Name: הדמיה בזמן אמת, כימות של פיתוח Biofilm פטרייתי באמצעות מערכת זרימת Recirculating דו-שלבית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 16 s
Description: חקור מערכת זרימה דו-שלבית להדמיה בזמן אמת של פיתוח ביופילם פטרייתי תחת תנאי זרימה משתנים. השיטה כוללת אלגוריתמים כימותיים לניתוח תמונות ומספקת תובנות לגבי דינמיקת הגדילה וההתפתחות של הביופילם.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצה להכיר ד ר ווייד עורכת הדין למתן ערך קלט בעיצוב של המנגנון זרימה.

<ol><li>Pankhurst, C. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2907793/">Candidiasis (oropharyngeal).</a> BMJ clinical evidence. 2012, 1304(2012).</li>
<li>Ramage, G., Vandewalle, K., Wickes, B. L., López-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15496122">Characteristics of biofilm formation by Candida albicans.</a> Revista iberoamericana de micología. 18 (4), 163-170 (2001).</li>
<li>Nobile, C. J., Mitchell, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cell-surface+genes+and+biofilm+formation+by+the+C.+albicans+transcription+factor+Bcr1p%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Regulation of cell-surface genes and biofilm formation by the C. albicans transcription factor Bcr1p.</a> Current biology: CB. 15 (12), 1150-1155 (2005).</li>
<li>Blankenship, J. R., Mitchell, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+build+a+biofilm%3A+a+fungal+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+microbiology%22%5BJournal%5D)">How to build a biofilm: a fungal perspective.</a> Current opinion in microbiology. 9 (6), 588-594 (2006).</li>
<li>Araújo, D., Henriques, M., Silva, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Portrait+of+Candida+Species+Biofilm+Regulatory+Network+Genes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+microbiology%22%5BJournal%5D)">Portrait of Candida Species Biofilm Regulatory Network Genes.</a> Trends in microbiology. 25 (1), 62-75 (2017).</li>
<li>Lane, W. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel-plate+flow+chamber+and+continuous+flow+circuit+to+evaluate+endothelial+progenitor+cells+under+laminar+flow+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%22%5BJournal%5D)">Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress.</a> Journal of visualized experiments. (59), e3349(2012).</li>
<li>Bakker, D. P., van der Plaats, A., Verkerke, G. J., Busscher, H. J., van der Mei, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+velocity+profiles+for+different+flow+chamber+designs+used+in+studies+of+microbial+adhesion+to+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Comparison of velocity profiles for different flow chamber designs used in studies of microbial adhesion to surfaces.</a> Applied and environmental microbiology. 69 (10), 6280-6287 (2003).</li>
<li>Zhang, W., Sileika, T. S., Chen, C., Liu, Y., Lee, J., Packman, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+planar+flow+cell+for+studies+of+biofilm+heterogeneity+and+flow-biofilm+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+bioengineering%22%5BJournal%5D)">A novel planar flow cell for studies of biofilm heterogeneity and flow-biofilm interactions.</a> Biotechnology and bioengineering. 108 (11), 2571-2582 (2011).</li>
<li>Uppuluri, P., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+easy+and+economical+in+vitro+method+for+the+formation+of+Candida+albicans+biofilms+under+continuous+conditions+of+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">An easy and economical in vitro method for the formation of Candida albicans biofilms under continuous conditions of flow.</a> Virulence. 1 (6), 483-487 (2010).</li>
<li>Diaz, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+interaction+between+Candida+albicans+and+commensal+oral+streptococci+in+a+novel+in+vitro+mucosal+model%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+immunity%22%5BJournal%5D)">Synergistic interaction between Candida albicans and commensal oral streptococci in a novel in vitro mucosal model.</a> Infection and immunity. 80 (2), 620-632 (2012).</li>
<li>McCall, A., Edgerton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-Time+Approach+to+Flow+Cell+Imaging+of+Candida+albicans+Biofilm+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+fungi%22%5BJournal%5D)">Real-Time Approach to Flow Cell Imaging of Candida albicans Biofilm Development.</a> Journal of fungi. 3 (1), Basel, Switzerland. 13(2017).</li>
<li>Zhang, B., Zerubia, J., Olivo-Marin, J. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gaussian+approximations+of+fluorescence+microscope+point-spread+function+models%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+optics%22%5BJournal%5D)">Gaussian approximations of fluorescence microscope point-spread function models.</a> Applied optics. 46 (10), 1819-1829 (2007).</li>
<li>Tati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+glabrata+Binding+to+Candida+albicans+Hyphae+Enables+Its+Development+in+Oropharyngeal+Candidiasis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">Candida glabrata Binding to Candida albicans Hyphae Enables Its Development in Oropharyngeal Candidiasis.</a> PLoS pathogens. 12 (3), 1005522(2016).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

באמצעות מערכת הזרימה כמתואר לעיל מאפשר לדור של קטעי וידאו זמן לשגות כמותית של biofilm פטרייתי צמיחה והתפתחות. כדי לאפשר השוואות בין ניסויים זה חשיבות חיונית על מנת להבטיח כי הפרמטרים הדמיה נשמרים זהה. זה כולל הבטחת כי המיקרוסקופ מוגדרת לתאורת קוהלר עבור ניסוי (מדריכים רבים זמינים באינטרנט עבור תהליך זה). מלבד הדמיה פרמטרים, יש כמה צעדים חשובים שיש לזכור בעת עבודה עם מנגנון זרימה. ראשית, חשוב להבטיח מלכודת בועות תישמר תחת ואקום במהלך זרימת נוזלים, כמו כשל לשם כך יוביל נגררים באמצעות מלכודת בועות אוויר. באופן דומה, כאשר המ...

קנדידה אלביקנס (אלביקנס ג) הוא פתוגן פטרייתי הזדמנותית של בני אדם שיכולים להדביק סוגי רקמות רבים, כולל אוראלי משטחים הרירית, גורם קנדידה הלוע התחתון, וכתוצאה מכך איכות חיים נמוכה יותר עבור אנשים מושפעים1. ביופילמים היא מאפיין חשוב בפתוגנזה של ג אלביקנס, מחקרים רבים נעשו על היווצרות ועל תפקוד אלביקנס ג biofilms2,3,4, 5, שרבים מהם נערכו באמצעות חשמל סטטי (אין זרימת) במבחנה מודלים. עם זאת, אלביקנס ג חייב לדבוק ולגדול בנוכחות זרימת הרוק בחלל הפה. מערכות זרימה רבים פותחו כדי לאפשר לחיות תאים הדמיה6,7,8,9,10. מערכות זרימה שונים אלה עוצבו למטרות שונות, לכן לכל מערכת יש והחולשות שונים. מצאנו כי רבים מן הזרם מערכות מתאים אלביקנס ג היו יקרים, נדרש מתחם מפוברק חלקים, או יכול לא להיות עם תמונה במהלך הזרימה, היה צריך לעצור לפני הדמיה. לכן, פיתחנו מנגנון זרימת הרומן ללמוד אלביקנס ג ביופילמים תחת זרימה11. במהלך העיצוב של מנגנון הזרימה שלנו, עקבנו אלה השיקולים המרכזיים. ראשית, רצינו להיות היכולת לכמת את מספר היבטים biofilm הצמיחה וההתפתחות ב בזמן אמת ללא צורך את השימוש פלואורסצנט תאים (המאפשר לנו זנים מוטציה המחקר, מבודד קליניים יאומתו בקלות). שנית, רצינו כל החלקים יהיו זמינים מסחרית עם מעט שינויים לא (כלומר., אין ייצור מותאם אישית), ומאפשר לאחרים יותר בקלות לשחזר את המערכת שלנו, המאפשרות תיקונים קלים. שלישית, גם רצינו לאפשר עבור המורחבת הדמיה פעמים במחירים זרימה גבוהה יחסית. לבסוף, רצינו, לאחר תקופה של תאים לצרף המצע תחת זרימה, להיות מסוגל לפקח על צמיחה biofilm לאורך זמן ממושך ללא החדרת תאים חדשים.
שיקולים אלו הובילו אותנו לפתח את הבקבוק-שני recirculating מערכת הזרימה מאויר באיור1. שתי המבחנות מאפשרים לנו לפצל את הניסוי לתוך בשני שלבים, שלב מצורף שמושך מן הבקבוק מצורף נזרע תא ושלב הצמיחה המשתמשת מדיה ללא תא כדי להמשיך את הצמיחה biofilm ללא התוספת של תאים חדשים. מערכת זו מיועדת לעבודה עם חדר דגירה על המיקרוסקופ, עם השקופית, הצנרת לתו זה (2-5, איור 1) להצבה בתוך החממה, והניח כל שאר הרכיבים במיכל המשני גדול בחוץ מיקרוסקופ. בנוסף, קדירות פלטה עם רגש טמפרטורה המצורפת משמש כדי לשמור על תאים פטרייתי הבקבוקון קובץ מצורף ב- 37 מעלות צלזיוס. כמו זה הוא צואה, מערכת זו הוא מסוגל הדמיה רציפה במהלך הזרימה (יכול להיות מעל 36 h בהתאם לתנאים), ניתן להשתמש מיקרוסקופים סטנדרטי ביותר, כולל מיקרוסקופ benchtop ישר או הפוך. כאן, נדון ההרכבה, המבצע, ומספקים ניקוי על מנגנוני זרימה, כמו גם כמו כמה אלגוריתמים בסיסיים ImageJ כמותיים כדי לנתח קטעי וידאו לאחר ניסוי.

<table><tbody><tr><td>משאבה</td><td>Cole Parmer</td><td>07522-20</td><td>6</td></tr><tr><td>ראש משאבה</td><td>Cole Parmer</td><td>77200-60</td><td>6</td></tr><tr><td>צינורות</td><td>Cole Parmer</td><td>96410-14</td><td>N/A</td></tr><tr><td>מתאם מלכודת בועות</td><td>Cole Parmer</td><td>30704-84</td><td>3</td></tr><tr><td>מתאם ואקום מלכודת בועות עבור 1/4 אינץ' קו ואקום מזהה</td><td>Cole Parmer</td><td>31500-55</td><td>3</td></tr><tr><td>מתאם מסנן בשורה (4 דרושים)</td> <td>Cole Parmer</td><td>31209-40</td><td>8,9</td></tr><tr><td>צד כתום Y</td><td>Cole Parmer</td><td>31209-55</td><td>7</td></tr><tr><td>צד ירוק Y</td><td>ibidi</td><td>10827</td><td>2</td></tr><tr><td>* שקופיות</td><td>ibidi</td><td>80196</td><td>4</td></tr><tr><td>* פתיונות שקופיות</td><td>ibidi</td><td>10802</td><td>4</td></tr><tr><td>ואקום מלכודת בועות בסיוע</td><td>Elveflow/Darwin microfluidics</td><td>KBTLarge - ערכת מלכודת בועות מיקרופלואידית</td><td>3</td></tr><tr><td>צלוחיות מדיה</td><td>קורנינג</td><td>4980-500</td><td>1</td></tr><tr><td>0.2 ומיקרו; m מסנן אוויר</td><td>קורנינג</td><td></td><td>431229 1</td></tr><tr><td>בקבוק זכוכית הברגה ל-PD ובקבוק מסנן (2 דרושים)</td><td>קורנינג</td><td>1395-100</td><td>5,10</td></tr><tr><td>מכסה בורג מועבר ל-PD ובקבוק מסנן (2 דרושים)</td><td>Wheaton</td><td>1129750</td><td>5,10</td></tr><tr><td>מחבר צינורות</td><td>Screwcap Wheaton</td><td>1129814</td><td>5,10</td></tr><tr><td>מחבר צינורות מכונת כביסה משופעת</td><td>Danco</td><td>88579</td><td>5,10</td></tr>מכונת <tr><td>כביסה שטוחה מחבר צינורות</td><td>Danco</td><td>88569</td><td>5,10</td></tr><tr><td>מהדקים למסננים מקוונים ובמורד הזרם Y (7 דרושים)</td> <td>Oetiker/MSC Industrial Supply Company</td><td>15100002-100</td><td>7,8,9</td></tr><tr><td>כלי מהדק</td><td>Oetiker/MSC חברת אספקה תעשייתית</td><td>14100386</td><td>N / A</td></tr><tr><td>20 &mu; m מסנן מדיה מקוון</td><td>מכשירים מדעיים אנליטיים</td><td>850-1331</td><td>8</td></tr><tr><td>10 &mu; m מסנן מדיה בשורה</td><td>מכשירים מדעיים אנליטיים</td><td>850-1333</td><td>9</td></tr><tr><td>2 &mu; m מסנן מדיה כניסה</td><td>Supelco/Sigma-Aldrich</td><td>58267</td><td>10</td></tr><tr><td>* 0.22 & מסנן מדיה m</td><td>Millipore</td><td>SVGV010RS</td><td>11</td></tr> <tr><td>* 0.22 ומיקרו; מסנן מדיה M " מתאם"</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>329654 11</td></tr><tr><td>פקק גומי</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-131E</td><td>1</td></tr><tr><td>מערבל פלטה חמה עם יציאת בדיקה חיצונית</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>88880006</td><td>N/A</td></tr><tr><td>בדיקת טמפרטורה</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>88880147</td><td>N / A</td></tr></tbody></table>

הדמיה בזמן אמת, כימות של פיתוח biofilm פטרייתי באמצעות מערכת זרימת recirculating דו-שלבית

Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System

ב קנדידה הלוע התחתון, חברי קנדידה חייב לדבוק ולגדול על פני השטח הרירית אוראלי בעוד תחת השפעת זרימת הרוק. בעוד פותחו מודלים עבור הגידול תחת זרימה, רבות ממערכות אלה יקרים, או אל תאפשר הדמיה בזמן התאים נמצאים תחת זרימה. פיתחנו מנגנון הרומן זה מאפשר לנו תמונה את הצמיחה וההתפתחות של תאי קנדידה אלביקנס תחת זרימה בזמן אמת. כאן, אנו מפרטים הפרוטוקול על הרכבה ועל השימוש והתותח זרימה, כמו גם כימות של נתונים שנוצרו. אנחנו יכולים לכמת את קצבי התאים לצרף ולנתק מהשקופית, כמו גם לקבוע מדד של ביומסה בשקופית לאורך זמן. מערכת זו הוא חסכוני ורב -גונית לעבוד עם סוגים רבים של מיקרוסקופ אור, כולל מיקרוסקופ benchtop זול, מסוגל מורחב הדמיה פעמים בהשוואה למערכות אחרות זרימה. בסך הכל, זה מערכת תפוקה נמוכה יכול לספק מידע בזמן אמת מאוד מפורט על הגידול biofilm של מינים פטרייתי תחת זרימה.

להחליפן בתמונות של מצב רגיל בין לילה זמן לשגות הניסוי באמצעות פראי-סוג אלביקנס ג תאים ב 37 ° C ניתן לראות באיור 2א ו- 1 וידאו משלימה. התמונות היו חדות משופרת כדי לשפר את הראות. בוצע כימות הנתונים המקוריים, גרפים נציג ניתן לראות באיור 2B. כדי להפיק גרפים אלה, הנתונים היו מנורמל קודם לאזור הדימות (כלומר, לחלק את הסכום הכולל הדמיה אזור), להתנתקות היה נוסף מנורמל כד...

אנו מתארים את מכלול, המבצע, ועוצב ניקוי של מנגנון זרימה כדי התמונה פטרייתי ביופילמים בזמן אמת בזמן תחת זרימה. אנחנו גם מספקים ולדון אלגוריתמים כמותיים כדי לשמש על תמונות נרכשות.

הדמיה בזמן אמת, כימות של פיתוח Biofilm פטרייתי באמצעות מערכת זרימת Recirculating דו-שלבית

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום המיקרוביולוגיה, כגון כיצד זרימת נוזלים משנה צמיחה והתפתחות של ביופילם פטרייתי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לנו להעריך כמותית את השפעות הזרימה על צמיחה והתפתחות ביופילם בזמן אמת. התחל ניסוי זה בהרכבה של מנגנון הזרימה, כמתואר בפרוטוקול הטקסט.ביום הניסוי, חבר את מלכודת הבועה, את גשושית הטמפרטורה ואת כל רכיבי השימוש הבודד. כדי להרכיב את המסנן, הסר את הבוכנה ממזרק של מיליליטר אחד כדי להפוך אותו למתאם. כפו את הצינורות מבקבוק המסנן לקצה זה והצמידו מסנן 2 מיקרון לצנרת המובילה לבקבוק הגדילה.החל גריז ואקום סיליקון סביב העקיצה של מתאם השקופית לפני חיבורו, כמו זה עוזר למנוע דליפות אוויר לתוך המערכת. מלאו את בקבוקון ההחזקה ב-100 מיליליטר של YPD, ומלאו את בקבוק הגדילה ב-200 מיליליטר של YPD. ודאו שצנרת הצד הירוק מגיעה למדיה בכל בקבוקון.ודא שכל השסתומים פתוחים. חבר את מלכודת הבועה לוואקום, וחבר את המשאבה לצד הירוק צינורות במורד הזרם של מלכודת הבועה. לשאוב את הנוזל בקצב זרימה של 3.3 מיליליטר לדקה כדי למלא לחלוטין את הצד הירוק.לאחר מכן, לוותר ולהשליך כאחד עד שני מיליליטר של התקשורת, כי הזוג הראשון של מיליליטר לעתים קרובות מכילים תאים מתים או פסולת אקראית. ודא שהצד הירוק של הצינור מלא במדיה ואין לו בועות במורד הזרם של מלכודת הבועה לפני שתמשיך. מלא את שקופית הערוץ ואת המאגר עם YPD, דואג לא להציג בועות.חבר את השקופית למנגנוני הזרימה. לאחר מכן לשאוב נוזלים יותר כדי ליצור חיץ של כ 5 מטר בצד הכתום. זאת כדי למנוע השמנה בטעות של אוויר בשקופית במקרה של זרימה אחורית.עכשיו, להכין את מנגנון הזרימה להובלה למיקרוסקופ על ידי נטיעת תחילה את שקע ושקע של מלכודת הבועה סגור. ואז להדק את שסתומי בקבוקון בצד הירוק והתפוז סגור. ודא כי מכסות בורג עבור dampener פעימה ובקבוק מסנן הדוקים, כפי שהם יכולים להשתחרר במהלך autoplating.נתק את המשאבה מהצנרת כדי להקל על ההובלה. לאחר מכן להעביר את כל הרכיבים, כולל מערבב צלחת חמה, לתוך מיכל משני ליד המיקרוסקופ. חבר את גשוש הטמפרטורה לצלחת החמה, ולהתחיל לחמם את בקבוקון ההחזקה ל 37 מעלות צלזיוס.מערבבים את המדיה ב-300 סל"ד, ושומרים על זה לכל הניסוי. תן את השקופית במיקרוסקופ, ולהשתמש בקלטת במידת הצורך כדי לאבטח אותה היטב. ואז לחבר את מלכודת הבועה לוואקום.עכשיו, לחבר את המשאבה למנגנוני הזרימה. הפעל את המשאבה בקצב זרימה של 3.3 מיליליטר לדקה, ואפשר לה לפעול במשך כחמש עד עשר שניות. לאחר מכן, להסיר את מלכודת הבועה שבט המכסה לשחרר החוצה.אפשר למשאבה להמשיך לפעול בזמן שבקבוק ההחזקה מתחמם. לאחר בקבוק ההחזקה ותא הדגירה הם שניהם ב 37 מעלות צלזיוס, להוסיף מספיק תרבות לילה של תאים פטרייתיים לבקבוק ההחזקה כדי להגיע למיליון תאים למיליליטר. המתן 15 דקות כדי לאפשר לתאים להתאקלם.פתח שסתומי בקבוקון בצד הירוק והתפוז תוך סגירת שני שסתומי בקבוק הצמיחה כדי להתחיל את זרימת התאים. המתן כחמש דקות כדי לאפשר לתאים להגיע לשקופית. במהלך תקופה זו, למקד את המיקרוסקופ ולהתאים אותו לאותם פרמטרי הדמיה המשמשים בניסויים קודמים.התחל רכישת תמונה עבור שלב הקובץ המצורף. בדוק שוב לאחר כחמש ו -10 דקות כדי להבטיח כי המיקוד נשמר. אם לא, נסה להתאים את המוקד מיד לאחר שהתמונה הבאה תירכש.מיד לאחר סיום שלב הקובץ המצורף, שמור את הקובץ. לאחר מכן פתח שסתומי בקבוקון צמיחה בצד הירוק והתפוז תוך סגירת שני שסתומי בקבוקון מצורף. יש לדאוג לא להקפיץ את הבמה אם כל שסתומים נמצאים בתוך תא הדגירה.נתק את בדיקה מדחום, ולהחליף את בקבוקון המצורף עם בקבוק הצמיחה. עכשיו, להגדיר את התוכנה כדי לרכוש תמונה כל 15 דקות על פני 22 שעות, ולהתחיל רכישת תמונה לשלב הצמיחה. לאחר רכישת שלב הצמיחה הסתיימה והקובץ נשמר, לפתוח את שסתומי בקבוקון בצד הירוק והכתום, אשר עשוי לעשות רעש כמו הלחץ משחרר בצד הכתום.משוך על צינורות הצד הירוק מגיע משני flasks התקשורת, עד שהם לפחות כמה סנטימטרים מעל התקשורת. לאחר מכן, להפעיל את המשאבה במהירות גבוהה כדי להסיר את כל המדיה מן הצינור, מה שהופך את הניקוי הרבה יותר קל. לבסוף, לכמת את קטעי הווידאו כמתואר בפרוטוקול הטקסט.הפעם לשגות שדה כהה מיקרוסקופיה וידאו מראה את ההחזקה של סוג הבר קנדידה תאים אלביקניים לתת הזרימה מצע במהלך שלב ההחזקה, ואחריו הצמיחה וההתפתחות הבאים במהלך שלב הצמיחה המוביל היווצרות biofilm. הנתונים מסרטונים אלה ניתן לנתח עבור שיעורי ההחזקה התא וניתוק ביומסה לאורך זמן, המוצגים כאן הוא ביומסה הכולל בתוך אזור ההדמיה כפי שנקבע על ידי ניתוח densitometry. הקצב המצטבר של חיבור תאים וניתוק הביומסה באחוזים לאורך זמן מוצגים גם הם.בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להשתמש באותם תנאי הדמיה בכל הניסויים, מכיוון שזה מאפשר השוואות כמותיות ביניהם.

real-time-imaging-quantification-fungal-biofilm-development-using-two

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

הפרוטוקול מתאר את היישום של מערכת התא זרימה לגידול וניתוח biofilms חיידקים מיקרוסקופית סריקה Confocal לייזר (CLSM).

Pseudomonas aeruginosa ו biofilm Saccharomyces cerevisiae בתוך תאים Flow

מקור: קורץ, ד. ל. ואחרים. פלטפורמה מיקרופלואידית לחקר סגימה ביולוגית במדיה נקבובית. J. Vis. Exp. (2022)הסרטון מדגים את השימוש במכשיר מיקרופלואידי לחקר יצירת ביופילם. השעיה חיידקית מוכנסת לתעלה המיקרו, ואחריה אינקובציה לאפשר התפתחות ביופילם. לאחר מכן מתחדשת הזרימה, וניטור לחץ יחד עם הדמיה משמש לזיהוי היווצרות ביופילם וחסימת נקבוביות לאורך זמן.

מכשיר מיקרופלואידי להדמיה בזמן אמת ומעקב לחץ במהלך יצירת ביופילם

מוצג פרוטוקול לכימות והשוואה בו-זמנית של שלושה רכיבים תאיים וחוץ-תאיים בתוך ביופילמים. המתודולוגיה כוללת שימוש במיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי, תוכנת ניתוח והדמיה מבנית של ביופילם ותוכנת ניתוח סטטיסטי.

כימות בו-זמני של רכיבים תאיים וחוץ-תאיים של ביופילמים

מטרת נייר שיטות זה היא לתאר את השימוש במערכת microfluidic לפיתוח biofilms רב-מינים המכילים מינים מזוהים בדרך כלל ברובד השיניים supragingival אנושי. שיטות לתיאור ארכיטקטורת biofilm, כדאיות biofilm, וגישה לbiofilm קציר לניתוחים תלוית תרבות או תרבות העצמאית מודגשות.

שימוש בתפוקה גבוהה<em&gt; במבחנה</em&gt; מערכת Microfluidic לפתח Biofilms Multi-מינים שבעל פה

לביופילמים יש אינטראקציות מורכבות עם הסביבה הסובבת אותם. כדי לחקור באופן מקיף אינטראקציות בין ביופילם לסביבה, אנו מציגים כאן סדרה של שיטות ליצירת סביבה כימית הטרוגנית להתפתחות ביופילם, לכימות מהירות זרימה מקומית ולניתוח הובלת מסה בתוך מושבות ביופילם ובסביבתן.

שיטות לאפיון Co-הפיתוח של Biofilm ובית גידול הטרוגניות

מיקרוריאולוגיה של מעקב אחר חלקיקים חוקרת את הצמיגות של חומרים. כאן, הטכניקה משמשת לקביעת הצמיגות, תאימות הזחילה ותפקידי הצלבה יעילים של רכיבי מטריצה שונים של ביופילם חיידקי. המטריצה מורכבת מחומרים פולימריים המופרשים על ידי החיידקים ומרכיביה קובעים את מבנה הביופילם ואת התכונות המכניות.

במיפוי באתרו של התכונות מכניות של Biofilms ידי Microrheology מעקב חלקיקים

פרוטוקול זה מתאר שיטה חדשה לגדול ואיכותי לנתח biofilms חיידקים על עובש פטרייתי על ידי מיקרוסקופ confocal אלקטרונים.

שיטה חדשה לניתוח איכותי רב היקף של Biofilms חיידקית על פילמנטיות פטרייתיים המושבות Confocal שימוש במיקרוסקופ אלקטרונים

פרוטוקול זה מתאר את השימוש מכשיר microfluidic אוטומטית להתאמה אישית כדי להמחיש ביופילמים ב קנדידה אלביקנס בתנאים פיזיולוגיים המארח.

ויזואליזציה של ביופילמים ב קנדידה אלביקנס שימוש בהתקן Microfluidic אוטומטי

ביויודים מורכבים באופן מורכב מארכיטקטורות מורכבות ומתפתחות לדפוסי מרחבי מאוד תלויי קנה מידה. כאן, אנו מציגים מערכת ניסיונית (קשה ותוכנה) עבור רכישה אוטומטית של מערכות הנתונים של טומוגרפיה אופטית 3D קוהרנטית (OCT). ערכת כלים זו מאפשרת אפיון לא פולשני ורב-ממדי של הביוגנזה מורפוליולוגיה במרחב ובזמן.

אוטומטי 3D הטומוגרפיה האופטית קוהרנטית כדי להבהיר ביויובואר מורפוגנזה מעל סולמות מרחביים גדול

בשל האטימות של האדמה, לא ניתן לדמיין בקלות אינטראקציות בין המיקרובים המרכיבים אותה עם רזולוציה תאית. כאן מוצגים שני כלים מיקרופלואידיים, המציעים הזדמנויות חדשות לחקר אינטראקציות פטרייתיות-מיקרוביאליות. המכשירים הם רב-תכליתיים ופשוטים לשימוש, ומאפשרים שליטה מרחבית-טמפורלית גבוהה והדמיה ברזולוציה גבוהה ברמה התאית.

כלים מיקרופלואידיים לחקר אינטראקציות פטרייתיות-מיקרוביאליות ברמה התאית

חקור מערכת זרימה דו-שלבית להדמיה בזמן אמת של פיתוח ביופילם פטרייתי תחת תנאי זרימה משתנים. השיטה כוללת אלגוריתמים כימותיים לניתוח תמונות ומספקת תובנות לגבי דינמיקת הגדילה וההתפתחות של הביופילם.

הדמיה בזמן אמת, כימות של פיתוח Biofilm פטרייתי באמצעות מערכת זרימת Recirculating דו-שלבית

גלה סרטונים נוספים