Name: הפוך שעתוק לולאה-בתיווך איזותרמי הגברה (RT-המנורה) Assay Zika וירוס, ניקיון בגנים שתן, סרום, ודוגמאות יתוש (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: למדו לזהות במהירות נגיף זיקה בשתן, סרום ויתושים באמצעות שיטת RT-LAMP. שיטה זו אינה דורשת בידוד RNA ומסתיימת בכ-30 דקות, מה שהופך אותה לכלי אבחון מהיר וחסכוני.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי תרומה פילנתרופית משפחה מורין, רונלד הירש שדה מכון מדעי המח, כנסיית מריה הקדושה של מישיגן. התורמים שחיים היה אין תפקיד תכנון המחקר, איסוף נתונים, ניתוח, ההחלטה לפרסם או אופן ההכנה של כתב היד. אנו מודים גם ד ר ברנדט Zwaans, אליהו וורד עבור שלהם סקירה ביקורתית של כתב היד.

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי המוסדיים סקירה לוח (IRB) של בריאות בומונט. כל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות הרלוונטיים ולתקנות.
התראה: כל חומר העלול זיהומיות צריך להיות מטופל על פי תקני אבטחה ברמה 2 כולל השימוש של ציוד מגן אישי. כל הנהלים, אשר עשויה לייצר תרסיס צריכה להתבצע בתוך ארון אבטחה. בנוסף, עבודה עם יתושים חיה צריכה להתבצע במתקן המתאים של פרוקי-רגליים הבלימה רמה 1-3.... בהתחשב האגודה של זיהום ZIKV עם מומים מולדים, נשים בהריון, מנסה להרות, או השותפים של נשים אלו צריכים באופן משמעותי לצמצם את חשיפתם מעבדה ZIKV. הובלה של דגימות ZIKV מסווגים בארצות הברית קטגוריה B חומרים ביולוגיים לפי מחלקה של מסוכנים חומרים תקנות התעבורה (49 CFR Part 171-180) ולכן משלוח דוגמאות צריך לדבוק אלה הנחיות. ייבוא לתוך biospecimens ארצות הברית של ZIKV דורשת מרכזי לבקרת מחלות ומניעתן (CDC) להתיר ייבוא. ייבוא של כל פרוקי רגליים זה יכול לשמש כמו וקטור לשידור ZIKV, גם אם הם לא נדבקו, דורש אישור מחלקת החקלאות של ארצות הברית (USDA). מידע זה הוא הנוכחי בזמנו של הפרסום. המלצות עדכניות ניתן למצוא ב- https://www.cdc.gov/zika/laboratories/lab-safety.html.
הערה: RT-המנורה תגובות נוטים שיעור גבוה יותר של תגובות חיוביות כוזבות, ולכן יש לנקוט אמצעי זהירות בתכנון ניסיוני. כל ביצוע של RT-המנורה תגובות הקמה עליך להשתמש פיפטות המיועד וטיפים מסנן. באופן אידיאלי, יש להקים זרם עבודה לרוחב. במידת האפשר, אנליזה והדמיה (סעיף 5) צריך להתרחש בחדר סגור נפרד כדי למנוע זיהום. הפתיחה של מבחנות המכילות מוצרים RT-המנורה צריכה להישמר עד למינימום.
1. RT-המנורה תחל הכנה
<ol><li>לשקם כל פריימר RT-המנורה lyophilized במים ברמה מולקולרית כדי ריכוז סופי של 100 מיקרומטר (טבלה 1). בקצרה מערבולת הפתרון פריימר כדי להבטיח פתרון הומוגני ולסובב בקצרה את הפתרון במהירות המרבית ומפרידה מלמעלה בטבלה כדי לאסוף את כל פתרון פריימר.</li>
	<li>הכינו 10 x RT-המנורה תמהיל פריימר של תחל ב- FIP, ביפ, F3, B3, אם ו LB באמצעות אמצעי האחסון בטבלה מס ' 2. בקצרה מערבולת הפתרון פריימר כדי להבטיח פתרון הומוגני, בקצרה ספין למטה הפתרון במהירות המרבית ומפרידה מלמעלה בטבלה כדי למנוע אובדן. הערה: פריימר RT-המנורה להגדיר עבור Ae. aegypti אקטין (AEDAE) אינו מכיל פריימר ליברות (primers לופ אינם תמיד הכרחי לתגובות RT-המנורה). במקרה זה, להחליף את אמצעי האחסון פריימר ליברות כיתה מולקולרית מים.</li>
	<li>לאחסן את תחל ב-20 ° C בין שימושים ולהימנע מחזורים חינם-הפשרה.</li>
</ol>2. הכנת הדוגמא
<ol><li>
עבור דגימות שתן: להשתמש שתן טרי, קפוא שתן או שתן חומר משמר. עבור מדגם טרי או קפוא: מיד תוצאה לדגימה אחרי האוסף 10 דקות ב 700 x g, ו השתמש את תגובת שיקוע לניתוח או להקפיא ב-80 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי. הפשרת דגימות קפוא בקרח לפני השימוש.</li>
	<li>
לדגימות בנסיוב אדם: השתמש גם הדוגמאות סרום טרי או קפוא.</li>
	<li>
עבור ZIKV נגוע שורות תאים: להשתמש במדיה ממוזגים או תא lysates. הערה: נטול תאים ממוזגים מדיה Ae. albopictus C6/36 תאים 8 ימים לאחר הפגיעה יכול לשמש כפקדי חיובי לתגובות ZIKV RT-המנורה.</li>
	<li>
Aegypti Ae. היתושים: להשתמש גם הגוויות יתושים שלם טרי או קפוא. הפשרת יתושים קפוא בקרח. להכין יתוש גולמי lysate על-ידי הצבת של יתוש בודדים µL 100 של באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS), homogenize על ידי ריסוק היתוש 10 פעמים עם טיפ pipet P10 (איור 1). בקצרה centrifuge את lysate כדי הצניפה נפולת הגולמי. השתמש את תגובת שיקוע לניתוח RT-המנורה במורד הזרם. הערה: בקרת חיובי יכול להיווצר באווירה מעבדה ע י הדבקה הנשי יתושים באמצעות intrathoracic microinjection במקבילות גנום3 כ 10 של וירוס באמצעי אחסון של 200 nL קצירת היתוש 5 ימים לאחר הפגיעה.</li>
</ol>3. להכין מיקס מאסטר RT-מנורה
<ol><li>להכין תגובה מיקס מאסטר RT-המנורה על קרח כל פריימר מוגדר לשמש באמצעות מדריך נפח בטבלה3. הערה: השימוש של thermolabile אורציל דנ א Glycosylase (UDG) מסייע במניעת תוצאות חיוביות שגויות.</li>
	<li>מערבולת בקצרה על מנת להבטיח כי כל דוגמאות מעורבבים היטב, ואז לסובב למטה בקצרה כדי למנוע אובדן נפח.</li>
</ol>4. RT-המנורה Assay
<ol><li>
Pipet 23.0 µL של המיקס RT-המנורה הראשית לכל תגובה לתוך צינור PCR 200 µL. הוסף µL 2.0 מדגם (שתן, סרום או יתוש גולמי lysate תגובת שיקוע כפי שמתואר בשלב 2). זה יביא את הנפח הכולל µL 25.0 לכל תגובה RT-המנורה. עבור הפקד שלילי, להשתמש במים ברמה המולקולרית. כוללות פקד חיובי. הערה: מניות רגיל או וירוס ה-PCR של תגובת שיקוע של שורות תאים נגועים יכול לשמש כפקד חיובי.<ol>
<li>אופציונלי: כוללים בקרת ירידה לפרטים תגובה של arbovirus נלווים כגון וירוס דנגה (DENV). הכנת המדגם כמתואר בשלב 2 לפי סוג הדגימה. להוסיף µL 2.0 של הפקד ירידה לפרטים µL 23.0 של המיקס RT-המנורה הראשית לתוך צינור PCR 200 µL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>מחממים את הדגימות ב 61 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות באמצעות בלוק חימום, תנורים או thermocycler.</li>
	<li>חום לבטל את פולימראז על-ידי חימום עד 80 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.</li>
</ol>5. RT-המנורה ניתוח
הערה: לבצע ניתוח RT-המנורה חלל נפרד המצורף.
<ol><li>
לאחר הדגירה, לגשת RT-המנורה תגובות ויזואלית על ידי מחפש את הנוכחות של שינוי צבע.
	<ol>
<li>לדלל את חומצת גרעין פלורסנט לצבוע 1:10 במאגר טה (40 מ"מ טריס, חומצה אצטית 20 מ מ 1 מ"מ EDTA). התראה: כל כתם חומצת גרעין נקשר חומצות גרעין, ולכן הוא חומר מסרטן. ללבוש כפפות בעת הטיפול.</li>
		<li>כדי µL 12 התגובה RT-המנורה, להוסיף 2 µL של דילול צבעי פלורסנט חומצת גרעין. הערה: תגובות שליליות יהיה כתום, תגובות חיוביות יהיה צהוב/ירוק בצבע.</li>
		<li>אופציונלי: לצלם תמונות של RT-המנורה תגובות על רקע לבן בעזרת מצלמה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>במקום הדגימות תחת 302 nm UV אור לאשר הנוכחות של RT-המנורה מוצרים על-ידי קרינה פלואורסצנטית. לצלם התוצאה בעזרת מצלמה. הערה: תגובות חיוביות RT-המנורה יהיה הפלט של פלורסנט. התראה: ללבוש מגן גוגל או פנים העין מגן UV בעת עבודה עם אור UV.</li>
	<li>
אופציונלי: לאשר הנוכחות של מוצרים RT-המנורה על ידי ביצוע בג'ל על הדגימות.
	<ol>
<li>יוצקים 2% agarose ג'ל במאגר x TAE 1 עם כתם חומצת גרעין עבור פריט חזותי. התראה: כל כתם חומצת גרעין נקשר חומצות גרעין, ולכן הוא חומר מסרטן. ללבוש כפפות בעת הטיפול.</li>
		<li>הוסף µL 5 של סולם הדנ א במסלול הראשון כדי להשוות את המשקולות מולקולרית.</li>
		<li>עבור כל תגובה RT-המנורה, מערבבים µL 13 תערובת התגובה RT-מנורה עם 2 µL של ה-DNA בטעינת צבע. לטעון את התערובת 15 µL המכיל את ה-DNA בטעינת צבע.</li>
		<li>הפעל את הג'ל על 90 V במשך 90 דקות או עד הלהקות מופרדים ותמונה עם 302 אור UV ננומטר. הערה: תגובות חיוביות RT-המנורה יש דפוס laddering. תגובות שליליות RT-המנורה לא להכיל להקות.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. סילוק
<ol><li>תשליך RT-המנורה תגובות בשקיות חתומות כפול. תעשה לא אוטוקלב זה ייתכן aerosolize המוצרים RT-המנורה, שמוביל תגובות חיוביות כוזבות בעתיד.</li>
</ol>

<ol><li>Petersen, L. R., Jamieson, D. J., Powers, A. M., Honein, M. A. <a target="_blank" href="https://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMra1602113">Zika Virus.</a> New England Journal of Medicine. 374 (16), 1552-1563 (2016).</li>
<li>Francois, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robustness+of+a+loop-mediated+isothermal+amplification+reaction+for+diagnostic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Federation+of+European+Microbiological+Societies+Immunology+and+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Robustness of a loop-mediated isothermal amplification reaction for diagnostic applications.</a> Federation of European Microbiological Societies Immunology and Medical Microbiology. 62 (1), 41-48 (2011).</li>
<li>Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification+%28LAMP%29+of+gene+sequences+and+simple+visual+detection+of+products%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products.</a> Nature Protocols. 3 (5), 877-882 (2008).</li>
<li>Gandasegui, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rapid-Heat+LAMPellet+Method%3A+A+Potential+Diagnostic+Method+for+Human+Urogenital+Schistosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Library+of+Science+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">The Rapid-Heat LAMPellet Method: A Potential Diagnostic Method for Human Urogenital Schistosomiasis.</a> Public Library of Science Neglected Tropical Diseases. 9 (7), 0003963(2015).</li>
<li>Barkway, C. P., Pocock, R. L., Vrba, V., Blake, D. P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25741643">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays for the species-specific detection of Eimeria that infect chickens.</a> The Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).</li>
<li>Lamb, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Detection+of+Zika+Virus+in+Urine+Samples+and+Infected+Mosquitos+by+Reverse+Transcription-Loop-Mediated+Isothermal+Amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Rapid Detection of Zika Virus in Urine Samples and Infected Mosquitos by Reverse Transcription-Loop-Mediated Isothermal Amplification.</a> Scientific Reports. 8 (1), 3803(2018).</li>
<li>Faye, O., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18674965">One-step RT-PCR for detection of Zika virus.</a> Journal of Clinical Virology. 43 (1), 96-101 (2008).</li>
<li>Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR+inhibitors+-+occurrence%2C+properties+and+removal%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">PCR inhibitors - occurrence, properties and removal.</a> Journal of Applied Microbiology. 113 (5), 1014-1026 (2012).</li>
<li>Poole, C. B., Tanner, N. A., Zhang, Y., Evans, T. C., Carlow, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+brugian+filariasis+by+loop-mediated+isothermal+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Library+of+Science+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of brugian filariasis by loop-mediated isothermal amplification.</a> Public Library of Science Neglected Tropical Diseases. 6 (12), 1948(2012).</li>
<li>Tanner, N. A., Zhang, Y., Evans, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+multiple+target+detection+in+real-time+loop-mediated+isothermal+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Simultaneous multiple target detection in real-time loop-mediated isothermal amplification.</a> Biotechniques. 53 (2), 81-89 (2012).</li>
<li>Chan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+Affordable+and+Portable+Medium-Throughput+Molecular+Device+for+Zika+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Rapid, Affordable and Portable Medium-Throughput Molecular Device for Zika Virus.</a> Scientific Reports. 6, 38223(2016).</li>
<li>Lee, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+Highly+Sensitive+Molecular+Diagnosis+of+Zika+Virus+by+Lateral+Flow+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Simple and Highly Sensitive Molecular Diagnosis of Zika Virus by Lateral Flow Assays.</a> Analytical Chemistry. 88 (24), 12272-12278 (2016).</li>
<li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-Cost+Detection+of+Zika+Virus+Using+Programmable+Biomolecular+Components%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components.</a> Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).</li>
<li>Song, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Instrument-Free+Point-of-Care+Molecular+Detection+of+Zika+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Instrument-Free Point-of-Care Molecular Detection of Zika Virus.</a> Analytical Chemistry. 88 (14), 7289-7294 (2016).</li>
<li>Yaren, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Point+of+sampling+detection+of+Zika+virus+within+a+multiplexed+kit+capable+of+detecting+dengue+and+chikungunya%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Central+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Point of sampling detection of Zika virus within a multiplexed kit capable of detecting dengue and chikungunya.</a> BioMed Central Infectious Diseases. 17 (1), 293(2017).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+sensitive+detection+of+Zika+virus+by+reverse+transcription+loop-mediated+isothermal+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid and sensitive detection of Zika virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification.</a> Journal of Virological Methods. 238, 86-93 (2016).</li>
<li>Priye, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+smartphone-based+diagnostic+platform+for+rapid+detection+of+Zika%2C+chikungunya%2C+and+dengue+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A smartphone-based diagnostic platform for rapid detection of Zika, chikungunya, and dengue viruses.</a> Scientific Reports. 7, 44778(2017).</li>
</ol>

ארוחת ליל סדר MBC יש קניין רוחני על שיטות אבחון Zika וירוס. המחברים הנותרים יש אין אינטרסים מתחרים.

וזמינותו ZIKV RT-המנורה המתוארת בעלון זה עבודות נייר באמצעות דגימות של האדם והן יתושים-6. המגבלה של זיהוי היה כ 1 גנום שוות ערך6, אשר אמורה להספיק מאז המטען הנגיפי טיפוסי של חולה סימפטומטי ZIKV נגוע הוא 103 כדי 6 10 PFU/mL7. בנוסף, שיטה זו יכול לזהות ZIKV בדגימות ללא RNA בידוד הראשון וללא הגברה וירוס תרבית תאים. פעולה זו מפחיתה באופן משמעותי את זמן, עלות, הסיכונים הבריאותיים של זה וזמינותו בהשוואה לרביעיית-PCR.
<p...

בשנת 2015, Zika וירוס (ZIKV) צבר תשומת הלב העולמית בולטים כמו מחלה זיהומית של דאגה מפני זיהום במהלך ההריון היה קשור להפלה, לידות, חמור נוירולוגיות מומים מולדים כולל microcephaly, כמו גם אחרים מולדת מומים מולדים1. במקרים נדירים, ZIKV נמצא קשור תסמונת גיליאן. ZIKV מועבר בעיקר על ידי יתושי אאדס; עם זאת, זה יכול גם להיות להתפשט באמצעות מגע מיני1. בהתחשב בכך הזיהום עם ZIKV ללא תסמינים אצל רוב האנשים, או מציג עם מתון תסמינים דמויי שפעת חופפים עם הסימפטומים של זיהום של אחרים arborviruses1, היה צורך עבור שיפור שיטות גילוי מהירה וחסכונית של ZIKV למסך גם אנשים, כמו גם אוכלוסיות יתוש מקומיים.
שעתוק במהופך כמותיים PCR (לרביעיית-PCR) הוא assay אמין לצורך זיהוי ZIKV; עם זאת, טכניקה זו דורש ציוד מיוחד יקר, צוות מיומן, ובידוד RNA מדגם של ריבית. שעתוק במהופך בתיווך לולאה איזותרמי הגברה (RT-המנורה) היא שיטה הגברה חומצת גרעין בשלב אחד מבוסס על טכנולוגיית ה-PCR הדורש רק בטמפרטורת דגירה אחת עקב השימוש לרום DNA פולימראז עם סטרנד מאפייני העקירה. זה עוקף את הצורך thermocycler, מקטין את משך הזמן הדרוש כדי להשלים את הבדיקה. יתרונות נוספים של RT-המנורה כוללים שלה ירידה לפרטים גבוהה, רגישות, חוסן במגוון של רמות ה-pH, טמפרטורות, והתנגדות PCR רבים מעכבי2. יש יחסית נמוכים, ריאגנטים יציבים בטמפרטורת החדר. לאור מאפיינים אלה, RT-המנורה ניתן לפרוס במעבדה או בשטח. ככזה, המנורה תגובות פותחו כדי לזהות מגוון של פתוגנים וסוגים אחרים של זיהום3,4,5. המטרה של פרוטוקול RT-המנורה המתוארת במאמר זה היא לזהות את ZIKV ללא בידוד RNA בדגימות האנושי סרום ושתן באותה מידה כמו יתוש הנגוע יחיד בתוך 30 דקות באמצעות RT-המנורה. בשיטה זו ניתן להחליף לרביעיית-PCR כפי שהוא כלי אבחון רגיש, מהירה שפועל במהירות ובאופן בהגדרות מחוץ למעבדה.

<table><tbody><tr><td>Bst 2.0 WarmStart DNA פולימראז</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>M0537S</td> מאגר הגברה איזותרמית<td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>B0537S</td><td></td></tr><tr><td>WarmStart RTx טרנסקריפטאז הפוך</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>M0380S</td><td></td></tr><tr><td>אנטארקטיקה תרמולאביל UDG</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>M0372S</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>New England Biolabs</td><td>B1003S</td><td></td></tr><tr><td>100 mM dATP פתרון</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>N0440S</td><td>דאוקסינוקלאוטיד N0446S</td></tr><tr><td>100 מ"מ תמיסת dCTP</td><td>ניו אינגלנד ביולאבס</td><td>N0441S</td><td>סט דאוקסינוקלאוטיד N0446S</td></tr><tr><td>100 מ"מ תמיסת dTTP</td><td>ניו אינגלנד ביולאבס</td><td>N0443S</td><td>סט דאוקסינוקלאוטידים N0446S</td></tr><tr><td>100 מ"מ תמיסת dGTP</td><td>ניו אינגלנד ביולאבס</td><td>N0442S</td><td>סט דאוקסינוקלאוטיד N0446S</td></tr><tr><td>100 מ"מ תמיסת dUTP</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>R0133</td><td></td></tr><tr><td>SYBR חומצת גרעין ירוקה I כתם ג'ל</td><td>Invitrogen</td><td>S7563</td><td></td></tr><tr><td>Nancy-520</td><td>Sigma Aldrich</td><td>01494</td><td></td></tr><tr><td>סולם מסת DNA נמוך</td><td>Invitrogen</td><td>10-068-013</td><td></td></tr><tr><td>זיקה בקרת פוסטיב</td><td>מכון רוברט קוך, גרמניה</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1600</td><td></td></tr><tr><td>BlueJuice מאגר טעינת ג'ל</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10816015 פריימרים</td><td>טכנולוגיות DNA משולבות</td><td>מותאמות אישית Oligo</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-Free Water</td><td>Ambion</td><td>AM9938</td><td></td></tr><tr><td>חומר משמר שתן</td><td>Norgen Biotek</td><td>18126</td><td></td></tr><tr><td>ZIKV PCR Standard</td><td>מכון רוברט קוך</td><td>N/A</td><td>Vero E6 תאים סופרנטנטים</td></tr><tr><td>DENV2 גינאה החדשה C בקרת</td><td>קונטיקט ניסוי חקלאי תחנה</td><td>לא ישים</td><td></td></tr></tbody></table>

הפוך שעתוק לולאה-בתיווך איזותרמי הגברה (rt-המנורה) assay zika וירוס, ניקיון בגנים שתן, סרום, ודוגמאות יתוש

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

זיהום בנגיף Zika (ZIKV) יכול להיות אסימפטומטיים במבוגרים, לעומת זאת, זיהום במהלך ההריון יכול לגרום להפלה מולדים נוירולוגיות חמורות. המטרה של פרוטוקול זה היא לזהות במהירות ZIKV בדגימות האדם והן יתושים. תקן הזהב הנוכחי לגילוי ZIKV הוא שעתוק במהופך כמותיים PCR (לרביעיית-PCR); שעתוק במהופך בתיווך לולאה איזותרמי הגברה (RT-המנורה) עשוי לאפשר לבדיקה יותר יעיל, בעלות נמוכה ללא צורך ציוד יקר. במחקר זה, RT-המנורה שימוש לצורך זיהוי ZIKV בדגימות ביולוגיות שונות בתוך 30 דקות, ללא הראשונה לבודד את הרנ א מדגם. טכניקה זו הוכח שימוש ZIKV נגוע סרום ושתן המטופל ולאחר נגוע דגימות יתושים. חומצה ריבונוקלאית ribosomal 18S אקטין משמשים כפקדי בדגימות האדם וכילה נגד יתושים, בהתאמה.

RT-המנורה תגובות ניתן לנתח באמצעות שלוש שיטות שונות. ראשית, עם התוספת של צבע פלורסנט חומצת גרעין, תגובות חיוביות יהיה צהוב/ירוק צבע היכן תגובות שליליות. תופיע כתום בעין בלתי מזוינת. שנית, התוספת של חומצת גרעין פלורסנט לצבוע את התגובה RT-המנורה תוצאות ב אות ניאון כאשר הדגימות שמחים על ידי אור UV. תגובות שליליות לא תהיה אות ניאון לזיהוי מעל כל זריחה רקע שעשויות להופיע בכמויות קטנות של הפקד שלילי. לבסוף, ניתן להפעיל RT-המנורה תגובות על ג'ל agarose. תגובות חיוביות RT-המנורה יש תבנית בעלת רצוע...

פרוטוקול זה מספק שיטה יעילה, בעלות נמוכה לזהות וירוס Zika או שליטה מטרות בדגימות שתן וסרום אנושי או יתושים על ידי שעתוק במהופך בתיווך לולאה איזותרמי הגברה (RT-המנורה). שיטה זו אינה דורשת בידוד RNA והוא יכול להיעשות תוך 30 דקות.

הפוך שעתוק לולאה-בתיווך איזותרמי הגברה (RT-המנורה) Assay Zika וירוס, ניקיון בגנים שתן, סרום, ודוגמאות יתוש

Infection with Zika virus (ZIKV) can be asymptomatic in adults, however, infection during pregnancy can lead to miscarriage and severe neurological birth ...

שיטה זו יכולה לקבוע במהירות אם דגימות מכילות וירוס זיקה. זה שימושי עבור נשים בהריון, זוגות מנסים להרות, או מעקב אחר אוכלוסיות יתושים מקומיות בסיכון לזיהום זיקה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שזה מהיר, קל, אינו דורש ציוד יקר, והוא יכול להיעשות ללא צעד בידוד RNA.ההשלכות של טכניקה זו להרחיב לקראת אבחון של זיהום זיקה, כי זיהום במהלך ההריון קשורה הפלה, לידה שקטה, ומומים מולדים חמורים אחרים, מומים מולדים נוירולוגיים מולדים. למרות שיטה זו יכולה לספק תובנה לתוך זיקה, זה יכול להיות מיושם גם על מחלות זיהומיות אחרות כגון דנגי, chikungunya, או וירוס הנילוס המערבי באמצעות פריימרים ספציפיים לנגיף. כדי להתחיל, reconstitute כל פריימר RT-LAMP במים כיתה מולקולרית לריכוז סופי של 100 micromolar.בקצרה מערבולת הפתרון פריימר כדי להבטיח את הפתרון הוא הומוגני. צנטריפוגה במשך כחמש שניות במהירות המרבית כדי לאסוף את הפתרון פריימר. לאחר מכן הכינו תערובת פריימר RT-LAMP 10x כמתואר בטבלה 2 של פרוטוקול הטכנולוגיה.וורטקס בקצרה כדי להבטיח הומוגניות. וצנטריפוגה לזמן קצר במהירות מקסימלית כדי למנוע כל אובדן. לאחסן את פריימרים במינוס 20 מעלות צלזיוס, בין שימושים, הימנעות כל מחזורי הפשרה הקפאה.לדגימות שתן אנושיות, יש להשתמש בשתן טרי, שתן קפוא או שתן בחומר משמר. להפשיר דגימות קפואות על קרח לפני השימוש. דגימות סרום אנושיות צריכות להיות טריות או קפואות, בעוד שקווי תאים נגועים ב- ZIKV צריכים להכיל lysates מדיה או תאים מותנים.לבסוף, עבור יתושים Aedes aegypti, להשתמש פקות שלמות, טרי או קפוא. להפשיר כל אוכלוסיות יתושים קפואות על קרח. מניחים יתוש בודד ב 100 microliters של PBS.באמצעות טיפ P10 פיפטה למחוץ את היתוש 10 פעמים, הומוגניזציה אותו כדי ליצור ליזאט יתוש גס. בקצרה צנטריפוגה lysate הגולמי כדי גלולה כל פסולת ולהשתמש supernatant לניתוח RT-LAMP במורד הזרם. כדי להתחיל, הכן תגובת ערבוב מאסטר RT-LAMP על קרח עבור כל פריימר להגדיר לשמש, כמו חלוקה לרמות על ידי טבלה שלוש בפרוטוקול של טק.Vortex כל מדגם כדי להבטיח שהוא מעורבב היטב. ואז לסובב אותם בקצרה למטה כדי למנוע אובדן נפח. עבור כל תגובה, פיפטה 23.0 microliters של RT-LAMP מאסטר לערבב לתוך צינור PCR 200 מיקרוליטר.לאחר מכן, הוסף שני מיקרוליטרים של מדגם כדי להביא את הנפח הכולל ל 25.0 microliters. השתמש במים כיתה מולקולרית עבור שליטה שלילית, וודא לכלול שליטה חיובית. באופן אופציונלי, כלול תגובת בקרת ספציפיות של arbovirus הקשורים כגון וירוס דנגי, כמתואר בפרוטוקול של טק.באמצעות בלוק חום, אמבט מים, או תרמוצ'ילר, מחממים את הדגימות ב 61 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. לאחר מכן, להגדיל את החום ל 80 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות כדי לחמם לנטרל את הפולימראז. בצע את ניתוח RT-LAMP בשטח סגור נפרד.מדללים את צבע חומצת הגרעין הפלואורסצנטית 1 עד 10 במאגר TAE. הוסף שני micorliters של פתרון צבע חומצת גרעין פלואורסצנטי 12 micorliters של תגובת RT-LAMP. להעריך את התגובות RT-LAMP חזותית על ידי חיפוש נוכחות של שינוי צבע.באופן אופציונלי, השתמש במצלמה כדי לצלם תמונות של תגובות RT-LAMP על רקע לבן. לאחר מכן, למקם את הדגימות תחת 302 ננומטר אור UV כדי לאשר את נוכחותם של מוצרי RT-LAMP על ידי פלואורסצנטיות. השתמש במצלמה כדי לצלם תמונה של התוצאה.כדי להתחיל לבצע אלקטרופורזה לשפוך 2% ג'ל agarose במאגר 1x TAE עם כתם חומצת גרעין להדמיה. הוסף חמישה מיקרוליטרים של סולם דנ"א בנתיב הראשון כדי להשוות את המשקולות המולקולריות. עבור כל תגובת RT-LAMP, יש לערבב 13 מיקרוליטרים של תערובת תגובת RT-LAMP עם שני מיקרוליטרים של צבע טעינת דנ"א.טען את תערובת ה-15 מיקרוליטר הזו. מפעילים את הג'ל ב-90 וולט במשך 90 דקות או עד שהרצועות מופרדות. תמונה עם 302 ננומטר אור UV.בסיום, יש להיפטר מתגובות RT-LAMP בשקיות אטומות כפולות. במחקר זה, שלוש שיטות שונות מנוצלות כדי לנתח תגובות RT-LAMP. בעת שימוש חומצת גרעין פלואורסצנטית צבע תגובות חיוביות להיות צהוב-ירוק בצבע, בעוד תגובות שליליות מופיעות כתום.צבע זה גם תוצאות אות פלואורסצנטי כאשר דגימות נרגשים על ידי אור UV. לבסוף, תגובות RT-LAMP ניתן לרוץ על ג'ל אגרוז. לתגובות חיוביות של RT-LAMP יהיה דפוס פסים, בעוד שלתגובות שליליות לא יהיו להקות דנ"א.שיטות אלה משמשות להדגים את הספציפיות של תגובת ZIKV RT-LAMP. רק לשליטה המולקולרית של ZIKV יש תגובת RT-LAMP חיובית. יתר על כן, בעוד ZIKV מזוהה הן בשתן והן בסרום של חולה עם זיהום ZIKV ידוע, זה לא נראה בחולה שליטה אסימפטומטית ללא זיהום ZIKV.הדגימות נבדקות לאחר מכן עבור rRNA 18S אנושי. רק הדגימות שנלקחו מחולים נראים חיוביים עבור 18S rRNA. דגימות יתושים ניתן לבדוק באופן דומה עבור ZIKV או בקרת איכות RT-LAMP AEDAE.רק השליטה המולקולרית החיובית עבור ZIKV והיתוש הנגוע ב- ZIKV נראים חיוביים עבור ZIKV. עם זאת כל היתושים חיוביים עבור AEDAE על ידי RT-LAMP. לאחר השליטה, טכניקה זו יכולה להיעשות בתוך פחות מ -30 דקות אם היא מבוצעת כראוי.חשוב לזכור שתגובות RT-LAMP נוטות לתגובות חיוביות שגויות. שלבי מניעה כוללים שימוש ב- DNA תרמולאבילי uracil בתגובות, שימוש בזרימת עבודה מצדדים, ביצוע ניתוח בחלל נפרד, והפחתת צינורות הגברה פוסט זמן פתוחים. בעקבות הליך זה ניתן לבצע שיטות אחרות כמו QPCR על מנת לענות על שאלות נוספות, כמו כמה עותקים הנגיף, או מטרות אחרות, נמצאים המדגם.לאחר צפייה בסרטון זה, אתה צריך הבנה טובה של איך להשתמש RT-LAMP כדי לזהות וירוס זיקה ובקרות היעד בשתן האנושי בסרום, כמו גם יתושים. אל תשכח כי עבודה עם וירוס זיקה וכתם חומצת גרעין יכול להיות מסוכן מאוד, אמצעי זהירות כגון לבישת כפפות תמיד צריך לנקוט בעת ביצוע הליך זה. בהתחשב הקשר של זיהום וירוס זיקה עם מומים מולדים, נשים בהריון, מנסה להרות, או שותפים של נשים אלה, צריך למזער באופן משמעותי את החשיפה למעבדה שלהם וירוס זיקה.

reverse-transcription-loop-mediated-isothermal-amplification-rt-lamp

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

סרטון זה מדגים שיטה כמותית לזיהוי זיהום ויראלי באמצעות PCR שעתוק לאחור בזמן אמת. שלב השעתוק ההפוך ממיר את הרנ"א ל-cDNA, אשר לאחר מכן מוגבר באמצעות מחזורי PCR. נוכחותו של RNA ויראלי במדגם מאושרת על ידי ניתוח עקומות ההגברה והדיסוציאציה של ה- DNA המתקבל מה- PCR.

PCR כמותי בזמן אמת לאבחון זיהומים ויראליים

Zika Virus (ZIKV), פתוגן מתפתח, קשור להפרעות התפתחותיות בעובר ולמיקרוצפליה. הקמת מערכת תרבית תאים זיהומית יעילה היא חיונית למחקרים על שכפול ZIKV כמו גם לפיתוח חיסונים ותרופות. במחקר זה מומחשות ונדונות בדיקות וירולוגיות שונות הנוגעות לזיק"ו.

מערכת תרבית תאי זיהומיות וירוס זיקה ואת<em&gt; במבחנה</em&gt; אפקט מניעתי של אינטרפרונים

זרם מרובב אבחון לאיתור Zika chikungunya, וירוסים דנגה לדרוש הכנת הדוגמא מורכבים ומכשור יקרים, קשה להשתמש בסביבות משאבים נמוכה. אנו מראים אבחון המשתמשת הגברה איזותרמי עם הגששים טרומי לחלוקה ניידים במטרה סטרנד ויוכל להבדיל וירוסים אלה עם רגישות גבוהה.

הגברה איזותרמי מרובבת מבוסס פלטפורמת אבחון לאיתור Zika Chikungunya, קדחת דנגה 1

עבור שליטה יעילה של יתוש נישאים וירוס שידור, הידע של פוטנציאל וקטורי של יתושים בהתאמה הוא עניין מיוחד. אנו מתארים ריור בכפייה כשיטה לנתח מיומנות וקטור של אדס , שלושה taxa כולכית שונים להעברת Zika וירוס.

הכריחו ריור כשיטה לנתח מיומנות וקטור של יתושים

אנו מתארים שיטה להעריך את ההשפעה של הקיימת מראש חסינות מפני וירוס דנגה על זיהום בנגיף Zika באמצעות בנסיוב אדם ראשי תאים אנושיים, כימות זיהום על ידי תגובת שרשרת של פולימראז בזמן אמת כמותית.

כימות של נוגדנים תלויי שיפור של הנגיף Zika בתאי אדם ראשי

הפרוטוקול המוצג יכול לקבוע את היכולת הווקטורית של אוכלוסיות יתושים Aedes aegypti עבור וירוס נתון, כגון זיקה, במסגרת בלימה.

וקטור יכולת ניתוחים על יתושים Aedes aegypti באמצעות וירוס זיקה

בעבודה זו, אנו מתארים את הפרוטוקולים המשמשים בבדיקות מבוססות אנזים מבוססות replicon ויראלי כדי לסנן מעכבים של שכפול וירוס זיקה בפורמט הקרנה תפוקה גבוהה.

בדיקות אנטי-ויראליות בעלות תפוקה גבוהה למסך עבור מעכבי שכפול וירוס זיקה

גישה לאבחון מבוזר, בעלות נמוכה ובקיבולת גבוהה שניתן לפרוס בקהילה לצורך בדיקות מבוזרות היא קריטית למאבק במשברי בריאות עולמיים. כתב יד זה מתאר כיצד לבנות אבחון מבוסס נייר עבור רצפי RNA ויראליים שניתן לזהות באמצעות קורא אופטי נייד.

תכנון ליישום מחקר לפיתוח ותיקוף מטופלים של אבחון מתגי Toehold מבוסס נייר

כאן אנו מציגים פרוטוקול המאפשר אפיון פונקציונלי של תפוקה בינונית עד גבוהה של מבני גנים ומקדם ברקמת גזע משנית של עץ במסגרות זמן קצרות יחסית. הוא יעיל, קל לשימוש וישים באופן נרחב למגוון מיני עצים.

השימוש בניתוח מגזר סומטיים מושרה (ISSA) לימוד גנים ומקדמי המעורבים ביצירת עץ ופיתוח גזע משניים

Islet β מוות תאי מקדים התפתחות של סוכרת מסוג 1, וגילוי תהליך זה עשוי לאפשר התערבות טיפולית מוקדמת. כאן, אנו מספקים תיאור מפורט כיצד למדוד מיני DNA INS שעברו מתילציה דיפרנציאלית בסרום אנושי כסמן ביולוגי למוות של תאי β.

מדידת דיפרנציאלי Methylated<em&gt; אח&quot;י</em&gt; DNA מינים בדגימות אדם סרום כמו מוות של תאים ביומרקר של איילט β

למדו לזהות במהירות נגיף זיקה בשתן, סרום ויתושים באמצעות שיטת RT-LAMP. שיטה זו אינה דורשת בידוד RNA ומסתיימת בכ-30 דקות, מה שהופך אותה לכלי אבחון מהיר וחסכוני.

הפוך שעתוק לולאה-בתיווך איזותרמי הגברה (RT-המנורה) Assay Zika וירוס, ניקיון בגנים שתן, סרום, ודוגמאות יתוש

גלה סרטונים נוספים