הדמיה בזמן אמת, כימות של פיתוח Biofilm פטרייתי באמצעות מערכת זרימת Recirculating דו-שלבית
18 באוקטובר 2018
אנו מתארים את מכלול, המבצע, ועוצב ניקוי של מנגנון זרימה כדי התמונה פטרייתי ביופילמים בזמן אמת בזמן תחת זרימה. אנחנו גם מספקים ולדון אלגוריתמים כמותיים כדי לשמש על תמונות נרכשות.
שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום המיקרוביולוגיה, כגון כיצד זרימת נוזלים משנה צמיחה והתפתחות של ביופילם פטרייתי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לנו להעריך כמותית את השפעות הזרימה על צמיחה והתפתחות ביופילם בזמן אמת. התחל ניסוי זה בהרכבה של מנגנון הזרימה, כמתואר בפרוטוקול הטקסט.
ביום הניסוי, חבר את מלכודת הבועה, את גשושית הטמפרטורה ואת כל רכיבי השימוש הבודד. כדי להרכיב את המסנן, הסר את הבוכנה ממזרק של מיליליטר אחד כדי להפוך אותו למתאם. כפו את הצינורות מבקבוק המסנן לקצה זה והצמידו מסנן 2 מיקרון לצנרת המובילה לבקבוק הגדילה.
החל גריז ואקום סיליקון סביב העקיצה של מתאם השקופית לפני חיבורו, כמו זה עוזר למנוע דליפות אוויר לתוך המערכת. מלאו את בקבוקון ההחזקה ב-100 מיליליטר של YPD, ומלאו את בקבוק הגדילה ב-200 מיליליטר של YPD. ודאו שצנרת הצד הירוק מגיעה למדיה בכל בקבוקון.
ודא שכל השסתומים פתוחים. חבר את מלכודת הבועה לוואקום, וחבר את המשאבה לצד הירוק צינורות במורד הזרם של מלכודת הבועה. לשאוב את הנוזל בקצב זרימה של 3.3 מיליליטר לדקה כדי למלא לחלוטין את הצד הירוק.
לאחר מכן, לוותר ולהשליך כאחד עד שני מיליליטר של התקשורת, כי הזוג הראשון של מיליליטר לעתים קרובות מכילים תאים מתים או פסולת אקראית. ודא שהצד הירוק של הצינור מלא במדיה ואין לו בועות במורד הזרם של מלכודת הבועה לפני שתמשיך. מלא את שקופית הערוץ ואת המאגר עם YPD, דואג לא להציג בועות.
חבר את השקופית למנגנוני הזרימה. לאחר מכן לשאוב נוזלים יותר כדי ליצור חיץ של כ 5 מטר בצד הכתום. זאת כדי למנוע השמנה בטעות של אוויר בשקופית במקרה של זרימה אחורית.
עכשיו, להכין את מנגנון הזרימה להובלה למיקרוסקופ על ידי נטיעת תחילה את שקע ושקע של מלכודת הבועה סגור. ואז להדק את שסתומי בקבוקון בצד הירוק והתפוז סגור. ודא כי מכסות בורג עבור dampener פעימה ובקבוק מסנן הדוקים, כפי שהם יכולים להשתחרר במהלך autoplating.
נתק את המשאבה מהצנרת כדי להקל על ההובלה. לאחר מכן להעביר את כל הרכיבים, כולל מערבב צלחת חמה, לתוך מיכל משני ליד המיקרוסקופ. חבר את גשוש הטמפרטורה לצלחת החמה, ולהתחיל לחמם את בקבוקון ההחזקה ל 37 מעלות צלזיוס.
מערבבים את המדיה ב-300 סל"ד, ושומרים על זה לכל הניסוי. תן את השקופית במיקרוסקופ, ולהשתמש בקלטת במידת הצורך כדי לאבטח אותה היטב. ואז לחבר את מלכודת הבועה לוואקום.
עכשיו, לחבר את המשאבה למנגנוני הזרימה. הפעל את המשאבה בקצב זרימה של 3.3 מיליליטר לדקה, ואפשר לה לפעול במשך כחמש עד עשר שניות. לאחר מכן, להסיר את מלכודת הבועה שבט המכסה לשחרר החוצה.
אפשר למשאבה להמשיך לפעול בזמן שבקבוק ההחזקה מתחמם. לאחר בקבוק ההחזקה ותא הדגירה הם שניהם ב 37 מעלות צלזיוס, להוסיף מספיק תרבות לילה של תאים פטרייתיים לבקבוק ההחזקה כדי להגיע למיליון תאים למיליליטר. המתן 15 דקות כדי לאפשר לתאים להתאקלם.
פתח שסתומי בקבוקון בצד הירוק והתפוז תוך סגירת שני שסתומי בקבוק הצמיחה כדי להתחיל את זרימת התאים. המתן כחמש דקות כדי לאפשר לתאים להגיע לשקופית. במהלך תקופה זו, למקד את המיקרוסקופ ולהתאים אותו לאותם פרמטרי הדמיה המשמשים בניסויים קודמים.
התחל רכישת תמונה עבור שלב הקובץ המצורף. בדוק שוב לאחר כחמש ו -10 דקות כדי להבטיח כי המיקוד נשמר. אם לא, נסה להתאים את המוקד מיד לאחר שהתמונה הבאה תירכש.
מיד לאחר סיום שלב הקובץ המצורף, שמור את הקובץ. לאחר מכן פתח שסתומי בקבוקון צמיחה בצד הירוק והתפוז תוך סגירת שני שסתומי בקבוקון מצורף. יש לדאוג לא להקפיץ את הבמה אם כל שסתומים נמצאים בתוך תא הדגירה.
נתק את בדיקה מדחום, ולהחליף את בקבוקון המצורף עם בקבוק הצמיחה. עכשיו, להגדיר את התוכנה כדי לרכוש תמונה כל 15 דקות על פני 22 שעות, ולהתחיל רכישת תמונה לשלב הצמיחה. לאחר רכישת שלב הצמיחה הסתיימה והקובץ נשמר, לפתוח את שסתומי בקבוקון בצד הירוק והכתום, אשר עשוי לעשות רעש כמו הלחץ משחרר בצד הכתום.
משוך על צינורות הצד הירוק מגיע משני flasks התקשורת, עד שהם לפחות כמה סנטימטרים מעל התקשורת. לאחר מכן, להפעיל את המשאבה במהירות גבוהה כדי להסיר את כל המדיה מן הצינור, מה שהופך את הניקוי הרבה יותר קל. לבסוף, לכמת את קטעי הווידאו כמתואר בפרוטוקול הטקסט.
הפעם לשגות שדה כהה מיקרוסקופיה וידאו מראה את ההחזקה של סוג הבר קנדידה תאים אלביקניים לתת הזרימה מצע במהלך שלב ההחזקה, ואחריו הצמיחה וההתפתחות הבאים במהלך שלב הצמיחה המוביל היווצרות biofilm. הנתונים מסרטונים אלה ניתן לנתח עבור שיעורי ההחזקה התא וניתוק ביומסה לאורך זמן, המוצגים כאן הוא ביומסה הכולל בתוך אזור ההדמיה כפי שנקבע על ידי ניתוח densitometry. הקצב המצטבר של חיבור תאים וניתוק הביומסה באחוזים לאורך זמן מוצגים גם הם.
בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להשתמש באותם תנאי הדמיה בכל הניסויים, מכיוון שזה מאפשר השוואות כמותיות ביניהם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר מכשיר זרימה שתוכנן להדמיה בזמן אמת של היווצרות ביופילם פטרייתי בתנאי זרימה. כמו כן, המאמר דן באלגוריתמים כמותיים לניתוח התמונות שהתקבלו.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מיקרוביולוגיה
- מחקר ביופילמים
- דינמיקה של נוזלים
רקע
- ביופילמים פטרייתיים חשובים בהקשרים אקולוגיים וקליניים שונים.
- הבנת האופן שבו זרימת נוזלים משפיעה על התפתחות ביופילם היא קריטית עבור המיקרוביולוגיה.
- טכניקות דימוי בזמן אמת יכולות לספק תובנות לגבי דינמיקה של ביופילם.
- ניתוח כמותי של תמונות יכול לשפר את ההבנה של דפוסי הגדילה של ביופילם.
מטרת המחקר
- להערכת השפעות זרימת נוזלים על גדילת ביופילם פטרייתי.
- לספק שיטה לצפייה בזמן אמת בהיווצרות ביופילם.
- לפתח אלגוריתמים לניתוח כמותי של נתוני דימות.
שיטות במחקר
- הרכבת מערך זרימה לדימות.
- חיבור רכיבים כגון מלכוד בועות וגשש טמפרטורה.
- שימוש במערכת סינון לניהול זרימת הנוזלים.
- יישום אלגוריתמים כמותיים על התמונות שנרכשו.
תוצאות עיקריות
- מערכת הזרימה הניבה דימות מוצלח של התהוות ביופילם פטרייתי.
- נתונים בזמן אמת סיפקו תובנות לגבי צמיחת הביופילם תחת תנאי זרימה משתנים.
- אלגוריתמים כמותיים אפשרו ניתוח מפורט של התפתחות הביופילם.
- השיטה הדגימה יתרונות לעומת טכניקות דימות מסורתיות.
מסקנות
- מערכת הזרימה יעילה למחקר של ביופילמים פטרייתיים.
- דימיון בזמן אמת יכול לקדם משמעותית את המחקר המיקרוביולוגי.
- ניתוח כמותי חיוני להבנת הדינמיקה של ביופילמים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית להנהלה
מערכת זו מאפשרת הערכה כמותית ובזמן אמת של דינמיקת ביופילם פטרייתי תחת זרימה מבוקרת, ובכך נותנת מענה לפער קריטי במידול אינטראקציות בין מארח לפתוגן תחת מאמץ גזירה פיזיולוגי. על ידי אספקת קינטיקה של היצמדות/היפרדות ומדידות ביומסה, היא תומכת בהסרת סיכונים מכניסטית של תיקוף מטרות נוגדות פטריות בשלב הגילוי הפרה-קליני. התכנון בעלות נמוכה והתואם למיקרוסקופ מאפשרים אימוץ רחב במעבדות גילוי לצורך פנוטיפינג רפרודוקביליבילי של ביופילם.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיים
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של האופן שבו זרימת נוזלים משפיעה על היצמדות פטריות ויצירת ביופילם, ובכך מספק מידע על רלוונטיות של מטרות במודלים של זיהומים ריריים.
- ערך תפעולי: מספק מדדים כמותיים בזמן אמת של קצבי היצמדות והיפרדות של תאים תחת כוחות גזירה, ובכך תומך בסינון מטרות מונחה-השערה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר נתונים של מסה ביולוגית והתנתקות ברזולוציית זמן באמצעות דנסיתומטריה, מה שמאפשר השוואה כמותית של זניי בר (wild-type) וזני מוטציה תחת זרימה.
- ערך תפעולי: תואם למיקרוסקופים אופטיים סטנדרטיים, מה שמאפשר יישום בעלות נמוכה ובקנה מידה משתנה עבור קמפיינים של סריקת תרכובות אנטי-פטרייתיות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מדמה תנאי זרימה הרלוונטיים לקנדידה אורופרינגיאלית, ובכך מגשר בין ממצאים במערכות in vitro להתנהגות קלינית של ביופילם תחת גזירה של רוק.
- ערך תפעולי: תומך בדימות ארוך טווח של ביופילם (עד 22 שעות), מה שמאפשר ניתוח של מהלך הזמן של יעילות תרופות נוגדות פטריות ופיתוח עמידות.
אינטגרציה של זרימת עבודה וצנרת עיבוד
המכשיר משתלב ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד לאופטימיזציה של המולקולה המובילה, ומספק נתונים פנוטיפיים המותאמים לזרימה במטרה להפחית סיכונים במטרות לפני סריקת תרכובות.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבדיקה מכניסטית של נתיבי הידבקות ושל רגולטורים של ביופילם תחת זרימה רלוונטית פיזיולוגית, ומבהירה את תפקוד המטרה בהקשרי זיהום.
- סריקה: מספקת מדדי ביופילם כמותיים וסטנדרטיים (קצב הידבקות, אחוז ניתוק, ביומסה לאורך זמן) לצורך סריקה הדירה של תרכובות תחת תנאים דינמיים.
- אנליטיקה: מאפשרת כימות ביומסה מבוסס דנסיטומטריה ואנליזה קינטית של הידבקות/ניתוק, התומכת בתיעדוף פגיעות (hits) מבוסס נתונים.
- מחקר תרגומי: ממדלת מאמצי גזירה רלוונטיים לבני ברירית הפה, ובכך משפרת את הדיוק החזוי של מודלים פרה-קליניים של ביופילם לפיתוח תרופות אנטי-פטרייות.
- שימוש חוזר ארגוני: תוכנן לשימוש חוזר עם רכיבים מודולריים, מה שמאפשר סטנדרטיזציה בין מעבדות ופרויקטים החוקרים הידבקות מיקרובית תחת זרימה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית בתיקוף של מטרות נוגניות פטריות על ידי קישור הפרעות גנטיות או פרמקולוגיות לפנוטיפים של ביופילם תלויי-זרימה.
- ערך תפעולי: מבטיח הדירות באמצעות קצבי זרימה סטנדרטיים, תנאי דימות ופרוטוקולי ניתוח כמותי עקביים בין ניסויים.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשכיות הפיתוח (go/no-go) על ידי אספקת נתונים מוקדמים על יעילות הביופילם תחת התאמה לזרימה, ובכך מפחית כשלים בשלבים מאוחרים הנובעים מרלוונטיות נמוכה של המטרה בסביבות מארח דינמיות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדפות מותאמת סיכונים של מועמדים לתרופות נוגניות פטריות על בסיס ביצועיהם תחת מאמץ גזירה, בהלימה לנישות של זיהומים קליניים.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בהקמת מערכת מיקרופלואידיקה, בטכניקה סטרילית ובמיקרוסקופיה של צילומי lapsed-time להפעלה עקבית.
- נדרש מיקרוסקופ אור עם ייצוב של השולחן, בקרת טמפרטורה (37°C), ומשאבה פריסטלטית המסוגלת לספק זרימה של 3.3 mL/min.
- נדרש סטנדרטיזציה של פרמטרי הדמיה (מיקוד, תאורה, מרווחי רכישת תמונות) בין הצוותים כדי לאפשר השוואה כמותית בין הרצות.
- התאמה למינים שאינם Candida או למצעים חלופיים עשויה לדרוש אופטימיזציה של קצבי הזרימה ושל כימיית השטח כדי למנוע סתימות או biofouling.
- מגבלות מעשיות כוללות תפוקה נמוכה בשל הכנה ידנית של השקופיות ומגבלות של אזור ההדמיה, מה שהופך את השיטה לבלתי מתאימה לסריקות ראשוניות בעלות תפוקה גבוהה, אך אידיאלית למעקב מכניסטי.
