ניתוח של β-עמילואיד-induced הפרעות על מבנה קריש פיברין על ידי ספקטרוסקופיה וסריקת מיקרוסקופ אלקטרונים
30 בנובמבר 2018
להלן מוצגות שתי שיטות שבהן ניתן להשתמש בנפרד או במשולב כדי לנתח את השפעת בטא עמילואיד על מבנה קריש פיברין. כלול הוא פרוטוקול עבור יצירה של במבחנה clot פיברין, ואחריו קריש עכירות ואלקטרון סריקה שיטות.
היתרון העיקרי של זה צלחת מבוססי עגימות מבחן הוא שזה מהיר ומאפשר כמה מעכבי אינטראקציה עמילואיד-בטא פיברינוגן להיות מוקרן בבת אחת ללא התקנה מתוחכמת או דרישות. ניתן להעריך עוד יותר את תרכובות הראש נמצאות בבדיקה של עיסת פיברין על יכולתן לשחזר חריגות מבניות הנגרמות על-ידי A-beta בקרישי הפיברין שנותחו על-ידי סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים. הדגמה חזותית של הכנת קריש לסריקת ניתוח מיקרוסקופ אלקטרונים היא קריטית כמו כל וריאציות בהכנה יכול לתרום וריאציות בתוך התוצאות הניסוי.
המוקד של ההדגמה הזאת כאן הוא על אינטראקציות פיברינוגן A-בטא. פרוטוקול זה ניתן לשנות בקלות כדי לנתח אינטראקציות אחרות עם חלבונים אחרים ואת התרכובות עם קריש פיברין. התחל על ידי הוספת 1.5 micromolar של פיברינוגן מוכן טרי ב 200 microliters של חיץ היווצרות קריש לכל A-בטא שלילי 42 המכיל ולשלוט בארות דגירה את הצלחת על פלטפורמה מסתובבת בטמפרטורת החדר.
לאחר 30 דקות בו זמנית להוסיף 30 microliters של פתרון תרומבין מוכן טרי ישירות למרכז של היטב המכיל פיברינוגן ליזום היווצרות קריש ומיד לקרוא את הספיגה של קרישי במבחנה ב 350 ננומטר, חוזר על המדידה כל 30 עד 60 שניות במהלך 10 דקות. כדי להעריך את ההשפעה של מעכבי אינטראקציה פיברינוגן A-בטא על מבנה קריש פיברין, תחילה להשתמש במלקחיים כדי למקם נקי, 12 מילימטר סיליקון עיגול זכוכית מכסה מחליק ל בארות בודדות של צלחת 12 היטב ולהוסיף 80 microliters של פיברינוגן על כל להחליק כיסוי, בעדינות להפיץ את הפתרון, כך שהם מופצים באופן שווה. הוסף 20 microliters של פתרון תרומבין לכל באר ליזום היווצרות קריש.
מכסים את הצלחת במשך 30 עד 60 דקות דגירה בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן בעדינות להטביע כל קריש בשני מיליליטר של חיץ קסודילאט נתרן קר כקרח במשך שתי דקות, מכוסה, בטמפרטורת החדר פעמיים, באמצעות פיפטה מיליליטר אחד כדי להסיר בזהירות את החיץ לאחר כל שטיפה. לאחר הכביסה האחרונה, לבדוק את המצב של היווצרות קריש על להחליק את הכיסוי ולתקן את הקרישים לשניים עד שלושה מיליליטר של קרח קר 2% glutaraldehyde על הקרח במשך 30 דקות. בסוף הדגירה, להסיר בעדינות את glutaraldehyde מכל באר ולשטוף את הקרישים עם חיץ ק קוריקט נתרן טרי כפי שהוכח על קרח.
כדי לחות את הקרישים הקבועים בסדרה מדורגת של חמש דקות קרות קרח אתנול שוטף על קרח מבלי להסיר לחלוטין את האתנול בין לשטוף כדי לשמור על קרישי הדם מוגנים מפני חשיפה לאוויר. במהלך 100% שטיפת האתנול האחרונה, מעבירים את החלקות הכיסוי למחזיק דגימת מייבש נקודה קריטי, ומניחים לפחות מכונת כביסה אחת בין כל החלקת כיסוי ומניחים את המחזיק בתא מייבש נקודה קריטי מלא באתנול. לאחר מחזור ייבוש של 30 דקות, השתמש בקלטת פחמן כדי להרכיב את מחליקי הכיסוי על ספלים בודדים של מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה ולהעביר את הדגימות לתא הציפוי של מעיל sputter ואקום.
ואז מעיל sputter פחות מ 20 ננומטר של פלדיום זהב או חומרים מוליך אחרים על הדגימות במשך 25 שניות בארבע אנגסטרום לשנייה ותמונה הדגימות על מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה מצויד בסוג שני גלאי אלקטרונים משניים בארבעה קילו-וולט. היווצרות קריש פיברין גורמת לפיזור האור העובר דרך הפתרון, וכתוצאה מכך מערבולת מוגברת כי מישורים בסוף תקופת הקריאה. כאשר פיברינוגן הוא דגירה בנוכחות A-beta 42 העכור של הפתרון פוחתת עם העקומה להגיע לגובה מרבי של כמחצית מזה של פיברינוגן בלבד.
בנוכחות חוסם אינטראקציה A-beta 42 ההשפעה של בטא עמילואיד הוא ameliorated ואת עכור הוא גבוה יותר מזה עם A-בטא לבד. ההשפעה של החוסם אינה מופיעה בשל מערבולת רקע כמו המתחם אינו משנה את מערבולת קריש פיברין כאשר A-בטא נעדר. כמו כן, היווצרות קריש בנוכחות GPRP, פפטיד ידוע להפריע פילמור פיברין, מדגים כורכום מופחת באופן משמעותי לעומת היווצרות קריש פיברין בהיעדר המעכב.
פיברינוגן שנוצר בנוכחות טרומבין וסידן כלורי רק יוצרים רשת פיברין עם חוטים מוארכים ומזורכים של פיברין, כמו גם חבילות גדולות יותר. כאשר A-בטא קיים, חוטי פיברין הפך דק יותר עם כמה גושים דביקים אגרגטים, המציין A-בטא המושרה מומים מבניים. עולה בקנה אחד עם תוצאות הבדיקה מערבולת, היווצרות קריש בנוכחות חוסם אינטראקציה פיברינוגן A-בטא משחזר חלקית את המבנה של קריש פיברין מן השינויים הנגרמים על ידי A-בטא כמו גושים פחות נצפו עם טיפול זה.
בדיקת מערבולת קריש וסריקת פרוטוקולי ניתוח מיקרוסקופ אלקטרונים כבר אופטימיזציה להערכת מספר מעכבי אינטראקציה פיברינוגן A-בטא בצורה מהירה לשחזור. ובקרוב נתונים יספקו מידע רב ערך על היווצרות קריש פיברין שניתן ליישם למחקרים נוספים הן במבחנה והן ב- vivo.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטות לניתוח השפעת בטא-עמילואיד על מבנה קריש פיברין, כולל פרוטוקול להכנת קריש פיברין במעבדה (in vitro) ושיטות למדידת עכירות הקריש ומיקרוסקופיה אלקטרונית סורקת.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- ביוכימיה
- ביולוגיה של התא
רקע
- בטא-עמילואיד מעורב במחלות ניווניות של מערכת העצבים.
- קרישי פיברין ממלאים תפקיד בתהליכים ביולוגיים שונים.
- הבנת מבנה קריש הפיברין יכולה לספק תובנות לגבי מנגנוני מחלות.
- מחקרים קודמים הראו חריגות מבניות בקרישי פיברין עקב A-beta.
מטרת המחקר
- להערכת ההשפעה של בטא-עמילואיד על מבנה קריש פיברין.
- لسריקת מעכבים של אינטראקציות בין עמילואיד-בטא לפיברינוגן.
- להדגמת הכנת קרישים לניתוח באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- בדיקת עכירות מבוססת פלטה לסריקה מהירה.
- הכנת קרישי פיברין in vitro באמצעות פיברינוגן.
- מיקרוסקופיה אלקטרונית סורקת לניתוח מבנה הקריש.
- התאמת פרוטוקולים למחקר של אינטראקציות בין חלבונים אחרים.
תוצאות עיקריות
- זיהוי תרכובות מובילות (head compounds) המשחזרות את השלמות המבנית.
- הדגמה חזותית של הכנת הקריש חיונית לשם עקביות.
- שינויים בהכנה עלולים להשפיע על תוצאות הניסוי.
- פוטנציאל ליישומים רחבים יותר בחקר אינטראקציות בין חלבונים.
מסקנות
- השיטות המוצגות יעילות לניתוח מבנה קרישי פיברין.
- סריקת מעכבים עשויה להוביל לתובנות לגבי אסטרטגיות טיפוליות.
- מחקרים נוספים יכולים להרחיב את הידע על אינטראקציות של חלבונים אחרים.
שאלות נשאלות בתדירות גבוהה
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
פרוטוקול זה מאפשר סריקה מהירה ו可שחזרת של מעכבים לאינטראקציה בין עמילואיד-בטא לפיברינוגן באמצעות בדיקת עכירות מבוססת פלטה, ובכך הוא תומך בתיקוף מטרות בשלב מוקדם בפיתוח טיפוליים למחלת אלצהיימר. השיטה מספקת נתונים כמותיים על היווצרות קרישי דם ואישור מבני באמצעות מיקרוסקופיה אלקטרונית סורקת (SEM), מה שמקל על מעבר משלב הזיהוי לשלב העמקה (hit-to-lead) עבור תרכובות המפחיתות הפרעות בקרישי פיברין המושרות על ידי A-beta. באמצעות שילוב של קריאות עכירות עם דימויי SEM, הגישה מספקת הפחתת סיכונים מכניסטית וביטחון חיזוי עבור תוכניות גילוי המכוונות למערכת כלי הדם הנוירולוגית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן את ההשערה הטיפולית שאינטראקציה בין A-beta לבין פיברינוגן מניעה היווצרות קרישים פתולוגית במחלת אלצהיימר.
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף תפקודי של המטרה על ידי מדידת עכוריות הקריש כקריאה ישירה של עיכוב קישור A-beta לפיברינוגן.
- ערך ניבוי: תומך במיון תיקי פיתוח באמצעות זיהוי תרכובים המשחזרים מבנה תקין של קריש פיברין, דבר המעיד על מעורבות המטרה והפחתת סיכון ביולוגי.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מוכנות הבדיקה: בדיקת העכירות המותאמת היא מהירה, בעלת הדירות גבוהה ותואמת לפורמטים של פלטות רב-בארים לסריקת ספריות תרכובות גדולות.
- פלט כמותי: מודד בליעה באורך גל של 350 nm לאורך זמן, ומספק נתונים קינטיים על היווצרות קריש המבדילים בין יעילות המעכב להשפעות רקע.
- אישור מבני: תרכובות שהתגלו (hits) בסריקת העכירות מאומתות באמצעות SEM כדי לה可חזות את השחזור של ארכיטקטורת קריש הפיברין, ובכך להבטיח שהתוצאות אינן ארטיפקטים של הבדיקה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מדמה מנגנון צרברו-וסקולרי של פתולוגיה של אלצהיימר, המקשר בין A-beta להפרעות בקרישי פיברין הקשורות למיקרו-אינפארקטים ואנגיופתיה עמילואידית מוחית.
- המשכיות תרגומית: מקשרת בין מעורבות מטרה in vitro (עכירות) לבין מבנה פנוטיפי של קריש (SEM), ובכך תומכת בהפחתת סיכונים מנגנונית לפני תיקוף in vivo.
- קידום מותאם סיכונים: מאפשרת קבלת החלטות go/no-go בהתבסס על קריטריונים כפולים: עיכוב של עיכוב היווצרות הקריש והפיכת הפרעות מבניות.
שילוב זרימת עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי המוקדם, ומאפשרת בדיקת היפותזה של האינטראקציה בין A-beta לפיברינוגן כמטרה לטיפול תרופתי, כאשר התוצאים מזינים תהליכי זיהוי מובילים (lead identification) ותהליכי תיקוף פרה-קליניים.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת השערות על ידי כימות האופן שבו A-beta משנה את העכירות ואת המבנה של קרישי פיברין, ובכך מבהיר את מעורבות המסלול בתפקוד נוירו-וסקולרי לקוי.
- סריקה: מספק מוכנות של הבדיקה והדירות לצורך הערכה בסריקה רחבה (high-throughput) של מעכבים של האינטראקציה בין A-beta לפיברינוגן בפורמט של פלטת 96 בארות.
- אנליטיקה: מספק קינטיקה של עכירות ומדדי מבנה מבוססי SEM המאפשרים ניתוח השוואתי של השפעות תרכובות על היווצרות הקריש וארכיטקטורתו.
- מחקר תרגומי: מקשר בין עיכוב המטרה לשיקום פנוטיפי של הקריש, בהתאמה לרצף פרה-קליני עבור מודלים נוירו-וסקולריים של מחלת אלצהיימר.
- שימוש חוזר ארגוני: זרימת העבודה של עכירות-SEM היא פלטפורמה הניתנת לשימוש חוזר וישמה על אינטראקציות אחרות בין חלבונים לפיברינוגן מעבר ל-A-beta, ובכך תומכת במאמצים רחבים של תיקוף מטרות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מספק ביטחון חיזוי על ידי קישור עיכוב ביוכימי להחלמה מבנית של קריש, ובכך מפחית עמימות מכניסטית בתיקוף המטרה.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה והדירות באמצעות פרוטוקולים מותאמים להכנת קריש, שטיפה, קיבוע ודימות.
- ערך אסטרטגי: משפר את איכות ההחלטות לגבי המשך הפיתוח (go/no-go) על ידי דרישה לתיקוף פונקציונלי (עכירות) ומבני (SEM), ובכך מפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכון של מעכבים המדגימים תיקון כפול של עיכוב ביצירת קריש ופתולוגיה מבנית.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בהכנת חלבונים, במבחני היווצרות קרישי דם ובחשיפת דגימות להדמיית מיקרוסקופ אלקטרוני סורק (SEM).
- תלוי בגישה לקורא פלטות המסוגל לבצע מדידות בולענות קינטיות ב-350 nm ובמכשיר לציפוי בריקוע (vacuum sputter coater) עם יכולת דימוי SEM.
- מחייב סטנדרטיזציה של שלבי קיבוע הקריש, ההתייבשות והייבוש כדי למנוע ארטיפקטים מבניים שעלולים להטעות את פרשנות ה-SEM.
- כולל שיקולי התאמה בעת הרחבת הפרוטוקול לאינטראקציות אחרות בין חלבונים לפיברינוגן, במיוחד בהרכב התמיסה (buffer) ובזמני האינקובציה.
- כולל מגבלות מעשיות כגון הצורך בהכנת ריאגנטים טריים וטיפול זהיר למניעת שונות בקרישים עקב חשיפה לאוויר או שטיפה לא עקבית.
