Name: טיהור של התאים נמוך-שפע ב מערכת הראייה דרוזופילה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: למד פרוטוקול לבידוד תאים נדירים במערכת הראייה של Drosophila באמצעות מיון תאים פלואורסצנטי. שיטה זו מאפשרת ניתוח גנומי וטרנסקריפטומי מדויק של מגוון סוגי תאים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה מומן על ידי NINDS של מכוני הבריאות הלאומיים תחת מספר פרס K01NS094545, andgrants מן המרכז לפלר עבור המחקר של הפרעות ניווניות. אנו להכיר לימינג טאן ו ג'ייסון מקיואן לשיחות יקרי ערך.

<ol><li>Fischbach, K. -F., Dittrich, A. P. M. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF00218858">The optic lobe of Drosophila melanogaster. I. A Golgi analysis of wild-type structure.</a> Cell and Tissue Research. 258, 441-475 (1989).</li>
<li>Pfeiffer, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+for+neuroanatomy+and+neurogenetics+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (28), 9715-9720 (2008).</li>
<li>Jenett, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+GAL4-driver+line+resource+for+Drosophila+neurobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">A GAL4-driver line resource for Drosophila neurobiology.</a> Cell Rep. 2 (4), 991-1001 (2012).</li>
<li>Xu, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+genetic+mosaics+in+developing+and+adult+Drosophila+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues.</a> Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).</li>
<li>Tan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ig+Superfamily+ligand+and+receptor+pairs+expressed+in+synaptic+partners+in+drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ig Superfamily ligand and receptor pairs expressed in synaptic partners in drosophila.</a> Cell. 163 (7), 1756-1769 (2015).</li>
<li>Peng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Fezf+coordinates+laminar-specific+connectivity+through+cell-intrinsic+and+cell-extrinsic+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Drosophila Fezf coordinates laminar-specific connectivity through cell-intrinsic and cell-extrinsic mechanisms.</a> Elife. 7, (2018).</li>
<li>Krasnow, M. A., Cumberledge, S., Manning, G., Herzenberg, L. A., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+cell+sorting+of+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Whole animal cell sorting of Drosophila embryos.</a> Science. 251 (4989), 81-85 (1991).</li>
<li>Cumberledge, S., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+analysis+of+pure+cell+populations+from+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Preparation and analysis of pure cell populations from Drosophila.</a> Methods in Cell Biology. 44, 143-159 (1994).</li>
<li>Bryant, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+differentially+expressed+genes+in+purified+Drosophila+follicle+cells%3A+toward+a+general+strategy+for+cell+type-specific+developmental+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Characterization of differentially expressed genes in purified Drosophila follicle cells: toward a general strategy for cell type-specific developmental analysis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (10), 5559-5564 (1999).</li>
<li>Neufeld, T. P., de la Cruz, A. F., Johnston, L. A., Edgar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+growth+and+cell+division+in+the+Drosophila+wing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Coordination of growth and cell division in the Drosophila wing.</a> Cell. 93 (7), 1183-1193 (1998).</li>
<li>Calvi, B. R., Lilly, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+BrdU+labeling+and+nuclear+flow+sorting+of+the+Drosophila+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescent BrdU labeling and nuclear flow sorting of the Drosophila ovary.</a> Methods in Molecular Biology. , 203-213 (2004).</li>
<li>Tirouvanziam, R., Davidson, C. J., Lipsick, J. S., Herzenberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-activated+cell+sorting+%28FACS%29+of+Drosophila+hemocytes+reveals+important+functional+similarities+to+mammalian+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-activated cell sorting (FACS) of Drosophila hemocytes reveals important functional similarities to mammalian leukocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (9), 2912-2917 (2004).</li>
<li>Bryantsev, A. L., Cripps, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+cardiac+cells+from+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Purification of cardiac cells from Drosophila embryos.</a> Methods. 56 (1), 44-49 (2012).</li>
<li>Harzer, H., Berger, C., Conder, R., Schmauss, G., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACS+purification+of+Drosophila+larval+neuroblasts+for+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">FACS purification of Drosophila larval neuroblasts for next-generation sequencing.</a> Nature Protocols. 8 (6), 1088-1099 (2013).</li>
<li>Khan, S. J., Abidi, S. N., Tian, Y., Skinner, A., Smith-Bolton, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid%2C+gentle+and+scalable+method+for+dissociation+and+fluorescent+sorting+of+imaginal+disc+cells+for+mRNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Fly+%28Austin%29%22%5BJournal%5D)">A rapid, gentle and scalable method for dissociation and fluorescent sorting of imaginal disc cells for mRNA sequencing.</a> Fly (Austin). 10 (2), 73-80 (2016).</li>
<li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-length+RNA-seq+from+single+cells+using+Smart-seq2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2.</a> Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).</li>
<li>Nern, A., Zhu, Y., Zipursky, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+N-cadherin+interactions+mediate+distinct+steps+in+the+targeting+of+lamina+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Local N-cadherin interactions mediate distinct steps in the targeting of lamina neurons.</a> Neuron. 58 (1), 34-41 (2008).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

פרוטוקול זה הוא פשוט לא טכנית קשה לביצוע, אבל יש מפתח מספר צעדים זה אם מתעלמים מהם רצון לגרום לירידה ניכרת התשואה הסלולר. (שלב 2.3.2.) זה הכרחי כי צלבים הם בריאים, כי האוכל לא יתייבש. השקיה של צלבים חיוני כדי למקסם את מספר זבובים זמין עבור ניתוח של גנוטיפ נכון את, בשלב הנכון של פיתוח. באיזו תדירות צלבים צורך להיות להשקות ישתנו בהתאם האוכל ותנאי הדיור של הזבובים. כדי להבטיח צלבים לא להתייבש, לבחון את הבקבוקונים פעמיים ביום ומוסיפים מים בהתאם. (שלב 3.3.) חשוב גם אספנו את המוח ביתור לתוך microtube יחיד שישמש עבור הדיסוציאצי...

מערכת הראייה דרוזופילה הוא מודל מצטיינים ללמוד את הבסיס הגנטי של התפתחות והתנהגות. זה מורכב של אדריכלות הסלולר הסטראוטיפי1 ערכת כלים גנטיים מתקדמים מניפולציות תא ספציפי סוגים2,3. כוח מרכזי של מערכת זו היא היכולת לחקור באופן עצמאי את ג'ין פונקציה סוגי תאים עניין עם רזולוציה תא בודד, באמצעות פסיפס גנטי שיטות4,5. חיפשנו לשלב כלים גנטיים אלה עם התפתחויות אחרונות רצף הדור הבא כדי לבצע transcriptomic ייחודיים לסוג התא, ניתוח גנומי בתא יחיד שיבוטים בניסויים פסיפס גנטי.
כדי לעשות זאת, זה חיוני לפתח שיטה חזקה ויעילה לבודד באופן סלקטיבי תא בשפע נמוך אוכלוסיות במוח. בעבר, פיתחנו פרוטוקול עבור בידוד סוגי תאים ספציפיים ב מערכת הראייה במהלך הפיתוח הגולמי דרך FACS, וקביעת transcriptomes שלהם באמצעות ה-RNA-seq6. בניסויים אלה, הרוב המכריע של תאים מסוג מסוים (למשל photoreceptors R7) הודבקו תוויות fluorescently. באמצעות שיטה זו, בניסויים פסיפס גנטי, שבה מסומנים רק ערכת משנה של תאים מאותו סוג, נכשלנו לבודד מספיק תאים כדי להשיג איכות רצף הנתונים. כדי לטפל בבעיה זו, חיפשנו להגברת התאית על ידי שיפור בפרוטוקול דיסוציאציה התא.
הגישה שלנו היתה להקטין את האורך הכולל של פרוטוקול כדי למקסם את הבריאות של תאים הפומבית, לשפר את הבריאות התאית על ידי שינוי מאגרי לנתיחה, דיסוציאציה, להפחית את כמות הפרעה מכנית הרקמה גזור. . בדקנו את פרוטוקול משופרת7 באמצעות ניתוח פסיפס עם תא repressible סמן5 (MARCM), אשר מאפשר לדור של בודדת fluorescently המסומנות שיבוטים של סוגי לתא מסוים, פראי סוג או מוטציה עבור הגן עניין ב אחרת משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים לטוס. שם, בתנאים זהים, פרוטוקול קודמות שלנו נכשל לייצר מספיק חומר RNA-seq, פרוטוקול משופרת היה מוצלח. אנו reproducibly להשיג תשואה גבוהה הסלולר (% ~ 25 תאים עם תוויות), להשיג נתונים RNA-seq באיכות גבוהה של תאים קטנה כמו 1,0007.
מספר פרוטוקולים שתוארו קודם לכן כדי לבודד סוגי לתא מסוים דרוזופילה6,8,9,10,11,12,13 , 14 , 15 , 16. פרוטוקולים אלה נועדו בעיקר עבור בידוד תאים שנמצאים בשפע בתוך המוח. פרוטוקול שלנו ממוטבת עבור בידוד אוכלוסיות תאים בשפע נמוך (פחות מ- 100 תאי המוח) ב מערכת הראייה באמצעות FACS עבור transcriptomic הבאים וניתוחים גנומית. עם פרוטוקול זה, אנו שואפים לספק דרך reproducibly בידוד תאי שופע נמוכה של מערכת הראייה לעוף על ידי FACS וקבלת נתונים transcriptome באיכות גבוהה על ידי RNA-תת סעיף.

<table><tbody><tr><td>Liberase TM</td><td>Roche</td><td>5401127001</td><td>תערובת אנזימים פרוטאוליטיים</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; S5761</td><td></td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G0350500</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטתיון</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G6013</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר מומת בחום</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת אינסולין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>I0516</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין פתרון</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P4458</td><td></td></tr><tr><td>מדיום תרבית שניידר</td><td>Gibco</td><td>21720024</td><td></td></tr><tr><td>פפאין</td><td>וורת'ינגטון</td><td>LK003178</td><td></td></tr><tr><td>2-מרקפטואתנול&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250-100ML</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td>ערכת טיהור RNA</td></tr><tr><td>ללא RNase DNase</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript II Reverse Transcriptase</td><td>Life Technologies</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>dNTP Mix</td><td>Life Technologies</td><td>R0191</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 פתרון</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M1028-10X1ML</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת בטאין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>B0300-1VL</td><td></td></tr><tr><td>RNaseOUT</td><td>Life Technologies</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>Q5 נאמנות גבוהה 2x מאסטר מיקס</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>M0492S</td><td></td></tr><tr><td>ערכת טיהור PCR MinElute</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT ערכת הכנה לספריית</td><td>DNA Illumina</td><td>FC-131-1024</td><td></td></tr><tr><td>ערכת אינדקס Nextera XT</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1001</td><td></td></tr><tr><td>מבחנה עם מסננת תאים מכסה הצמד</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>מערכות מסנן ואקום בקבוק</td><td>קורנינג</td><td>CLS431153</td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer F1.5</td><td>Eppendorf</td><td>5384000020</td><td></td></tr><tr><td>FACSAria Flow Cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td>656700</td><td></td></tr><tr><td>מערכת ריצוף HiSeq 2500</td><td>Illumina</td><td>SY&ndash; 401&ndash; 2501</td><td></td></tr></tbody></table>

טיהור של התאים נמוך-שפע ב מערכת הראייה דרוזופילה

Purification of Low-abundant Cells in the Drosophila Visual System

השיפורים האחרונים בהרגישות של רצף הדור הבא יש הקלה היישום של transcriptomic וניתוחים גנומית למספר קטן של תאים. ניצול הטכנולוגיה הזאת ללמוד פיתוח במערכת דרוזופילה חזותי, ובו שפע של כלים גנטיים ייחודיים לסוג התא, מספקת גישה רב-עוצמה למיעון הבסיס המולקולרי של פיתוח עם רזולוציה הסלולר מדויק. עבור גישה כזו להיות ריאלי, זה הכרחי יש את היכולת לשלוט בצורה אמינה ויעילה לטהר תאים נוכח שפע נמוך בתוך המוח. כאן, אנו מציגים שיטה המאפשרת טיהור יעיל של תא בודד שיבוטים בניסויים פסיפס גנטי. עם פרוטוקול זה, נוכל להגיע באופן עקבי הסלולר תשואה גבוהה לאחר טיהור באמצעות קרינה פלואורסצנטית מופעל התא מיון (FACS) (% ~ 25 תאים עם תוויות כל), בהצלחה ביצע ניתוחים transcriptomics על שיבוטים תא בודד שנוצר דרך ניתוח פסיפס עם סמן תא repressible (MARCM). פרוטוקול זה הינו אידיאלי עבור החלת transcriptomic וניתוחים גנומית לסוגי תאים מסוים ב מערכת הראייה, מעבר בשלבים שונים של פיתוח, בהקשר של שינויים גנטיים שונים.

הערכה כללית ערכה הכללית של הפרוטוקול מוצג באיור1. הפרוטוקול מחולק לשלושה חלקים מרכזיים: לטוס בעבודה, הכנת הדוגמא, רצף של ניתוח נתונים. הפעלת "תכנון לפני הניסוי" של הפרוטוקול אינו כולל את הערכה כללית של פשטות.
ציר הזמן לוח שנה של החלקים העיקריים של הפרוטוקול (עבודה לעוף, הכנת הדוגמא) מוצג באיור2.
<p class="jove_content" fo:keep...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול דיסוציאציה תא לבידוד ביעילות תאים נוכח שפע נמוך בתוך מערכת הראייה דרוזופילה דרך התא פלורסצנטיות מופעל מיון (FACS).

Recent improvements in the sensitivity of next generation sequencing have facilitated the application of transcriptomic and genomic analyses to small ...

שיטה זו יכולה לסייע לענות על שאלות מפתח בביולוגיה, כגון כיצד סוגי תאים מגוונים נוצרים ומאורגנים במבנים מסדר גבוה יותר עם פונקציות ספציפיות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת טיהור יעיל של תאים הקיימים בשפע נמוך במערכת הראייה Drosophila לניתוח תעתיק וגנומי. ביום שלישי בשבוע השישי של הפרוטוקול, 45 דקות לפני הניתוחים, לאחזר בקבוקון אחד של אבקת פפאין מארבע מעלות צלזיוס ו דגירה אותו בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, הניחו בצד את המדיום של שניידר, או CSM, בצינור אפנדורף בטמפרטורת החדר כדי להוסיף לאבקת הפפאין מאוחר יותר. חמש עד עשר דקות לפני הניתוחים, השתמש במזרק כדי להוסיף את טמפרטורת החדר CSM לבקבוקון של פפאין ישירות דרך הכובע לריכוז של 100 יחידות למיליליטר. כדי לערבב, תחילה להפוך את הבקבוקון כדי ללכוד כל אבקה תקועה בחלק הפנימי של הכובע ולאחר מכן pipette את התוכן למעלה ולמטה.לאחר ערבוב reagents, להביא את המים עד 37 מעלות צלזיוס בסק במזנון באמבט מים. לאחר מכן מניחים את הבקבוקון בתוך הבקבוק במשך 30 דקות כדי להפעיל את papain ולוודא כי הבקבוקון אינו צף. בזמן שהפאפאין דגירה, יש לאחזר מהמקפיא תערובת של אנזימים פרוטאוליטיים ולטגירה בטמפרטורת החדר.לאחר 30 דקות של הפעלה, הדגירה פפאין בטמפרטורת החדר. ביום שלישי בשבוע השישי, לנתח את המוחות התלמידים מבוים ב CSM קר עם מדפים נקיים. לנתח מוחות רבים ככ

purification-of-low-abundant-cells-in-the-drosophila-visual-system

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

במאמר וידאו זה אנו מציגים שיטה בידוד וטיהור...

בידוד טיהור תסיסנית נוירונים היקפיים על ידי מיון ביד מגנטי

הגישה הסטנדרטית כדי להכין את...

הכנת למבוגרים תסיסנית עיניים עבור חתך דק ניתוח מיקרוסקופי

נתיחה ואימונוהיסטוכימיה של זחל, גלמים ומבוגרים<em&gt; דרוזופילה</em&gt; רשתיות

מקור: Wagner, K. et al., חקר סחר בחלבוני ממברנה בתאי קולטני אור של דרוזופילה באמצעות חלבונים מתויגים eGFP. J. Vis. Exp. (2022). סרטון זה מדגים את ההדמיה של סחר בחלבון ממברנה בתאי קולטני אור של דרוזופילה באמצעות חלבוני TRPL מתויגים eGFP. הוא מפרט את הכנת הזבובים הטרנסגניים להדמיה, לכידת תמונות פלואורסצנטיות של תאים קולטני אור וכימות סחר TRPL על ידי מדידת פלואורסצנטיות eGFP יחסית ברבדומרים.

חקר סחר בחלבוני ממברנה בתאי קולטני אור של דרוזופילה

שיטת העגבניות / GFP-FLP / FRT כרוכה לדמיין תאי קולטי אור פסיפס בחיים דרוזופילה. ניתן להשתמש בו כדי לעקוב אחר גורלם של תאי קולטי אור ברשתית בודד במשך ימים או שבועות. שיטה זו היא אידיאלית ללימודים של ניוון רשתית ומחלות ניווניות או התפתחות תאי קולטי אור.

העגבניות / GFP-FLP / FRT שיטת ההדמיה חיה של פסיפס למבוגרים בלבד<em&gt; דרוזופילה</em&gt; תאי קולטי אור

פרוטוקול זה מציג שיטה יעילה להדמיה של נוירואפיתל עין גולם חי של דרוזופילה. שיטה זו מפצה על תנועת רקמות וטופולוגיה לא אחידה, משפרת את ההדמיה של גבולות התא באמצעות שימוש בחלבוני צומת מרובים המתויגים ב-GFP, ומשתמשת במתקן הדמיה המורכב בקלות.

Live-הדמיה של דרוזופילה גלמי עין

מאמר זה מציג שיטה כירורגית ניקוד דרוזופילה הרשתיות הגולמי יחד עם פרוטוקולים עיבוד רקמה אימונוהיסטוכימיה, ניתוח המערבי של RNA-חילוץ.

דיסקציה של הרשתית הגולמי דרוזופילה אימונוהיסטוכימיה, ניתוח המערבי של RNA בידוד

בהתבסס על מנגנון ההרכבה של קומפלקס החלבון INAD, בפרוטוקול זה פותחה אסטרטגיית טיהור זיקה משופרת בתוספת אסטרטגיית תחרות כדי לטהר את ערוץ ה- TRP האנדוגני Drosophila .

טיהור של תעלות פוטנציאליות של קולטן חולף דרוזופילה אנדוגנית

כאן מתוארות שיטות לא פולשניות ללוקליזציה של חלבוני קרום פוטורצפטור ולהערכת ניוון הרשתית בעין המורכבת דרוזופילה באמצעות פלואורסצנציה eGFP.

חקר סחר בחלבוני ממברנה בתאי דרוזופילה פוטורצפטור באמצעות חלבונים המתויגים על ידי eGFP

אנו מציגים פרוטוקול לאפיון אלקטרופיזיולוגי של פוטופיגמנטים דו-יציבים: (1) ניצול תזוזות המטען בתוך מולקולות הפוטוגמנט בעקבות בליעת הפוטונים וכמותם העצומה בפוטורצפטורים, ו-(2) ניצול הבדלי הספיגה-ספקטרום של מצבי הפוטוגמנט של רודופסין ומטרהודופסין. פרוטוקולים אלה שימושיים לסינון מוטציות המשפיעות על מערכות פוטופיגמנט דו-יציבותיות.

שיטות אלקטרופיזיולוגיות למדידת רמות פוטופיגמנט בדרוזופילה פוטורצפטורים

פרוטוקול זה מתאר תיוג פלואורסצנטי מותאם אישית מבוסס נוגדנים והזרקה לעוברים מוקדמים של דרוזופילה כדי לאפשר הדמיה חיה של חלבונים בשפע נמוך או שינויים לאחר תרגום שמאתגרים לזיהוי באמצעות גישות GFP/mCherry-tag מסורתיות.

הדמיה של חלבונים בשפע נמוך ושינויים לאחר תרגום בעוברי דרוזופילה חיים באמצעות הזרקת נוגדנים פלואורסצנטיים

למד פרוטוקול לבידוד תאים נדירים במערכת הראייה של Drosophila באמצעות מיון תאים פלואורסצנטי. שיטה זו מאפשרת ניתוח גנומי וטרנסקריפטומי מדויק של מגוון סוגי תאים.

טיהור של התאים נמוך-שפע ב מערכת הראייה דרוזופילה

גלה סרטונים נוספים