקה ונגיפים קרובים לו.
- מחקרים נוספים עשויים להרחיב את השימוש בשיטה למחלות זיהומיות אחרות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
גילוי מהיר של נגיף זיקה במיותרים קליניים ובמדגמי וקטורים, ללא צורך בציוד מורכב, תומך בהתערבות מוקדמת בבריאות הרבייה ובניטור התפרצויות. שיטת RT-LAMP מאפשרת ביצוע בדיקות מבוזרות ללא צורך במיצוי RNA, ובכך מקטינה את הזמן עד לקבלת התוצאה ואת העומס התשתיתי. גישה זו מחזקת את הביטחון החזוי באימות המטרה עבור פיתוח תרופות אנטי-ויראליות ואסטרטגיות לבקרת וקטורים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה תפקודית של נוכחות נגיפים בנזילות ביולוגיות אנושיות וברקמות יתוש כדי לאשר מעורבות של המטרה.
- ערך תפעולי: מבטל את שלב בידוד ה-RNA, ובכך מפשט את זרימת העבודה לסריקה של דגימות קליניות בסריקה רחבה.
- ערך חזוי: מספק קריאה איכותנית למיון דגימות לצורך כימות או ריצוף בהמשך.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: משתמש בפריימרים ספציפיים לנגיף כדי לזהות ZIKV, עם ספציפיות מוכחת מול ביקורות א-סימפטומטיות ומול ארבו-נגיפים קרובים.
- ערך תפעולי: תואם לזיהוי חזותי באמצעות שינוי צבע או פלואורסצנציית UV, מה שמאפשר פורמטים של בדיקה במשאבים מוגבלים.
- סקילביליות: תומך בבדיקה מאוכלסת (pooled testing) של הומוגנאטים של פשיצים ליישומי מעקב.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מזהה ZIKV בשתן ובסרום של מטופלים נגועים, ובכך קובע רלוונטיות קלינית להערכת סיכון להעברה אנכית.
- ערך תפעולי: עושה שימוש בגנים של תמיכה (18S rRNA בבני אדם, actin ביתושים) כביקורות פנימיות לאימות של תקינות הדגימה.
- ערך ניבוי: מאפשר ניטור לאורכי כדי של דינמיקת העומס הוויראלי במערכות מודל ללא דגימה פולשנית.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
שיטת RT-LAMP משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות ראשונית בביולוגיה של וקטורים ועד להערכה פרה-קלינית של מועמדים לאנטי-ויראליים, במיוחד במקרים בהם נדרש מיון מהיר של דגימות.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בתיקוף המטרה על ידי אישור נוכחות נגיפית בשתן, בסרום ובדגימות יתוש כדי לבחון נתיבי הדבקה.
- סינון: מאפשרת הכנת דגימות המוכנות לבדיקה עם קריאות ויזואליות או פלואורסצנטיות לתאימות עם סריקות בשנייה גבוהה (high-throughput).
- אנליטיקה: מייצרת נתונים בינאריים (חיובי/שלילי) ונתונים חצי-כמותיים באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל לניתוח תנאים השוואתיים.
- מחקר תרגומי: מגשרת בין זיהוי בדגימות אנושיות למחקרים מכניסטיים של סיכון מולד במודלים פרה-קליניים.
- שימוש חוזר ארגוני: מסגרת לתכנון פריימרים המאפשרת התאמה מהירה לארבו-נגיפים מתהוותים (למשל, דנגי, צ'יקונגוניה) תוך שימוש באותו פרוטוקול ליבה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית בזיהוי נגיפי על ידי אספקת קריאה ספציפית שאינה דורשת ציוד.
- ערך תפעולי: מאפשר בדיקה מבוזרת עם מינימום מכשור (בלוק חימום או אמבט מים).
- ערך אסטרטגי: מאיץ החלטות go/no-go בסריקת תרופות נוגדות נגיפים על ידי אישור מהיר של מודולציית המטרה.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף תרכובות מותאם-סיכון על בסיס מעורבות המטרה במטריצות רלוונטיות קלינית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בביולוגיה מולקולרית בתכנון פריימרים וטיפול בחומצות גרעין.
- נחוץ מכשיר לדגירה תרמית (61°C למשך 30 min, 80°C למשך 10 min) ומאיר UV לצורך תיקוף.
- דורש זרימת עבודה מופרדת למניעת זיהום של אמפליקונים ותוצאות חיוביות שגויות.
- דורש אופטימיזציה עבור סוגי דגימות שונים (שתן, סרום, ליזט של יתוש) כדי להתחשב במעכבים.
- מוגבל לפלט איכותני או חצי-כמותי, אלא אם הוא משולב עם qPCR לכימות העומס הוויראלי.
