Name: לומד חלבון לייבא לתוך מהכלורופלסט באמצעות Protoplasts (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: למד שיטת טרנספורמציה מבוססת PEG לביטוי חלבונים בפרוטופלסטים לחקירת ייבוא חלבונים לכלורופלסטים בתנאי in vivo. הפרוטוקול מאפשר מחקר יעיל של לוקליזציה ודינמיקת חלבונים בצמחים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו בוצע עם תומך של הקואופרטיב תוכנית מחקר מדעי החקלאות ופיתוח טכנולוגיה (פרויקט מס ' PJ010953012018), ניהול פיתוח כפרי, המענק קרן מחקר לאומי (קוריאה) ממומן על ידי משרד המדע ICT (מספר 2016R1E1A1A02922014), הרפובליקה של קוריאה.

1. גידול של צמחים תודרנית
<ol><li>להכין 1 L Gamborg B5 בינונית (B5) על-ידי הוספת 3.2 g של B5 בינוני כולל ויטמינים, 20 גר' סוכרוז, 0.5 גר' 2-(N-morpholino) אתאן sulfonic חומצה (MES) כדי כ- 800 מ ל מים יונים, והתאימו את ה-pH ל 5.7 עם אשלגן הידרוקסידי (KOH). הוסף יותר יונים מים להביא את הנפח הכולל 8 הוסף ל 1g של phytoagar ו אוטוקלב למשך 15 דקות-121 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>לאפשר המדיום מגניב עד 55 ° צלזיוס, שופכים 20 – 25 מ של המדיום B5 לתוך צלחת פטרי (9 ס מ קוטר, 1.5 ס מ גובה) על ספסל נקי. מתייבשים צלחות במשך 2-3 ימים, לארוז אותם עם גלישת נקי, לשמור אותם במקרר עד לשימוש.</li>
	<li>לחטא תודרנית לבנה זרעים עם 1 מ"ל אתנול 70% (v/v) בשפופרת צנטרפוגה (ה-tube) ע י ניעור באופן רציף במשך 2-3 דקות להסיר את תגובת שיקוע, להוסיף 1 מ"ל של 1% (v/v) נתרן תת-כלורי פתרון אותם ללחוץ ברציפות במשך 2-3 דקות להכין 100 – זרעים 150 לכל צלחת פטרי.<ol>
<li>להסיר את supernatants ולשטוף את הזרעים עם 1 מ ל מים מזוקקים. חזור על שלב זה, 4 x. מקם את הזרעים מעוקר ב 4 מעלות צלזיוס למשך 3 ימים לסנכרן את נביטת הזרעים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לזרוע זרעים 100 – 150 על גבי צלחות B5 באמצעות micropipette ויסגור את הצלחת עם הדבקה.</li>
	<li>לגדל צמחים בחדר צמיחה עם מחזור/כהה 16 h/8 h-100 µmol·m-2·s-1 עוצמת האור, 70% לחות וטמפרטורה 20 ° C למשך שבועיים.</li>
</ol>2. הכנת פלסמיד
הערה: טוהר גבוהה פלסמידים שישמש לשם שינוי; השימוש של ערכת טיהור פלסמיד מסחרי מומלץ.
<ol><li>לטהר את פלסמיד (RbcS-nt:GFP) באמצעות ערכת בידוד ה-DNA. להתרכז דנ א, לבצע אתנול משקעים צינור 1.5 mL, להמיס בגדר DNA ב 100 µL של מים מזוקקים. לקבוע את ריכוז פלסמיד באמצעות ספקטרופוטומטרים-260 ננומטר. לדלל את פלסמיד כדי ריכוז סופי של ~ 2 µg / µL. לשמור את פלסמיד ב-20 ° C עד השימוש.</li>
</ol>3. בידוד של Protoplasts
<ol><li>הכינו את הפתרונות הבאים.<ol>
<li>להכין את הפתרון אנזים להכיל 0.25% (w/v) macerozyme, cellulase 1.0% (w/v), מ מ 400 D-מניטול, 8 מ"מ סידן כלורי (2CaCl), 0.1% (w/v) אלבומין שור (BSA), ו- 5 מ מ MES. להתאים את ה-pH ל 5.6 עם קו.<ol>
<li>לסנן את הפתרון אנזים באמצעות יחידת מסנן אצטט תאית עם גודל הנקבוביות 0.45 μm. Aliquot 25 מ של הפתרון אנזים לתוך צינורות חרוט 50 מ ל, לשמור ב-20 ° C. להפשיר את הפתרון אנזים בטמפרטורת החדר (RT) ומערבבים היטב לפני השימוש.</li>
		</ol>
</li>
		<li>להכין פתרון סוכרוז 21% (w/v) על ידי המסת 21 גר' סוכרוז ב- 100 מ של מים יונים, החיטוי הפתרון.</li>
		<li>להכין פתרון W5 מכיל 154 מ מ נתרן כלורי (NaCl), 125 מ מ CaCl2, 5 מ מ אשלגן כלורי (אשלגן), גלוקוז 5 מ מ ו- 1.5 מ מ MES. להתאים את ה-pH ל 5.6 ועם קו אוטוקלב הפתרון.</li>
		<li>להכין פתרון MaMg מכילים 400 מ D-מניטול, 15 מ מ מגנזיום כלוריד (MgCl2), ו- 5 מ מ MES. להתאים את ה-pH ל 5.6 ועם קו אוטוקלב הפתרון.</li>
		<li>להכין 1 מ' D-מניטול 1 M סידן חנקתי מניות ופתרונות כדי להפוך את הפתרון פג. אוטוקלב פתרונות אלו.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הקציר רקמות עלים שלמים מצמחים 2 שבועות בת ~ 1 – 2 צלחות B5 באמצעות סכין כירורגית וראש במקום העלים שנקטפו לתוך חרוט 50 מ ל צינור המכיל 25 מ ל אנזים פתרון. למקם את צינור חרוטי המכיל אנזים פתרון ועלה הרקמות בצורה אופקית על מטרף סיבוביים עם עצבנות עדינה בחושך. זה לוקח 8 – 12 h לעיכול מלא של רקמות עלים.</li>
	<li>ב 8-12 שעות לאחר דגירה, שופכים את הפתרון אנזים (מכיל protoplasts שוחררו רקמות עלים) לתוך צלחת פטרי טריים דרך רשת עם 140 גודל הנקבוביות מיקרומטר. בזהירות שכבה הפתרון אנזים פרוטופלאסט המכיל מעל 15 מ"ל של 21% (w/v) סוכרוז פתרון, centrifuge זה ב 98 g x 10 דקות עם ההגדרות האצה והאטה הנמוך ברוטור מתנדנד-דלי.</li>
	<li>באמצעות פיפטה של פסטר, בזהירות להעביר את protoplasts מהשכבה העליונה ביותר (אנזים פתרון), בנקודת המפגש בין אנזים פתרון פתרון סוכרוז צינור חרוטי 50 מ ל המכיל 30 מ של W5 פתרון. Centrifuge את הצינור הזה ב g x 51 במשך 6 דקות. בשלב זה, protoplasts יהיה בגדר בתחתית הצינורית חרוט.</li>
	<li>למחוק את תגובת שיקוע בזהירות בעזרת פיפטה מבלי להפריע בגדר protoplasts. להוסיף 25 מ של W5 פתרון, resuspend בעדינות את protoplasts. דגירה הפתרון פרוטופלאסט במקרר 4 ° C במשך לפחות שעה לייצוב.</li>
</ol>4. פרוטופלאסט טרנספורמציה שימוש בפוליאתילן גליקול
<ol><li>הכן של 40% יתד פתרון על-ידי הוספת 4 g של 8000 פג, 4 מ של 1 מ' מניטול פתרון, 1 מ"ל של 1 מ' Ca (3)2ו- 1.8 מ ל מים מזוקקים לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל ומערבבים היטב. להמיס פג על ידי חימום בתנור מיקרוגל למקום ס' 20 – 30 על 40% פתרון פג ב RT להירגעות. הערה: 40% פג פתרון צריך להיות מוכן טרי בכל פעם. אם הם protoplasts לא מגורען לחלוטין במהלך 4 ° C במקרר, centrifuge את החומר ב 46 x g למשך 2 דקות.</li>
	<li>להסיר את תגובת שיקוע בזהירות אך לחלוטין ולהוסיף MaMg פתרון בגדר פרוטופלאסט להניב את הריכוז של 5 x 106/mL. הערה: מספר פרוטופלאסט יכול להיקבע על ידי hemocytometer מתחת למיקרוסקופ.</li>
	<li>מקום 10 µg של פלסמיד DNA מ"ל 13 ריקה כל סיבוב למטה צינור ולהוסיף 300 µL של פתרון פרוטופלאסט באמצעות פיפטה. הערה: הסוף של קצה פיפטה צריך ייחתך. בכל פעם protoplasts הם שנדגמו, הפתרון המכילות פרוטופלאסט צריך להיות resuspended לפני pipetting כך מספר זהה של protoplasts מתווסף כל שפופרת.</li>
	<li>מערבבים את פלסמיד DNA עם protoplasts על ידי בעדינות סיבוב הצינורות ומוסיפים מיד 300 µL של 40% פג הפתרון באמצעות פיפטה של. לערבב בעדינות אבל לחלוטין על-ידי סיבוב צינורות, תקופת דגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר; להטות את הצינור כמעט אופקית, לסובב אותו מספר פעמים.</li>
	<li>מוסיפים 1 מ"ל של W5 פתרון ומערבבים בעדינות אבל לחלוטין על-ידי סיבוב הצינור ביד בצורה דומה. דגירה המדגם 10 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>חזור על שלב זה פעמיים יותר באמצעות 1.5 mL ו- 2 מ"ל של W5 פתרון, בהתאמה. תקופת דגירה של 30 דקות לאחר התוספת האחרונה של W5 פתרון.</li>
	<li>צנטריפוגה-g x 46 עבור 4 דק להשליך תגובת שיקוע והוסף 2 מ"ל של W5 פתרון. מערבבים בעדינות אבל לחלוטין. דגירה ב 22 מעלות צלזיוס בחדר חשוך.</li>
</ol>5. ניתוח של הייבוא החלבון לתוך מהכלורופלסט
הערה: לאחר בתיווך פג טרנספורמציה של protoplasts, זמן הדגירה נע בין 8 ל 24 שעות.
<ol><li>
מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית
	<ol>
<li>מקום 10 µL של הפתרון פרוטופלאסט על כוס שקופיות באמצעות פיפטה עם טיפ החתוך ובזהירות לכסות עם coverslip כדי למנוע נזק של protoplasts.</li>
		<li>המקום השקופית על הבמה של מיקרוסקופ פלורסצנטיות מצויד עירור/פליטה מסנן מגדיר של התבוננות חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), כלורופיל אוטומטי-זריחה.</li>
		<li>לכידת תמונות עם המצלמה מקורר תשלום מצמידים מכשיר (CCD) ותמונות תהליך באמצעות תוכנה לעריכת תמונות כדי להפיק תמונות צבע מדומה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
חלבון הכולל חילוץ ו- Immunoblotting
	<ol>
<li>להכין מאגר דנטורציה המכילה 2.5% (w/v) נתרן dodecylsulfate (מרחביות), ו-2% (v/v) מרקפטואתנול. הערה: חלבון לייבא לתוך מהכלורופלסט ניתן לכמת על ידי מדידת מידת המעבר פפטיד עיבוד באמצעות ניתוח immunoblot באמצעות נוגדן anti-GFP.</li>
		<li>העברת protoplasts לתוך צנטריפוגה צינור צנטריפוגה ב 46 x g במשך 4 דקות.</li>
		<li>הסר את תגובת שיקוע והוסף µL 80 דנטורציה המאגר. נמרצות מערבולת עבור 5 s ולהוסיף 5 x מאגר מדגם מרחביות (250 מ מ (pH 6.8) Cl-טריס, 0.5 M DTT, 10% (w/v) מרחביות, 0.05% (w/v) Bromophenol כחול, ו 50% (v/v) גליצרול). מערבבים היטב, להרתיח 10 דקות.</li>
		<li>נושא את הדוגמית הזו. חלבון סטנדרטי מרחביות-דף, immunoblotting עם נוגדן anti-GFP.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Jarvis, P., Lopez-Juez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+and+homeostasis+of+chloroplasts+and+other+plastids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).</li>
<li>Neuhaus, H. E., Emes, M. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15012188">Nonphotosynthetic Metabolism in Plastids.</a> Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 51, 111-140 (2000).</li>
<li>Rolland, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biosynthetic+capacities+of+the+plastids+and+integration+between+cytoplasmic+and+chloroplast+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genetics%22%5BJournal%5D)">The biosynthetic capacities of the plastids and integration between cytoplasmic and chloroplast processes.</a> Annual Review of Genetics. 46, 233-264 (2012).</li>
<li>Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+nucleus-encoded+proteins+to+chloroplasts+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Targeting of nucleus-encoded proteins to chloroplasts in plants.</a> New Phytologist. 179 (2), 257-285 (2008).</li>
<li>Li, H. M., Chiu, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Transport+into+Chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein Transport into Chloroplasts.</a> Annual Review of Plant Biology. 61, 157-180 (2010).</li>
<li>Keegstra, K., Cline, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+import+and+routing+systems+of+chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Protein import and routing systems of chloroplasts.</a> Plant Cell. 11 (4), 557-570 (1999).</li>
<li>Gasser, S. M., Daum, G., Schatz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Import+of+proteins+into+mitochondria.+Energy-dependent+uptake+of+precursors+by+isolated+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Import of proteins into mitochondria. Energy-dependent uptake of precursors by isolated mitochondria.</a> Journal of Biological Chemistry. 257 (21), 13034-13041 (1982).</li>
<li>Smeekens, S., Bauerle, C., Hageman, J., Keegstra, K., Weisbeek, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+transit+peptide+in+the+routing+of+precursors+toward+different+chloroplast+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The role of the transit peptide in the routing of precursors toward different chloroplast compartments.</a> Cell. 46 (3), 365-375 (1986).</li>
<li>Lee, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+nuclear-encoded+plastid+transit+peptides+contain+multiple+sequence+subgroups+with+distinctive+chloroplast-targeting+sequence+motifs%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis nuclear-encoded plastid transit peptides contain multiple sequence subgroups with distinctive chloroplast-targeting sequence motifs.</a> Plant Cell. 20 (6), 1603-1622 (2008).</li>
<li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+targeting+of+the+Arabidopsis+F1-ATPase+gamma-subunit+via+multiple+compensatory+and+synergistic+presequence+motifs%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial targeting of the Arabidopsis F1-ATPase gamma-subunit via multiple compensatory and synergistic presequence motifs.</a> Plant Cell. 24 (12), 5037-5057 (2012).</li>
<li>Jin, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+dynamin-like+protein%2C+ADL6%2C+is+involved+in+trafficking+from+the+trans-Golgi+network+to+the+central+vacuole+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A new dynamin-like protein, ADL6, is involved in trafficking from the trans-Golgi network to the central vacuole in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 13 (7), 1511-1526 (2001).</li>
<li>Lee, K. H., Kim, D. H., Lee, S. W., Kim, Z. H., Hwang, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+import+experiments+in+protoplasts+reveal+the+importance+of+the+overall+context+but+not+specific+amino+acid+residues+of+the+transit+peptide+during+import+into+chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules+and+Cells%22%5BJournal%5D)">In vivo import experiments in protoplasts reveal the importance of the overall context but not specific amino acid residues of the transit peptide during import into chloroplasts.</a> Molecules and Cells. 14 (3), 388-397 (2002).</li>
<li>Lee, D. W., Lee, S., Oh, Y. J., Hwang, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sequence+motifs+in+the+rubisco+small+subunit+transit+peptide+independently+contribute+to+Toc159-dependent+import+of+proteins+into+chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Multiple sequence motifs in the rubisco small subunit transit peptide independently contribute to Toc159-dependent import of proteins into chloroplasts.</a> Plant Physiology. 151 (1), 129-141 (2009).</li>
<li>Lee, D. W., Woo, S., Geem, K. R., Hwang, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+motifs+in+transit+peptides+act+as+independent+functional+units+and+can+be+transferred+to+new+sequence+contexts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Sequence motifs in transit peptides act as independent functional units and can be transferred to new sequence contexts.</a> Plant Physiology. 169 (1), 471-484 (2015).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Both+the+hydrophobicity+and+a+positively+charged+region+flanking+the+C-terminal+region+of+the+transmembrane+domain+of+signal-anchored+proteins+play+critical+roles+in+determining+their+targeting+specificity+to+the+endoplasmic+reticulum+or+endosymbiotic+organelles+in+Arabidopsis+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Both the hydrophobicity and a positively charged region flanking the C-terminal region of the transmembrane domain of signal-anchored proteins play critical roles in determining their targeting specificity to the endoplasmic reticulum or endosymbiotic organelles in Arabidopsis cells.</a> Plant Cell. 23 (4), 1588-1607 (2011).</li>
<li>Cleary, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+plant+mitochondria+import+chloroplast+precursor+proteins+in+vitro+with+the+same+efficiency+as+chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Isolated plant mitochondria import chloroplast precursor proteins in vitro with the same efficiency as chloroplasts.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (7), 5562-5569 (2002).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

סיפקנו פרוטוקול מפורט על השימוש protoplasts של תודרנית ללמוד חלבון לייבא לתוך מהכלורופלסט. שיטה זו היא חזקה על חקירת תהליך הייבוא חלבון. טכניקה זו פשוטה, תכליתי שימושית לבחינת הפגיעה המכוונת החלבונים מטענים המיועד ל מהכלורופלסט. באמצעות שיטה זו, protoplasts מוכנות רקמות עלים של תודרנית11,12 אשר ניתן להשיג צמחים בשלבי גדילה שונים רבים החל מוקדם מאוד עלים בוגרים לגמרי. עם זאת, יש לנקוט בעת גידול הצמחים המשמשים פרוטופלאסט הכנה. יש להשתמש צמחים בריא...

כלורופלסט הוא אחד organelles החשובים ביותר צמחים. אחת מהפונקציות העיקריות של מהכלורופלסט היא לבצע פוטוסינתזה1. מהכלורופלסט לבצע גם רבים תגובות ביוכימיות אחרות לייצור של חומצות שומן, חומצות אמינו, נוקלאוטידים ו מטבוליטים משניים רבים1,2. עבור כל תגובות אלו, מהכלורופלסט דורשים מספר רב של סוגים שונים של חלבונים. עם זאת, הגנום כלורופלסט מכיל רק כ-100 גנים3,4. לכן, מהכלורופלסט עליך לייבא את רוב החלבונים שלהם ציטוזול. למעשה, רוב החלבונים כלורופלסט הראו להם אפשרות לייבא את ציטוזול לאחר תרגום-4,-5,-6. תאי צמחים דורשים למנגנונים הספציפיים כדי לייבא חלבונים מן ציטוזול מהכלורופלסט. עם זאת, למרות מנגנונים ייבוא חלבונים אלה נחקרו מספר עשורים, אנחנו עדיין לא מבינים לחלוטין אותם ברמה המולקולרית. כאן, אנו מספקים שיטה מפורטת עבור הכנת protoplasts ולבטא exogenously גנים protoplasts. שיטה זו יכולה להיות יקר עבור שחקרתי את המנגנונים המולקולריים שבבסיס חלבון לייבא לתוך מהכלורופלסט בפירוט.
חלבון הייבוא ניתן יהיה ללמוד שימוש בגישות שונות רבות. אחת משיטות אלה כרוכה בשימוש במבחנה חלבון ייבוא מערכת7,8. שימוש בגישה זו במבחנה-חלבון מתורגם מבשרי מודגרת עם מהכלורופלסט מטוהרים במבחנה, ומנותח חלבון הייבוא על-ידי מרחביות-דף ואחריו תספיג ניתוח. היתרון של גישה זו הוא כי כל שלב של חלבון ייבוא לתוך מהכלורופלסט ניתן יהיה ללמוד בפירוט. לכן, בשיטה זו כבר בשימוש נרחב כדי להגדיר את הרכיבים של המנגנון המולקולרי של ייבוא חלבון וכדי לנתח מידע רצף עבור המעבר פפטידים. לאחרונה, גישה אחרת הכרוכות של protoplasts רקמות עלים פותחה, יש להיות בשימוש נרחב ללמוד חלבון לייבא לתוך מהכלורופלסט9,10. היתרון של גישה זו הוא כי protoplasts מספקים סביבה הסלולר זה קרוב לזה של תאים שלמים מאשר מערכת במבחנה . לפיכך, המערכת פרוטופלאסט מאפשרת לנו להתייחס היבטים נוספים של תהליך זה, כגון האירועים הקשורים cytosolic, איך נקבע ייחודה של פילוח אותות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט על השימוש protoplasts ללמוד חלבון לייבא לתוך מהכלורופלסט.

<table><tbody><tr><td>GAMBORG B5 בינוני כולל ויטמינים</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>G0210.0050</td><td></td></tr><tr><td>SUCROSE</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>S0809.5000</td><td></td></tr><tr><td>MES MONOHYDRATE</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>M1503.0250</td><td></td></tr><tr><td>אגר, אבקה</td><td>JUNSEI</td><td>24440S1201</td><td></td></tr><tr><td>סרט כירורגי מיקרופור</td><td>3M</td><td>1530-0</td><td></td></tr><tr><td>להב כירורגי אל חלד No.10</td><td>FEATHER</td> צינור חרוטי <td>לא זמין</td><td></td></tr><tr><td>, 50 מ"ל</td><td>SPL LIFE SCIENCES</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>Macerozyme R-10</td><td>YAKULT PHARMACEUTICAL IND.</td><td>צלולאז לא זמין</td><td></td></tr><tr><td>ONOZUKA R-10</td><td>YAKULT PHARMACEUTICAL IND.</td><td>לא זמין</td><td></td></tr><tr><td>ALBUMIN, BOVINE (BSA)</td><td>VWR</td><td>0332-100G</td><td></td></tr><tr><td>D-Mannitol</td><td>SIGMA</td><td>M1902-1KG</td><td></td></tr><tr><td>סידן כלורי, DIHYDRATE</td><td>MP BIOMEDICALS</td><td>0219463505-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Twister</td><td>VISION SCIENTIFIC</td><td>VS-96TW</td><td></td></tr><tr><td>מסך עבור CD-1</td><td>SIGMA</td><td>S1145</td><td></td></tr><tr><td>מסכים עבור CD-1</td><td>SIGMA</td><td>S3895</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי</td><td>SPL מדעי החיים</td><td>10090</td><td></td></tr><tr><td>פיפטה פסטר</td><td>הילגנברג</td><td>3150102</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה מעבדה / BENCH-TOP</td><td>VISION SCIENTIFIC</td><td>VS-5500N</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>JUNSEI</td><td>19015S0350</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>SIGMA</td><td>P3911-1KG</td><td></td></tr><tr><td>D-גלוקוז,</td><td>ביו בייסיק</td> נטול מים <td>GB0219</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן הידרוקסיד</td><td>DUKSAN</td><td>40</td><td></td></tr><tr><td>סידן חנקתי טטרהידרט</td><td>SIGMA</td><td>C2786-500G</td><td></td></tr><tr><td>פולי (אתילן גליקול)</td> <td>SIGMA</td><td>P2139-2KG</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד הקסהידרט</td><td>SIGMA</td><td>M2393-500G</td><td></td></tr><tr><td>שפופרת 13 מ"ל, 100x16 מ"מ, PP</td><td>SARSTEDT</td><td>55.515</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ</td><td>MARIENFELD</td><td>1000412</td><td></td></tr><tr><td>משקפי כיסוי מיקרוסקופ</td><td>MARIENFELD</td><td>101030</td><td></td></tr><tr><td>תא ספירה</td><td>MARIENFELD</td><td>650030</td><td></td></tr><tr><td>Axioplan 2 מיקרוסקופ הדמיה</td><td>Carl Zeiss</td><td>לא זמין</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו שפופרת 1.5 מ"ל</td><td>SARSTEDT</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>2- מרקפטואתנול</td><td>SIGMA</td><td>M3148-250 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>נתרן דודציל סולפט (SDS), פרוטאומיקה בדרגת</td><td>VWR</td><td>M107-500G</td><td></td></tr><tr><td>TRIS, VWR בדרגה טהורה במיוחד</td><td></td><td>0497-5KG</td><td></td></tr><tr><td>DTT (DL-DITHIOTHREITOL), דרגת ביוטכנולוגיה</td><td>VWR</td><td>0281-25G</td><td></td></tr><tr><td>ברומופנול מלח נתרן כחול ACS</td><td>VWR</td><td>0312-50G</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>JUNSEI</td><td>27210S0350</td><td></td></tr><tr><td>Living Colors A.v. נוגדן חד שבטי (JL-8)</td><td>TAKARA</td><td>632381</td><td></td></tr></tbody></table>

לומד חלבון לייבא לתוך מהכלורופלסט באמצעות protoplasts

Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts

כלורופלסט הוא אברון חיוני כי הוא אחראי על תהליכים שונים התאית בצמחים, כגון פוטוסינתזה וייצור של מטבוליטים משניים רבים ושומנים. מהכלורופלסט לדרוש מספר רב של חלבונים אלה תהליכים פיזיולוגיים שונים. מעל 95% של כלורופלסט חלבונים הם מקודד גרעין והן מיובאים לתוך מהכלורופלסט של ציטוזול לאחר התרגום ריבוזומים cytosolic. לפיכך, הייבוא נכונה או פילוח של חלבונים אלה כלורופלסט מקודד גרעין כדי מהכלורופלסט חיוני לתפקוד תקין של מהכלורופלסט, כמו גם על תא צמח. כלורופלסט גרעין מקודדת חלבונים מכילים רצפי אותות פילוח מסוים כדי מהכלורופלסט. מכונות מולקולריות מקומי כלורופלסט או ציטוזול מזהה אותות אלה ולבצע את תהליך הייבוא. כדי לחקור את המנגנונים של חלבון ייבוא או המיקוד מהכלורופלסט ויוו, פיתחנו מהיר, יעיל מבוססי פרוטופלאסט שיטה לנתח חלבון לייבא לתוך מהכלורופלסט של תודרנית. בשיטה זו, אנו משתמשים protoplasts מבודד מן העלים רקמות של תודרנית. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט עבור שימוש protoplasts כדי לחקור את המנגנון שבאמצעותו חלבונים מיובאות לתוך מהכלורופלסט.

הייבוא של חלבונים לתוך מהכלורופלסט יכולים להיבדק באמצעות שתי גישות: מיקרוסקופ פלורסצנטיות וניתוח immunoblot לאחר ההפרדה מרחביות-דף-מתווכת. כאן השתמשנו RbcS-nt:GFP, פיוז'ן לבנות קידוד N-מסוף 79 חומצת אמינו משקעי RbcS המכיל את פפטיד טרנזיט דבוקה GFP. כאשר חלבונים מיובאות לתוך מהכלורופלסט, זריחה ירוק האותות החלבון היעד RbcS-nt:GFP צריך להתמזג עם אותות פלואורסצנט אדום כלורופיל אוטומטי-זריחה, כפי שנבדקו על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ (איור 1). החפיפה קרוב של ...

כאן נתאר פרוטוקול כדי להביע את החלבונים לתוך protoplasts באמצעות שיטת שינוי בתיווך פג. השיטה מספקת קל ביטוי של חלבונים עניין ולאחר חקירה יעילה של חלבון לוקליזציה, תהליך הייבוא בתנאי ניסוי שונים ויוו.

לומד חלבון לייבא לתוך מהכלורופלסט באמצעות Protoplasts

The chloroplast is an essential organelle that is responsible for various cellular processes in plants, such as photosynthesis and the production of many ...

תעלומה זו יכולה לעזור לענות על כמה שאלות בתחום הביולוגיה של התא כגון קלט חלבון לתוך chloroplasts. היתרון העיקרי של טכנולוגיה זו הוא כי קלט חלבון לתוך chloroplasts ניתן ללמוד בתנאים en vivo. הדגמת ההליך תהיה ג'והו לי והיאנגג'ו קאנג, שני פוסטים מהמעבדה שלי.כדי להתחיל, לקצור רקמות עלים שלמות מצמחים בני שבועיים מאחד עד שתי צלחות B5. השתמש בסכין כירורגית כדי לקצור את העלים ול למקם אותם לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר המכיל 25 מיליליטר של תותבת אנזים. מניחים את הצינור אופקית על שייקר סיבובי ודגירה עם תסיסה עדינה ב 22 מעלות צלזיוס בחושך במשך שמונה עד 12 שעות עד רק petioles וגבעולים להישאר בתסיסה.לאחר השלמת הדגירה, מסננים את תטגם האנזים המכיל פרוטופלסטים משוחררים באמצעות רשת בגודל נקבובית של 140 מיקרומטר לתוך צלחת פטרי טרייה. ואז בזהירות שכבת הפתרון על גבי 15 מיליליטר של 21% פתרון סוכרוז בצינור חרוט 50 מיליליטר. צנטריפוגה הצינור רוטור דלי מתנדנד ב 98 gs במשך 10 דקות עם ההאצה הנמוכה ביותר ואת הגדרות ההאטה.לאחר מכן, השתמשו בפטורה פיפט כדי להסיר בזהירות את הפרוטופלסטים מהשכבה העליונה המכילה תותב אנזימים ומהממשק בין פתרון האנזימים ותתפורת סוכרוז. העבר פתרון זה לצינור חרוט 50 מיליליטר המכיל 30 מיליליטר של פתרון W5 ולהפוך את הצינור לערבב. צנטריפוגה הצינור ב 51 gs במשך שש דקות.השתמש פיפטה כדי להשליך את זה על טבעי בזהירות מבלי להפריע protoplasts גלולה. הוסף 25 מיליליטר של פתרון W5 בעדינות להשעות את protoplasts. לייצוב, דגירה במקרר ארבע צלזיוס למשך שעה לפחות.לאחר דגירה של ארבע מעלות צלזיוס, גלולה protoplasts לחלוטין על ידי צנטריפוגה אותם ב 46 gs במשך שתי דקות. בזהירות להסיר את העל טבעי לחלוטין ולהוסיף פתרון MANG לכדור protoplast כדי להשיג חמש פעמים עשר עד שישה למיליליטר. השתמש פיפטה להוסיף 10 מיקרוגרם של DNA פלזמה ו 300 microliters של פתרון protoplast לצינור 13 מיליליטר עגול תחתית טרי.מערבבים על ידי סיבוב עדין של הצינורות ביד ולאחר מכן מיד להוסיף 300 microliters של 40% פתרון PEG מוכן טרי. מערבבים לחלוטין על ידי הטיית הצינור כמעט אופקית וסיבובו בעדינות מספר פעמים ביד. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.לאחר מכן מוסיפים מיליליטר אחד של פתרון W5 ומערבבים לחלוטין על ידי סיבוב עדין של הצינור ביד כבעבר. הדגירה את המדגם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. חזור פעמיים נוספות עם הוספת הראשון 1.5 מיליליטר ולאחר מכן שני מיליליטר של W5 ואחרי התוספת הסופית ערבוב, דגירה במשך 30 דקות.צנטריפוגה הצינור ב 46 gs במשך ארבע דקות ולאחר מכן להשליך את העל טבעי. מוסיפים שני מיליליטר של פתרון W5 לכדור ומערבבים בעדינות, אבל לגמרי, באותו אופן כמו בעבר. דגירה ב 22 מעלות צלזיוס בתא חשוך במשך 18 שעות.כדי לנתח את יבוא החלבון באמצעות מיקרוסקופיה של florescence, השתמשו בפיגט עם קצה גזוז כדי למקם 10 מיקרוליטרים של תותבת הפרוטופלסט על מגלשת זכוכית. השתמש להחליק כיסוי כדי לכסות בזהירות את הפתרון, כדי למנוע פגיעה protoplasts. מניחים את השקופית על הבמה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם מסנן כניסה העירור כי הוא מוגדר להתבוננות חלבון פלואורסצנטי ירוק ושפעת אוטומטית כלורופיל.השתמש במצלמת מכשירים זוגיים של טעינה מקוררת כדי ללכוד תמונות ולעבד אותן באמצעות תוכנת עריכה מדומה כדי להפיק תמונות בצבע מדומה. עבור מיצוי חלבון הכולל immunoblotting, להסיר מיליליטר אחד מתסמת protoplast ומערבבים את מיליליטר הנותרים. העבר פתרון protoplast זה לתוך צינור צנטריפוגה צנטריפוגה ב 46 gs במשך ארבע דקות.הסר את supernatant לאחר השלמת צנטריפוגה ולהוסיף 80 microliters של מאגר denaturation. וורטקס במרץ למשך חמש שניות. מוסיפים חמישה מאגר מדגם XDS, מערבבים היטב ומרתיחים במשך 10 דקות כדי denature.המשך עם דף STS סטנדרטי ו immunoblotting עם נוגדן נגד GFP. RbcS ו- TGFT, מבנה היתוך המאדים את שאריות חומצות האמינו של מסוף 79 של RBCS המכילות את פפטיד המעבר התמזגו ל- GFP, שימשו לחקר ייבוא חלבונים לכלורופלסטים על ידי מיקרוסקופיה של פלורנס ואימונובלוט. כאשר נבדק על ידי מיקרוסקופיה florescence, אותות פלואורסצנטיים ירוקים מחלבון היעד התמזגו עם אותות פלואורסצנטיים אדומים מתפרחת כלורופיל אוטומטית המציינת יבוא חלבון לכלורופלסטים.לאחר בידוד החלבון הכולל, שתי רצועות חלבון נצפו immunoblot, מראה כי חלבון יובא כראוי לתוך chloroplasts. הרצועה העליונה תואמת למבשר באורך מלא ולרצועה התחתונה לטופס המעובד לאחר הייבוא לכלורופלסטים. כמות הצורה המעובדת של החלבון גדלה באופן תלוי זמן, מה שמרמז על כך שהחלבון מיובא לכלורופלסטים.בהתפתחות זו, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה של התא לחקור חלבון מעייף או קטיף חוט קרום ב Arabidopsis.

studying-protein-import-into-chloroplasts-using-protoplasts

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

היווצרות של קומפלקסי חלבוני in vivo ניתן דמיינו ידי שלמת הקרינה bimolecular. שותפי אינטראקציה הם התמזגו לחלקי משלימים של תגי ניאון והביעו transiently בי טבק, וכתוצאה מכך אות ניאון מחדש על סמיכות של שני חלבונים.

חלבונים אינטראקציות דמיינו ידי bimolecular הקרינה complementation בProtoplasts הטבק ועלים

כאן אנו מתארים שיטה חדשה ללמוד יבוא החלבון לתוך כלורופלסטים מבודדים תחת לחץ. השיטה היא מהירה וישירה, וניתן להחיל ללמוד את ההשלכות של תנאי לחץ שונים לייבוא ​​חלבון הכלורופלסט, ואת מנגנוני ויסות המקביל.

ניתוח של ייבוא ​​חלבון לתוך כלורופלסטים מבודדים מצמחים לחוצים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול האינטראקציה ללכוד להחיל על Arabopopsis thaliana עלה mesophyll protoplasts. שיטה זו מסתמכת באופן קריטי על vivo UV crosslinking ומאפשר בידוד וזיהוי של חלבונים mRNA מחייב הצמח מסביבה פיזיולוגית.

MRNA Interactome ללכוד מן Protoplasts הצמח

אנו מציגים פרוטוקולים בזאת לבידוד לתפוקה גבוהה של פעיל מבחינה פיזיולוגית thylakoids, חלבון מבחני תחבורה עבור רוברטסונית ארגינין טווין כלורופלסט (cpTat), הפרשה (cpSec1), אות זיהוי החלקיקים (cpSRP) מסלולים.

בידוד של פעיל מבחינה פיזיולוגית Thylakoids, השימוש בהם במסגרת מבחני תחבורה אנרגיה תלוית חלבון

אנו כאן מציגים פרוטוקול מוכחת ונבדק ולטיהור כלורופלסט מתחמי ייבוא חלבון (TOC-טיק מרוכב) בעזרת הברז-התג. פרוטוקול זיקה-בידוד בשלב אחד פוטנציאלי ניתן להחיל על כל חלבון, ניתן להשתמש כדי לזהות אינטראקציה עם שותפים חדשים באמצעות ספקטרומטר מסה.

זיקה טיהור של מתחמי חלבון Translocon כלורופלסט בעזרת התג ברז

כאן, אנו מתארים שיטה לטהר מהכלורופלסט ללא פגע מן העלים תודרנית שלהם שלוש הראשי תת התאים (מעטפה, משתית, thylakoids), באמצעות שילוב של centrifugations דיפרנציאלית, מעברי צבע, Percoll רציף, מעברי צבע סוכרוז מקוטע. השיטה היא יקר עבור subplastidial ולוקליזציה subcellular של חלבונים על-ידי immunoblotting פרוטאומיקס.

הכנת כלורופלסט תאי המשנה של תודרנית לניתוח של חלבון לוקליזציה Immunoblotting או פרוטאומיקס

המיטוכונדריה הם אברונים מטבוליים מרכזיים המציגים רמה גבוהה של פלסטיות פנוטיפית בשריר השלד. ייבוא חלבונים מן הציטוסול הוא מסלול קריטי עבור biogenesis אברון, חיוני להרחבת הרשתית ותחזוקה של תפקוד מיטוכונדריאלי.  לכן, יבוא חלבון משמש ברומטר של בריאות התא.

מדידה של קיבולת ייבוא חלבון של המיטוכונדריה שריר השלד

מאמר זה מתאר שיטה להערכת האינטראקציות וההרכבות של חלבוני ממברנה אינטגרליים במבחנה עם גורמים שותפים שונים בסביבה שומנית-פרוקסימלית.

באמצעות הפיגום ליפוזומים כדי לשקם אינטראקציות ליפידים-הפרוקסימלי חלבונים במבחנה

גמישות קונפורמציה משחקת תפקיד קריטי בתפקוד חלבון. בזאת, אנו מתארים את השימוש של ספקטרומטריית מסת electrospray יינון הזמן לפתור מצמידה את חילופי המימן-דאוטריום חיטוט השינויים המבניים המהירים שמניעים פונקצית חלבוני הורה אי סדר.

המרת מימן-דאוטריום electrospray יינון זמן נפתרה ספקטרומטריית מסה לימוד מבנה החלבון Dynamics

כאן אנו מציגים עבור טיהור חלבון אנאירובית, ריכוז חלבון אנאירובית, ואפיון עוקבות קינטי משתמש במערכת אלקטרודה חמצן פרוטוקול. השיטה מומחש באמצעות האנזים DesB, אנזים dioxygenase אשר פעיל כאשר מטוהרים ומאוחסנים בסביבה אנאירובית ויציבה יותר.

חלבון אנאירובית טיהור וניתוח קינטי באמצעות אלקטרודה חמצן ללמוד DesB Dioxygenase פעילות וניגוד

למד שיטת טרנספורמציה מבוססת PEG לביטוי חלבונים בפרוטופלסטים לחקירת ייבוא חלבונים לכלורופלסטים בתנאי in vivo. הפרוטוקול מאפשר מחקר יעיל של לוקליזציה ודינמיקת חלבונים בצמחים.

לומד חלבון לייבא לתוך מהכלורופלסט באמצעות Protoplasts

גלה סרטונים נוספים