ניתוח של β-עמילואיד-induced הפרעות על מבנה קריש פיברין על ידי ספקטרוסקופיה וסריקת מיקרוסקופ אלקטרונים

להלן מוצגות שתי שיטות שבהן ניתן להשתמש בנפרד או במשולב כדי לנתח את השפעת בטא עמילואיד על מבנה קריש פיברין. כלול הוא פרוטוקול עבור יצירה של במבחנה clot פיברין, ואחריו קריש עכירות ואלקטרון סריקה שיטות.

היתרון העיקרי של זה צלחת מבוססי עגימות מבחן הוא שזה מהיר ומאפשר כמה מעכבי אינטראקציה עמילואיד-בטא פיברינוגן להיות מוקרן בבת אחת ללא התקנה מתוחכמת או דרישות. ניתן להעריך עוד יותר את תרכובות הראש נמצאות בבדיקה של עיסת פיברין על יכולתן לשחזר חריגות מבניות הנגרמות על-ידי A-beta בקרישי הפיברין שנותחו על-ידי סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים. הדגמה חזותית של הכנת קריש לסריקת ניתוח מיקרוסקופ אלקטרונים היא קריטית כמו כל וריאציות בהכנה יכול לתרום וריאציות בתוך התוצאות הניסוי.

המוקד של ההדגמה הזאת כאן הוא על אינטראקציות פיברינוגן A-בטא. פרוטוקול זה ניתן לשנות בקלות כדי לנתח אינטראקציות אחרות עם חלבונים אחרים ואת התרכובות עם קריש פיברין. התחל על ידי הוספת 1.5 micromolar של פיברינוגן מוכן טרי ב 200 microliters של חיץ היווצרות קריש לכל A-בטא שלילי 42 המכיל ולשלוט בארות דגירה את הצלחת על פלטפורמה מסתובבת בטמפרטורת החדר.

לאחר 30 דקות בו זמנית להוסיף 30 microliters של פתרון תרומבין מוכן טרי ישירות למרכז של היטב המכיל פיברינוגן ליזום היווצרות קריש ומיד לקרוא את הספיגה של קרישי במבחנה ב 350 ננומטר, חוזר על המדידה כל 30 עד 60 שניות במהלך 10 דקות. כדי להעריך את ההשפעה של מעכבי אינטראקציה פיברינוגן A-בטא על מבנה קריש פיברין, תחילה להשתמש במלקחיים כדי למקם נקי, 12 מילימטר סיליקון עיגול זכוכית מכסה מחליק ל בארות בודדות של צלחת 12 היטב ולהוסיף 80 microliters של פיברינוגן על כל להחליק כיסוי, בעדינות להפיץ את הפתרון, כך שהם מופצים באופן שווה. הוסף 20 microliters של פתרון תרומבין לכל באר ליזום היווצרות קריש.

מכסים את הצלחת במשך 30 עד 60 דקות דגירה בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן בעדינות להטביע כל קריש בשני מיליליטר של חיץ קסודילאט נתרן קר כקרח במשך שתי דקות, מכוסה, בטמפרטורת החדר פעמיים, באמצעות פיפטה מיליליטר אחד כדי להסיר בזהירות את החיץ לאחר כל שטיפה. לאחר הכביסה האחרונה, לבדוק את המצב של היווצרות קריש על להחליק את הכיסוי ולתקן את הקרישים לשניים עד שלושה מיליליטר של קרח קר 2% glutaraldehyde על הקרח במשך 30 דקות. בסוף הדגירה, להסיר בעדינות את glutaraldehyde מכל באר ולשטוף את הקרישים עם חיץ ק קוריקט נתרן טרי כפי שהוכח על קרח.

כדי לחות את הקרישים הקבועים בסדרה מדורגת של חמש דקות קרות קרח אתנול שוטף על קרח מבלי להסיר לחלוטין את האתנול בין לשטוף כדי לשמור על קרישי הדם מוגנים מפני חשיפה לאוויר. במהלך 100% שטיפת האתנול האחרונה, מעבירים את החלקות הכיסוי למחזיק דגימת מייבש נקודה קריטי, ומניחים לפחות מכונת כביסה אחת בין כל החלקת כיסוי ומניחים את המחזיק בתא מייבש נקודה קריטי מלא באתנול. לאחר מחזור ייבוש של 30 דקות, השתמש בקלטת פחמן כדי להרכיב את מחליקי הכיסוי על ספלים בודדים של מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה ולהעביר את הדגימות לתא הציפוי של מעיל sputter ואקום.

ואז מעיל sputter פחות מ 20 ננומטר של פלדיום זהב או חומרים מוליך אחרים על הדגימות במשך 25 שניות בארבע אנגסטרום לשנייה ותמונה הדגימות על מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה מצויד בסוג שני גלאי אלקטרונים משניים בארבעה קילו-וולט. היווצרות קריש פיברין גורמת לפיזור האור העובר דרך הפתרון, וכתוצאה מכך מערבולת מוגברת כי מישורים בסוף תקופת הקריאה. כאשר פיברינוגן הוא דגירה בנוכחות A-beta 42 העכור של הפתרון פוחתת עם העקומה להגיע לגובה מרבי של כמחצית מזה של פיברינוגן בלבד.

בנוכחות חוסם אינטראקציה A-beta 42 ההשפעה של בטא עמילואיד הוא ameliorated ואת עכור הוא גבוה יותר מזה עם A-בטא לבד. ההשפעה של החוסם אינה מופיעה בשל מערבולת רקע כמו המתחם אינו משנה את מערבולת קריש פיברין כאשר A-בטא נעדר. כמו כן, היווצרות קריש בנוכחות GPRP, פפטיד ידוע להפריע פילמור פיברין, מדגים כורכום מופחת באופן משמעותי לעומת היווצרות קריש פיברין בהיעדר המעכב.

פיברינוגן שנוצר בנוכחות טרומבין וסידן כלורי רק יוצרים רשת פיברין עם חוטים מוארכים ומזורכים של פיברין, כמו גם חבילות גדולות יותר. כאשר A-בטא קיים, חוטי פיברין הפך דק יותר עם כמה גושים דביקים אגרגטים, המציין A-בטא המושרה מומים מבניים. עולה בקנה אחד עם תוצאות הבדיקה מערבולת, היווצרות קריש בנוכחות חוסם אינטראקציה פיברינוגן A-בטא משחזר חלקית את המבנה של קריש פיברין מן השינויים הנגרמים על ידי A-בטא כמו גושים פחות נצפו עם טיפול זה.

בדיקת מערבולת קריש וסריקת פרוטוקולי ניתוח מיקרוסקופ אלקטרונים כבר אופטימיזציה להערכת מספר מעכבי אינטראקציה פיברינוגן A-בטא בצורה מהירה לשחזור. ובקרוב נתונים יספקו מידע רב ערך על היווצרות קריש פיברין שניתן ליישם למחקרים נוספים הן במבחנה והן ב- vivo.