דור של תרבויות רקמות אמבריולוגיה תלת-ממד (3D-LTCs) עבור מידול המחלה
12 בפברואר 2019
כאן, אנו מציגים פרוטוקול להכנת פרוסות מלא agarose דיוק-קאט אמבריולוגיה מרקמות החולה resected המתאימים ליצירת ריאות 3D בתרביות רקמה למחלות ריאה אנושיים מודל במחקרים ביולוגי וביו.
שיטה זו מאפשרת חקירה של רקמה אנושית חיה במבנה ובהרכב תלת-מימדי טבעי לתרגום ממצאי מעבדה מרכזיים לטיפולים פוטנציאליים. טכניקה זו מאפשרת במיוחד את הדור של תרבות רקמות רקמה רקמת ריאה אנושית נותק בניתוח או explanted עבור הדמיה של דגימות רקמת ריאה החולה שנפטר בודדים. רקמת ריאה ללא מחלות יכולה לשמש תרבות רקמת 3D כדי מודל מחלות ריאתי ex vivo המאפשר ניתוח של פתומכניזם מוקדם ברזולוציה מרחבית גבוהה.
התחל על ידי הצבת דגימת ריאות חתוך לתוך 15 מיליליטר של מדיום טיפוח בצלחת תרבות סטרילית 15 ס"מ ומגש מתכת סטרילי מכוסה נייר טישו, ולמלא מזרק 30 מיליליטר עם 42 מעלות צלזיוס נמוך נקודת התכה התעוררה. מוציאים את האובטור מקטטר ורידי היקפי ומצמידים את הקטטר למזרק 30 מיליליטר. לזהות ברונכיוס בקוטר 0.5 עד 3 מילימטר ברקמת האוורור בחלק שלם של הרקמה, ולהכניס בעדינות את הצינורית לברונצ'וס ככל האפשר.
השתמש מלקחיים כדי לדחוס את הקיר bronchiole סביב canula, באופן אידיאלי מהדק כל עורק ריאתי סמוך באותו זמן, כדי לאטום את הסימפונות סביב canula ולהשתמש מלחציים כירורגיים כדי למנוע כל דרכי הנשימה הנוספים, כדי למנוע דליפה התעוררה. לאחר מכן, השתמש בממטרים כדי להרים את רקמת הריאה מצלחת התרבות, ולהשתמש במזרק כדי לספק באופן ידני את agarose דרך canula, לא מהר יותר מ 0.3 מיליליטר לשנייה. כאשר רקמת הריאה מתמלאת לחלוטין מבלי לנפח יתר על המידה את הרקמה, מיד להסיר את canula ומהדק את הסמפונוס.
להטביע את הרקמה במדיום תרבות בארבע מעלות צלזיוס במשך 30 דקות כדי להקל על התגבשות אגרוז, ולחזור על הליך מילוי אגרוז עבור כל פתחי סימפונות נוספים. לאחר מכן, לאחסן את חלקי רקמת הריאה מלא אגוארוס בארבע מעלות צלזיוס בינוני עד חיתוך. עבור חיתוך ריאות מדויק לחתוך, לזהות את האזורים מלאים אגרוז מוצק בתוך רקמת הריאה, כי לא לקרוס כאשר לחוץ בעדינות עם פינצטה על החלק התחתון של צלחת תרבות התא.
בלו בלוק 1 עד 1.5 סנטימטר מעוקב של אזור מלא מוצק עם צד אחד עדיין מכוסה pleura, ולהשתמש בדבק cyanoacrylate לחבר את הצד הרבים של כל בלוק רקמה למחזיק רטט. פורסים את כל הדרך דרך בלוק הרקמה הארוך, עד שרק שניים עד שלושה מילומטרים של רקמה נשארים ללא הרקמה. שימוש במטסים להעברת כל קטע 500 מיקרומטר לתוך באר אחת של צלחת 12 באר המכילה מדיום טיפוח, כפי שהם מתקבלים.
כאשר כל הרקמה כבר חתוכה, להעביר את הדגימות מכל באר לתוך מנות תרבות בודדות עשרה סנטימטרים ולמקם אגרוף ביופסיה ארבעה מילימטר orthogonally על פני השטח העליונים של פרוסת ריאות לחתוך דיוק. לאחר מכן, הזזת האגרוף בסיבובים בכיוון השעון ונגד כיוון השעון, להשיג אגרופים רקמה של דגימת הריאות. הצבת כל אגרוף במדיום תרבות תא טרי בארות בודדות של צלחת 96 היטב כפי שהם מתקבלים.
כאשר כל אגרופי הרקמה הושגו, מניחים את הצלחת באינקובטור תרבות התא עד חמישה ימים. Immunolabeling של פיברונקין בגרעיני התא באמצעות Immunofluorescence בתרבות רקמת ריאה 3-D אנושי מאפשר הדמיה של מבנה מכתשי השתמר ex vivo. הטיפול בפרוסת הריאות האנושית חתוכה בקוקטייל ציטוקיני פרופיברוטי למשך 48 שעות וכתוצאה מכך שינויים דמויי פיברוזיס בתרבות הרקמה תלת-מימדית בריאה האנושית, כולל אינדוקציה משמעותית של רכיבי מטריצה חוץ-תאית רלוונטיים לפיברוזיס, קולגן מסוג אחד וגנים פיברונאקטינים.
בנוסף, רמות החלבון של סמן mesenchymal vimentin הם מוסדר בשלושה מתוך ארבעה חולים לאחר טיפול של 3-D רקמת הריאה ניקובים. בעקבות הליך זה, שיטות אחרות כמו ניתוח RNA על ידי PCR כמותי בזמן אמת, או ניתוח חלבון על ידי סופג מערבי, ניתן לבצע כדי להעריך ביטוי גנים וחלבון בהתאמה בתוך הרקמה. לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך למחקרים בתחום הפולמונולוגיה הניסיונית, להבלטת ביולוגיית הריאות וכן לביצוע מחקרים טוקסיקולוגיים ופרמקולוגיים בדגימות רקמה אנושיות.
זכור כי רקמה אנושית חיה היא עלולה להיות מדביקה, כי אמצעי זהירות כגון שימוש בציוד מגן אישי ואחסון רקמות תקין, הובלה וטיפול בפסולת, תמיד יש לנקוט בעת ביצוע הליך זה
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול להכנת פרוסות ריאה אנושיות בחיתוך מדויק ומולאות אגרוז (agarose) מרקמה כריתה של חולה. פרוסות אלו מתאימות ליצירת תרביות תלת-ממדיות של רקמת ריאה לצורך מידול מחלות ריאה אנושיות במחקרים ביולוגיים וביו-רפואיים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מחקר ביו-רפואי
- מידול מחלות ריאה
- טכניקות לתרביות רקמה בתלת-ממד
רקע
- ניתן להשתמש ברקמת ריאה אנושית כדי לחקור מחלות במבנה תלת-ממדי טבעי.
- שיטה זו מאפשרת ויזואליזציה של דגימות ריאה ממטופלים בודדים.
- היא מאפשרת ניתוח של פתומכניזמים מוקדמים ברזולוציה ספטיו-טמפורלית גבוהה.
- נדרשים אמצעי זהירות בשל אופיים הזיהומי של רקמות אנושיות חיות.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול ליצירת תרביות תלת-ממדיות (3D) של רקמת ריאה.
- הסלטת המחקר של מחלות ריאה ex vivo.
- מתן אפשרות לניתוח ביטוי גנים וחלבונים ברקמת ריאה אנושית.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת דגימות רקמת ריאה באמצעות אגרוז בנקודת התכה נמוכה.
- חיתוך מדויק של חתוכי ריאה ממולאי אגרוז.
- טכניקות של סימון אימונולוגי להדמיית מבנה הרקמה.
- ניתוח ביטוי גנים וחלבונים באמצעות PCR ו-western blotting.
תוצאות עיקריות
- השראה של שינויים דמויי פיברוזיס בתרביות רקמת ריאה לאחר טיפול בציטוקינים.
- בסרגול (Upregulation) של גנים של קולגן מסוג אחד (Type One) ופיברונקטין.
- עלייה ברמות החלבון של הסמן המזנכימלי וימנטין (vimentin) בדגימות המטופלות.
- פוטנציאל למחקרים עתידיים בפולמונולוגיה ניסיונית ובפרמקולוגיה.
מסקנות
- טכניקה זו מקדמת את ההבנה של ביולוגיה של הריאות.
- היא מספקת פלטפורמה למחקרים טוקסיקולוגיים ופרמקולוגיים.
- מחקרים עתידיים יכולים להתבסס על שיטה זו למידול טוב יותר של מחלות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות לתעשייה
תרביות תלת-ממדיות של רקמת ריאה אנושית המופקות מפרוסות ריאה חתוכות בדיוק (precision-cut lung slices) מספקות מודל ex vivo רלוונטי פיזיולוגית לחקר מנגנוני מחלה ותגובות לתרופות במבנה הרקמה האנושית הטבעי. גישה זו תומכת בתיקוף מטרות ובצמצום סיכונים מכניסטיים על ידי מתן אפשרות להערכה ישירה של השפעות תרכובות בדגימות ריאה חולות או פרי-טומורליות מחולים בודדים. המודל מגביר את הביטחון החזוי בהערכה פרה-קלינית על ידי שימור הגיוון התאי, הרכב המטריצה החוץ-תאית והתכונות הביומכניות הקריטיות לרלוונטיות תרגומית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של השערות טיפוליות ברקמת ריאה אנושית שלמה, תוך שימור המבנה התלת-ממדי ומגוון סוגי התאים.
- ערך תפעולי: תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות על ידי מדידת שינויים המושרים על ידי תרופות בסממנים ביולוגיים הקשורים לפיברוזיס, כגון collagen Type I ו-fibronectin.
- ערך מדעי: מסייע להבהרת מסלולים באמצעות ניתוח מרחבי-זמני של מנגנוני פתולוגיה מוקדמים ברקמה אנושית הרלוונטית למחלה.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: ייצור של דגימות רקמה (punches) סטנדרטיות וניתנות לשחזור, המתאימות לסריקת תרכובות בלוחות רב-בארים.
- ערך תפעולי: מאפשר קריאות כמותיות באמצעות אימונופלורסצנציה, qPCR ו-western blotting לצורך ניתוחי תגובה למסלול מינון ומהלך זמן.
- ערך מדעי: הגדלת תפוקת הרקמה מדגימות חולים מוגבלות באמצעות דגימת ביופסיה (biopsy punching), דבר המשפר את יכולת ההרחבה (scalability) ויכולת השחזור של הבדיקה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מדמה תהליכים פיברוטיים ספציפיים לבני אדם ברמות תת-תאיות באמצעות שינויים דמויי פיברוזיס המושרים על ידי ציטוקינים בחתכים ריאתיים מדויקים.
- ערך תפעולי: מספק מערכת רלוונטית למחלה להערכת מעורבות המטרה ומנגנון הפעולה ברקמה אנושית לפני מחקרים in vivo.
- ערך מדעי: תומך בהלימה של ביומרקרים תרגומיים על ידי אפשור מתאם בין תוצרי קריאה מולקולריים לתוצאות תפקודיות ברמת הרקמה.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות ראשונית על מטרות, דרך זיהוי מובילים ועד לתיקוף פרה-קליני, ובכך היא מאפשרת שיפור חזרתי המבוסס על תגובות של רקמות אנושיות.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות על ידי מתן אפשרות לוויזואליזציה של מבנה הנחיר ותגובות תאיות בתוך נתחי ריאה אנושיים שלמים.
- סריקה: מספקת דגימות רקמה מוכנות לבדיקה, בגודל ובחיוניות עקביים, לצורך סריקת ספריות תרכובות בפורמט של 96 בארות.
- אנליטיקה: מאפשרת קריאות מרובות-פרמטרים (multiplexed), כולל ביטוי גנים (qPCR), רמות חלבון (western blot) והדמיה מבנית (immunofluorescence), לצורך השוואת תנאי טיפול.
- מחקר תרגומי: מגשרת בין שלב הגילוי לעבודה פרה-קלינית על ידי שמירה על מורכבות הרקמה האנושית ואפשרות לניתוח תגובות מותאם לשכבות של חולים (patient-stratified).
- שימוש חוזר ארגוני: מכוננת פלטפורמה הניתנת לשימוש חוזר למידול מחלות ריאה, שניתן להשמיע אותה על פני מספר פרויקטים ותחומי טיפול.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי על ידי צמצום פערי התרגום בין מינים באמצעות שימוש ישיר ברקמת ריאה אנושית.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של הכנת הרקמה באמצעות שיבוץ באגרוז וחיתוך מדויק, ובכך משפר את השחזוריות בין משתמשים ואתרים שונים.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות של go/no-go על ידי אספקת אותות מוקדמים של יעילות ורעילות המבוססים על רקמה אנושית.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של תרכובות מותאם סיכונים, בהתבסס על השפעות מכניסטיות בדגימות ריאה אנושיות חולות או פרי-טומורליות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול ברקמה אנושית, בטכניקה סטרילית ובחיתוך באמצעות ויברטום.
- תלוי בגישה לרקמת ריאה שהוסרה בניתוח ובשימוש באגרוז בעל נקודת התכה נמוכה לשימור המבנה.
- מחייב תנאי תרבית סטנדרטיים ובקרת זיהומים בשל הפוטנציאל הזיהומי של רקמה אנושית חיה.
- כולל אופטימיזציה של גודל מחור הביופסיה ושל טכניקת הסיבוב כדי להבטיח אחידות של הדגימות בין החזרות.
- מוגבל על ידי חלון החיוניות של הרקמה, מה שדורש עיבוד מהיר והתחלת תרבית מיד לאחר ההסרה הכירורגית.
