חלבון חוץ-תאית הטכנולוגיה Microarray לגילוי תפוקה גבוהה של אינטראקציות קולטן-ליגנד זיקה נמוכה

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום אינטראקציות חלבון חלבון על ידי מתן אפשרות לגילוי של שותפים מחייבים חדשניים לחלבונים חוץ תאיים, הן בתפוקה גבוהה והן ברגישות גבוהה. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא, עם רק כמה מיקרוגרם של חלבון, אתה יכול ליצור מאות שקופיות באמצעות מדפסת מערך מיקרו. השתמש במיקרו-arrayer רגיל להדפסת שקופיות.

לכלי זה יש קיבולת של 57 שקופיות בכל ריצה, הוא משתמש בראש הדפסה המחזיק 48 סיכות איתור ויכול להכיל עד 8,000 נקודות לשקופית. צור לוחות עבודה באמצעות 384 צלחות באר ב 10 microliters של מדגם לגם מצלחות המניות. בצע שלב זה באופן ידני, לפני הדפסת שקופיות באמצעות המיקרו arrayer.

לאחר מכן, תוכלו לזהות חלבונים עם סיכות איתור מסוג קולמוס על מגלשות סילאן אפוקסי ב-60% לחות כדי למנוע התייבשות של כתמי החלבון. Cy3 שכותרתו אלבומין סרום חזיר ניתן לראות כפול בין כל דגימת חלבון כדי לדמיין את המערך להתאמת מסכה. לאחר ההדפסה, הסר את שקופיות מערך מיקרו החלבון מהסביבה הלחה.

לאחר מכן, להשתמש בפוגר קולי כדי ליצור ערפל עדין של פתרון חסימה כי מתיישב על משטח השקופית. לאחר מכן, חסום את השקופיות בן לילה עם 5%milk ב- PBST כדי להפעיל את פני השטח. יש לאחסן מגלשות במינוס 20 מעלות צלזיוס ב-50% גליצרול כדי למנוע הקפאה.

אינטראקציות בין חלבונים חוץ-תאיים מאופיינים לעתים קרובות בזיקה הנמוכה שלהם. כדי לאפשר זיהוי של אינטראקציות אלה, על ידי הגדלת avidity מחייב, פיתחנו גישה רב-לשונית המבוססת על לכידת החלבון שאל לידי ביטוי כמו FC מתויג תחומים חוץ תאיים על חלבון A מצופה גם חזיות מיקרו. סובב את המוביל IgG, שכותרתו צבע תגובתי מונו Cy5 כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

כדי לחשב את היחס הטנוני של חלבון השאילתה ו- Cy5 IgG, חלק את המשקל המולקולרי של חלבון השאילתה לפי המשקל המולקולרי של ה- IgG והתרבה ב - 40 מיקרוגרם למיליליטר כדי לקבוע את הריכוז של Cy5 IgG הדרוש. לאחר שכל היחסים נקבעו יוצרים את קומפלקס חלבון המיקרו חרוזים על ידי שילוב השאילתה המתויגת FC ו- Cy5 IgG עם החלבון A micro חרוזים. מערבבים את המתלה ב- PBS על מסובב צינור במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור.

כדי להתחיל את ההקרנה, לחמם את השקופיות מוכנות בטמפרטורת החדר לפני טעינה על תחנת ההכלאה. כדי לבצע את ההקרנה, לשטוף תחילה את מערך מיקרו עם PBST במשך דקה אחת כדי להסיר גליצרול שיורית. לטעון 200 microliters של מיליגרם אחד לכל חלבון מיליליטר A ב PBS 5%חלב דגירה במשך 30 דקות כדי למנוע חלבון uncomplexed מיקרו חרוזים מחייב חלבונים מתויגים FC שעשויים להיות נוכחים במערך מיקרו.

לאחר תחנת ההכלאה שוטף את השקופיות עם PBST, לטעון 200 microliters של קומפלקס חרוזים מיקרו שאילתה, בנוכחות מיליגרם אחד לכל חלבון מיליליטר A ודגירה במשך 30 דקות. לאחר הכלאה ושטיפה של המגלשות על ידי תחנת ההכלאה, לשטוף מגלשות עם מים ולמקום אותם בודדים 50 צינורות חרוט מיליליטר. יבש את הצינורות על ידי ספינינג ב 900 פעמים G במשך חמש דקות.

לבסוף, לסרוק את השקופיות עם סורק מיקרו מערך מתאים לזהות Cy3 ו Cy5 פלואורסצנטיות על ידי מרגש ב 532 ו 635 ננומטר, בהתאמה. מוצגת כאן תמונה מייצגת של שקופית מודפסת. כתמי אלבומין בסרום חזיר עם תווית Cy3 נמצאים בירוק.

הכתמים הודפסו כפולים כבקרת איכות של תהליך ההדפסה. תוצאות מייצגות של חלבון יתום, המוקרן לזיהוי שותפים מחייבים באמצעות טכנולוגיית מיקרו-מערך החלבון החוץ-תאי, מוצגות כאן. הכתמים האדומים הכפולים מזוהים כלהק עבור חלבון השאילתה המוקרן.

שיטה זו המתוארת היא רב-תכליתית מאוד ובאפשרותך להשתמש בה להדפסת מכלול של ספריות חלבונים, בין אם מדובר במשפחות חלבונים ספציפיות או אוספים גדולים של חלבונים כמו שלנו. כל חלבון של עניין ניתן להעריך. בעת ניסיון הליך זה חשוב לטפל בשקופיות בזהירות ולהבטיח שהן לא יתייבשו כדי למנוע אובדן פעילות של החלבונים המודפסים.

בעקבות המסך של חלבון מעניין, מומלץ מאוד לאמת עוד יותר את כל הלהיטים שנצפו באמצעות טכנולוגיות אורתוגונליות, כגון תהודה פלסמון פני השטח. לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים לחקור אינטראקציות חלבון חוץ-תאיות בבני אדם.