Name: מודל במבחנה של מערכת מקבילה-Plate זלוף ללמוד חיידקי ההקפדה להשתיל רקמות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: חקור את דבקות החיידקים לרקמות השתלה במודל מערכת זרימה במבחנה. שיטה זו מאפשרת חקירת אנדוקרדיטיס זיהומית ואינטראקציות מולקולריות בין חיידקים, תאי דם ותאי אנדותל.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה מומן על ידי מענק של לופן KU קרן מחקר (OT 14 097) שניתנה RH. TRV היה בחור דוקטורט של קרן המחקר FWO - פלנדרס (בלגיה; להעניק מספר - 12K0916N) ו RH הוא נתמך על ידי קרן מחקר קליני של UZ לוון.

1. מכינים את השתלת רקמות ללימודי במבחנה
הערה: שלושה סוגים של רקמות שימשו: תיקון קרום הלב שור (BP), שתלי מאותו מין Cryopreserved (CH), ומוחלף שור (BJV). במקרה של צינור BJV ושר (רקמות מעובד על ידי הבנק האירופי מאותו מין (אב) ומאוחסנים לפני השימוש בחנקן נוזלי), שימשו קיר והן valvular פליירים. BP תיקון של צינור BJV נרכשו מן היצרנים. לפני השימוש, יש להפשיר CH בעקבות ההוראות אב12.
<ol><li>שוטפים לכל רקמות עם 0.9% NaCl לפני השימוש.</li>
	<li>להכין ביופסיות רקמות באמצעות ביופסיה העור חד פעמי ניקוב לחתוך חתיכות רקמה מעגלית (10 מ מ קוטר).</li>
	<li>חותכים כל רקמת טלאים לאותו גובה שימוש חד פעמי סטרילי ואזמלי מנתחים.</li>
	<li>בשביל לרקמות קבוע עם גלוטראלדהיד (לדוגמה BJV conduit), דגירה שתל חתיכות בן לילה 4 ° C עם 200 גרם/ליטר של אלבומין האדם לנטרל את מקבע.</li>
	<li>תשטוף את שאריות גלוטראלדהיד עם 0.9% NaCl בצלחת microtiter.  חזור על 3 פעמים במשך דקה אחת.</li>
</ol>2. הכנת את החיידקים לניסויים זלוף
הערה: שלושה מבודד חיידקי שימשו: S. aureus קאוון (בקרת האוויר 12598), ס' epidermidis בקרת האוויר 149900, ס sanguinis NCTC 7864. S. aureus ו ס epidermidis גדלו ב- 37 מעלות צלזיוס ב ציר סויה tryptic (TSB), ס' sanguinis גדל ב 37 ° C עם 5% CO2 בהמוח הלב אינפוזיה מרק (BHI).
<ol><li>מכינים לילה התרבות של חיידקים על צלחת אגר דם מוצק.<ol>
<li>השתמש לולאה סטרילי שתגרד את החיידקים קפוא לחסן על צלחת אגר דם מולר-הינטון לתרבות לילה ב 37 º C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>השתמש לולאה חיסון סטרילי כדי לאסוף מושבה בודדת מתרבות אגר דם לילה לחסן לתוך 10 מ"ל של TSB או BHI מ 14 ל צינור ותרבות בין לילה ב 37 º C.</li>
	<li>צנטריפוגה תרבויות לילה (3000 x g, 4 ° C, 10 דקות), resuspend כדורי ב- 10 מ ל תמיסת פוספט buffered (PBS). במקום 14 מ"ל צינורות על קרח.</li>
	<li>להכין את aliquot של 3.7 מ"ג/מ"ל תמיסת 5 (6) - carboxy - fluorescein N-הידרוקסי-succinimidyl אסתר (CF) אתנול ולאחסן ב-20 ° C. בהמשך לדלל את המניה של CF 150 µg/mL באמצעות מים 'הנדסה גנטית'. הערה: להגן על צינורות מן האור באמצעות נייר אלומיניום ולאחסן ב-20 ° C.</li>
	<li>Centrifuge החיידק (3000 x g, 4 ° C, 10 דקות), resuspend כדורי ב- 800 µL ל- PBS ולהוסיף 200 µL של הפתרון CF µg 150/mL (סופי ריכוז של 30 µg/mL המשמש זלוף ניסויים). להגן על צינורות מפני אור עם רדיד אלומיניום, תקופת דגירה של 30 דקות באמצעות של תפקודי לב / נשימה.</li>
	<li>לאחר תיוג, לחסום עם 2% של אלבומין שור (BSA) פתרון PBS, ספין (3000 x g, 4 ° C, 10 דקות). בצע בצעד לשטוף באמצעות 10 מ"ל של PBS צניפה חיידקים על ידי צנטריפוגה (3000 x g, 4 ° C, 10 דקות).</li>
	<li>לדלל חיידקים עם PBS להשיג 107 המושבה יוצרי יחידות (CFU) /mL (נבדק על ידי CFU סומך על פלטות אגר דם מולר-הינטון), המתאים יתר600 (צפיפות אופטית) של 0.65. לשמור על הצינורות בחושך על הקרח לפני ניסויים זלוף. שימו לב. זכור כי יתר600 מדידות ישקפו את המספר המשוער של חיידקים. כדי לספור את המינון חיסון יעיל, השיטה דילול טורי היא צעד הכרחי נוסף כדי לוודא OD המבוסס מספרים כמתואר בסעיף 3.8.</li>
</ol>3. במבחנה זלוף ניסויים באמצעות תא לזרום במקביל-צלחת
<ol><li>הר ביופסיות רקמות 10 מ מ קוטר, עובי אותה (להכין בשלבים 1.1-1.5) לתוך מערכת קאמרית זרימה עם השטח הפנימי כלפי מעלה ליצור קשר עם המתלה חיידקי. הערה: עובי רקמת אותה על פני שתלים שונים מבטיח כי באותו גובה רקמות מתמלאת בערוץ ומאפשר זרימה שכבתית בכל תנאי. כל מרכיבי התא זרימה שהוצגו, המתוארת באיור1.<ol>
<li>כדי להתחיל את הפרוטוקול, מקם את פיסת רקמה עגול בין שקופית מיקרוסקופ עם מחורר מעגלית 8 מ"מ אטם גומי. הערה: השקופית מיקרוסקופ בעל הסרט תחתון דק במיוחד כדי לאפשר את הדור של החור 8 מ מ. יחד עם הגיליון גומי, הוא מתקן את הרקמה כדי לאפשר את מגע ישיר בין הדגימה המדיום זורם, גם מונע שיבוש הביופסיה במהלך הניסוי. פני השטח של רקמת ובדוקים, אשר חשוף לזרימה (קוטר קטן יותר) לא יכול להיות המניפולציה של המלקחיים.</li>
		<li>הכנס בעל עם רקמת הגיליון אטם המוטבע במסגרת מתכת התחתון של החדר.</li>
		<li>לצרף את מסגרת מתכת עליון עם הסדין אטם המתאימים על החלק התחתון של התא עם בעל רקמות שהוספת קודם לכן. לאחר מכן לטעון את התא כולו עם שמונת הברגים ולעזאזל עם אגוזים. ודא כי הגובה קאמרית הוא תמיד אותו על פני שתלים. הערה: גובה החדר צריך להיות נחוש תמיד על הידוק הברגים. השתמש caliper או הסרגל.</li>
	</ol>
</li>
	<li>חבר תא זרימה עם משאבה סחרור, המאגר נוזלים עם הצינורות.</li>
	<li>Perfuse הרקמות עם השעיה של 107 CFU/mL (נבדק על ידי CFU סופר וכל הקשור OD600 מדידות) fluorescently התווית על-ידי חיידקים ב- PBS תוך מתן דגש הטיה של דיין 3/cm2 (דיין ליחידה הלחץ סנטימטר מרובע) על ידי אמצעים משאבת סחרור (תזרים שיעור 4 mL/min) עבור h 1 באמצעות 400 מ ל חיידקי מאגר (בתוך הבית עיצוב, איור 1) ממוזגים ב 37 ° C באמצעות תרמוסטט צלחת (טבלה של חומרים).</li>
	<li>Recirculate ברציפות המתלה חיידקי 100 מ ל באמצעות המאגר אוסף אותו.</li>
	<li>לאחר זלוף, לפרק את התא לשחרר את השתל. ולשטוף את היצירה רקמות פעמיים עם 4 מ"ל של PBS בצלחת 12-ובכן באמצעות ניעור מסלולית מעבדה במשך 3 דקות כל אחד. לאחר מכן חותכים החלק הפנימי של השתל באמצעות ביופסיה העור אגרוף של קוטר קטן יותר.</li>
	<li>מניחים כל ביופסיה רקמות לתוך צינור mL 14 נפרד המכיל 1 מ"ל של סטרילי 0.9% NaCl. תווית את הצינור כמו #1.</li>
	<li>לנתק את החיידקים מן הרקמה באמצעות אמבט sonication 10 דקות (משרעת = 100% ותדירות = 45 קילו-הרץ). הערה: ניתוק מלא של חיידקים מן הרקמה שתלי צריך להיות מוערך על דגירה של תיקונים בן לילה ב 37 מעלות צלזיוס במדיום נוזלי TSB ואחריו OD600 מדידות לעומת לשלוט תיקונים מטופלים עם פתרון ללא חיידקים.</li>
	<li>להשתמש בשיטה הטורית דילול על פלטות אגר דם מולר-הינטון לספור CFUs.<ol>
<li>הכן צינור יחיד mL 14 עם 10 מ ל תמיסת סטרילית כדי להפוך דילולים טורי של ההשעיה חיידקי שהושג לאחר sonication. תווית הצינורית הזאת כמו #2. הערה: לכל רקמות ניסוי שפופרת אחת עם 10 מ"ל של 0.9% NaCl הוא הכרחי.</li>
		<li>הכינו שלושה צינורות 14 מ עם 10 מ"ל של סטרילי 0.9% NaCl עבור דילולים טורי של השעיה חיידקי הראשוני מהשלב 2.7. תווית הצינורות כדלקמן #3, #4, #5. הערה: השלב זה נחוץ לדעת המספר CFU אמיתי ההשעיה חיידקי המשמש את הניסוי זלוף.</li>
		<li>מערבולת מערבבים כל שפופרת של מערבולת ס' 15 הצינורות עם ביופסיה רקמות, כמו גם ההשעיה חיידקי ראשוני כדי להפוך דילולים טורי.</li>
		<li>להכין שלוש צלחות אגר, שתיים לניסוי רקמות (זלוף של חיידקים זלוף שליטה של PBS), והשלישי על ההשעיה חיידקי ראשוני המשמש perfusions.</li>
		<li>תווית שלוש סקטורים צלחת לניסוי רקמת את האופן 10 הבאים-1, 10-3 , 10-4. כדי לספור את מספר CFUs ב perfusates חיידקי, לתייג את הצלחת כדלקמן: 10-1, 10-3, 10-5 ו- 10-7. הערה: כל הסימנים על אגר צלחות כגון 10-1, 10-3 וכן הלאה להפנות המספר הסופי של CFU/mL מחושב ביום הבא. לוח הבקרה אינו דורש כל המגזרים. לפני השימוש, פלטות אגר הדם צריך להיות ממוקם מתחת למכסה המנוע למינריות ופתח להוצאת עודפי הרטיבות.</li>
		<li>כדי להמשיך מכין את טורי דילולים, להעביר µL 100 צינור #1 שפופרת #2, מערבבים היטב עם מערבולת.</li>
		<li>מורחים µL 100 של התוכן של שפופרת #1 ו #2 על מגזרים 10 המקביל-1 ו- 10-3 של צלחת אגר. באופן דומה, להפיץ את µL 10 צינור #2-סקטור 10-4, חזור על שלב זה 4 פעמים להשיג 4 גידולים נפרדים של כל אמצעי אחסון של 10 µL. הערה: עקב אמצעי האחסון קטן המשמש עבור ציפוי על גבי סקטור 10-4, מומלץ לקיים מספר מספר טיפות כדי להפוך מספר ממוצע של מבוגר CFUs.</li>
		<li>כדי להכין את דילולים טורי של התרבות הראשונית, להעביר µL 100 חיידקי השעיה שלב 2.7 צינור #3, מערבבים היטב עם מערבולת. להוסיף 100 µL צינור #3 צינור #4, מערבבים היטב, חזור על הפעולות לכל העוקבים צינור #5.</li>
		<li>מורחים µL 100 של התוכן של צינורות #3, #4, #5, ההשעיה חיידקי מנוכי עונתיות (שלב 2.7), בהתאמה, על מגזרים 10-3, 10-5, 10-7 ו 10-1 של צלחת אגר דם.</li>
		<li>להשאיר הצלחות אגר דם בשכונה למינריות מהאוויר יבש בכפולות חיידקי, בדרך כלל למשך 10 דקות. לאחר מכן, מניחים את הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס במשך לילה הדגירה.</li>
		<li>לאחר דגירה לילה, לספור מושבות חיידקים כדי להשיג את המספר של CFUs הנובע הידבקות רקמות ביופסיות, כמו גם CFUs/mL ההשעיה חיידקי ההתחלה המשמש את זלוף. תוצאות אקספרס כמו CFU/ס מ2.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. זריחה מיקרוסקופיה של חיידקים מודבקת כדי להשתיל רקמות על זלוף
<ol><li>לאחר זלוף, לשטוף את חתיכות רקמה עם PBS (ראה שלב 3.5) וחותכים את החלק הפנימי של השתלה באמצעות אגרוף של קוטר קטן יותר.</li>
	<li>להכין צלחת 6-ובכן ולמקם טיפות של הרכבה בינונית (טבלה של חומרים).</li>
	<li>במקום כל פיסת רקמה עם משטח perfused כלפי מטה על טיפת הרכבה בינונית.</li>
	<li>קרא צלחת משתמש בסורק קרינה פלואורסצנטית (טבלה של חומרים). להגדיר פרמטרים של אורכי גל עירור, פליטה לפי fluorophore המשמש עבור תיוג חיידקי.</li>
</ol>

<ol><li>Que, Y. A., Moreillon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infective+endocarditis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Infective endocarditis.</a> Nature Reviews Cardiology. 8 (6), 322-336 (2011).</li>
<li>Werdan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+infective+endocarditis%3A+pathogen-host+interaction+and+risk+states%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of infective endocarditis: pathogen-host interaction and risk states.</a> Nature Reviews Cardiology. 11 (1), 35-50 (2014).</li>
<li>Moreillon, P., Que, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infective+endocarditis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Infective endocarditis.</a> The Lancet. 363 (9403), 139-149 (2004).</li>
<li>Jalal, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+propensity+of+bovine+jugular+vein+material+to+bacterial+adhesions%3A+An+in+vitro+study%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Selective propensity of bovine jugular vein material to bacterial adhesions: An in vitro study.</a> International Journal of Cardiology. 198, 201-205 (2015).</li>
<li>Sharma, A., Cote, A. T., Hosking, M. C. K., Harris, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Systematic+Review+of+Infective+Endocarditis+in+Patients+With+Bovine+Jugular+Vein+Valves+Compared+With+Other+Valve+Types%5BTitle%5D)+AND+%22JACC+Cardiovascular+Interventions%22%5BJournal%5D)">A Systematic Review of Infective Endocarditis in Patients With Bovine Jugular Vein Valves Compared With Other Valve Types.</a> JACC Cardiovascular Interventions. 10 (14), 1449-1458 (2017).</li>
<li>Malekzadeh-Milani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+and+predictors+of+Melody%28R%29+valve+endocarditis%3A+a+prospective+study%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Cardiovascular+Diseases%22%5BJournal%5D)">Incidence and predictors of Melody(R) valve endocarditis: a prospective study.</a> Archives of Cardiovascular Diseases. 108 (2), 97-106 (2015).</li>
<li>Hill, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+of+prosthetic+valve+infective+endocarditis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Management of prosthetic valve infective endocarditis.</a> American Journal of Cardiology. 101 (8), 1174-1178 (2008).</li>
<li>Claes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clumping+factor+A%2C+von+Willebrand+factor-binding+protein+and+von+Willebrand+factor+anchor+Staphylococcus+aureus+to+the+vessel+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Clumping factor A, von Willebrand factor-binding protein and von Willebrand factor anchor Staphylococcus aureus to the vessel wall.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 15 (5), 1009-1019 (2017).</li>
<li>Fowler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+invasion+by+Staphylococcus+aureus+involves+a+fibronectin+bridge+between+the+bacterial+fibronectin-binding+MSCRAMMs+and+host+cell+beta1+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular invasion by Staphylococcus aureus involves a fibronectin bridge between the bacterial fibronectin-binding MSCRAMMs and host cell beta1 integrins.</a> European Journal of Cell Biology. 79 (10), 672-679 (2000).</li>
<li>Patti, J. M., Hook, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+adhesins+recognizing+extracellular+matrix+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Microbial adhesins recognizing extracellular matrix macromolecules.</a> Current Opinion in Cell Biology. 6 (5), 752-758 (1994).</li>
<li>Massey, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin-binding+protein+A+of+Staphylococcus+aureus+has+multiple%2C+substituting%2C+binding+regions+that+mediate+adherence+to+fibronectin+and+invasion+of+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Fibronectin-binding protein A of Staphylococcus aureus has multiple, substituting, binding regions that mediate adherence to fibronectin and invasion of endothelial cells.</a> Cellular Microbiology. 3 (12), 839-851 (2001).</li>
<li>Jashari, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Belgian+and+European+experience+with+the+European+Homograft+Bank+%28EHB%29+cryopreserved+allograft+valves--assessment+of+a+20+year+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Chirurgica+Belgica%22%5BJournal%5D)">Belgian and European experience with the European Homograft Bank (EHB) cryopreserved allograft valves--assessment of a 20 year activity.</a> Acta Chirurgica Belgica. 110 (3), 280-290 (2010).</li>
<li>Cheatham, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+hemodynamic+outcomes+up+to+7+years+after+transcatheter+pulmonary+valve+replacement+in+the+US+melody+valve+investigational+device+exemption+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Clinical and hemodynamic outcomes up to 7 years after transcatheter pulmonary valve replacement in the US melody valve investigational device exemption trial.</a> Circulation. 131 (22), 1960-1970 (2015).</li>
<li>Que, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrinogen+and+fibronectin+binding+cooperate+for+valve+infection+and+invasion+in+Staphylococcus+aureus+experimental+endocarditis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Fibrinogen and fibronectin binding cooperate for valve infection and invasion in Staphylococcus aureus experimental endocarditis.</a> The Journal of Experimental Medicine. 201 (10), 1627-1635 (2005).</li>
<li>Veloso, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+adherence+to+graft+tissues+in+static+and+flow+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Bacterial adherence to graft tissues in static and flow conditions.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 155 (1), 325-332 (2018).</li>
<li>Liesenborghs, L., Verhamme, P., Vanassche, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus%2C+master+manipulator+of+the+human+hemostatic+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus, master manipulator of the human hemostatic system.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16 (3), 441-454 (2018).</li>
<li>Chiu, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+stress+increases+ICAM-1+and+decreases+VCAM-1+and+E-selectin+expressions+induced+by+tumor+necrosis+factor-%5Balpha%5D+in+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Artheriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Shear stress increases ICAM-1 and decreases VCAM-1 and E-selectin expressions induced by tumor necrosis factor-[alpha] in endothelial cells.</a> Artheriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 24 (1), 73-79 (2004).</li>
<li>Jockenhoevel, S., Zund, G., Hoerstrup, S. P., Schnell, A., Turina, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiovascular+tissue+engineering%3A+a+new+laminar+flow+chamber+for+in+vitro+improvement+of+mechanical+tissue+properties%5BTitle%5D)+AND+%22ASAIO+Journal%22%5BJournal%5D)">Cardiovascular tissue engineering: a new laminar flow chamber for in vitro improvement of mechanical tissue properties.</a> ASAIO Journal. 48 (1), 8-11 (2002).</li>
<li>Veltrop, M. H. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Species-+and+Strain-Dependent+Induction+of+Tissue+Factor+in+Human+Vascular+Endothelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Bacterial Species- and Strain-Dependent Induction of Tissue Factor in Human Vascular Endothelial Cells.</a> Infection and Immunity. 67 (11), 6130-6138 (1999).</li>
</ol>

תצפיות קליניות האחרונות נותן מודעות מיוחדת IE כמו סיבוך בחולים שעברו החלפת שסתום של6,RVOT13. תפקוד לקוי של השסתום מושתל ב- IE הוא התוצאה של חיידקי אינטראקציה עם השתל endovascular שמוביל נרחב דלקתיות ו procoagulant תגובות1,14. המודל הציג הרומן במבחנה אפשר לנו לחקור אם הבדלים רקמות מבנים וגורמים חיידקי סביר לווסת את הרגישות לזיהומים ויוו בשימוש שתלי15. BJV ורקמות שת...

Staphylococcus aureus (S. aureus) מעסיקה במגוון אסטרטגיות התקפה אלימה כדי לעקוף את מערכת ההגנה החיסונית המארח להמדינות משטחים ביולוגי או הלא-ביולוגיים מושתלים במחזור האנושי, אשר מוביל לזיהומים קרישה תוך-כלית חמורות כגון אלח דם, IE1,2,3,4,5. שרידים IE לטיפול חשוב הקשורים סיבוך בחולים לאחר ההשתלה של מסתמי לב תותב תוך בודדים גורמים התורמים תחילתה של IEare לא אך מובן לחלוטין6,7. תחת תנאי זרימה, חיידקים מפגש כוחות גזירה, אשר הם צריכים להתגבר על מנת לדבוק קיר הספינה8. מודלים, אשר מאפשרים לימוד יחסי הגומלין בין חיידקים לבין רקמת שסתום תותבת או אנדותל תחת זרימה, הן עניין הם משקפים ויוו המצב יותר.
מספר מנגנונים מסוימים להקל על הדבקות חיידקים לתאי אנדותל (ECs) וכדי חשוף subendothelial המטריקס (ECM) המוביל קולוניזציה רקמת ההבשלה של גידולים, להיות צעדים חיוניים מוקדם ב- IE9. Staphylococcal פני שטח חלבונים שונים או MSCRAMMs (חיידקים משטח רכיבי זיהוי מולקולות מטריקס דבק) תוארו כמתווכים של אדהזיה לתאי המארח, ECM חלבונים על ידי אינטראקציה עם מולקולות כגון fibronectin, פיברינוגן, קולגן, Willebrand פון פקטור (VWF)8,10,11. עם זאת, על רקע קיפול אינטרה-מולקולרית של כמה גורמים התקפה אלימה, למד בעיקר בתנאים סטטי, רבים של אינטראקציות אלה ייתכן רלוונטיות שונים זיהומים endovascular במחזור הדם.
לכן, אנו מציגים ללא צורך במיקור חוץ מעוצב במבחנה במקביל-plate זרימה קאמרית מודל, אשר מאפשר את ההערכה של חיידקי ההקפדה מרכיבים שונים של ECM ו ECs בהקשר של רקמות השתלים מושתלים התנוחה RVOT. המטרה הכללית של השיטה המתוארת בעבודה זו היא ללמוד מנגנונים של האינטראקציה בין חיידקים ורקמות הבסיסית endovascular בתנאים זרימה, אשר קשורה קשר הדוק הסביבה ויוו של פתוגנים למחזור הדם כגון S. aureus. גישה חדשנית זו מתמקדת הרגישות של שתל משטחי רקמות כדי הדבקות חיידקים כדי לזהות גורמי סיכון פוטנציאלי לפיתוח של IE.

<table><tbody><tr><td>מדבקת קרום הלב בקר (BP), Supple Peri-Guard Pericardium</td><td>Synovis Surgical Innovations, ארה"ב</td><td>PC-0404SN</td><td></td></tr><tr><td>צינורות וריד צוואר בקר (BJV)</td><td>Contegra; מדטרוניק בע"מ, ארה"ב</td><td>M333105D001</td><td></td></tr><tr><td>CH הומוגרפט שמור בהקפאה</td><td>European Homograft Bank (EHB)</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Acu-Punch</td><td>Acuderm Inc, ארה"ב</td><td>P850 (8 מ"מ); P1050 (10 מ"מ)</td><td></td></tr> <tr><td>אלבומין אנושי</td><td>Flexbumin; בקסטר, בלגיה</td><td>BE171464 LOT:16G12C</td><td></td></tr><tr><td>מרק סויה טריפטי (TSB)</td><td>פלוקה, שטיינהיים, גרמניה</td><td>22092-500 גרם</td><td></td></tr><tr><td>מרק עירוי לב (BHI)</td><td>Fluka</td><td>53286-500G</td><td></td></tr><tr><td>מלח פוספט חוצץ (PBS).</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>5(6)-Carboxyfluorescein N-hydroxysuccinimide ester (CF)</td><td>Sigma-Aldrich, גרמניה</td><td>21878-100MG-F</td><td></td></tr><tr><td>משאבה פריסטלטית (דגם ISM444B)</td><td>תקן Ismatec BVP-Z; קול פארמר, ורטהיים, גרמניה</td><td>631942-2</td><td></td></tr><tr><td>אמבט סוניקציה</td><td>VWR מנקה אולטראסוני; VWR, רדנור, Pa</td><td>142-6044</td><td>230V/50 -60Hz 60VA; HF45kHz, 30W</td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade</td><td>Mountant Invitrogen מאת ThermoFisher</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>InCell Analyzer 2000 (סורק פלואורסצנטי)</td><td>GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, PA</td><td>29027886</td><td></td></tr><tr><td>Arium Pro VF - מים אולטרה-טהורים - H2O MilliQ</td><td>Millipore</td><td>87206462</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופיות - תאי תרבית רקמות (1-well)</td><td>Sarstedt</td><td>94.6140.102</td><td></td></tr><tr><td>באר אחת על Lumox ניתנת להסרה</td><td>Sarstedt</td><td>94.6150.101</td><td></td></tr><tr><td>נירוסטה - להבים כירורגיים</td><td>Swann-Morton</td><td>311</td><td></td></tr><tr><td>צינורות סיליקון טיגון, 1/8 אינץ' ID x 1/4 אינץ' OD</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-95702-06</td><td>טווח טמפרטורות: &ndash; 80 עד 200&deg; עיקור C : עם תחמוצת אתילן, קרינת גמא או חיטוי למשך 30 דקות, 15 psi של</td></tr><tr><td>לחץ צינורות PharMed BPT</td><td>Saint-Gobain</td><td>AY242012</td><td>ניתנים לחיטוי 30 דקות ב-121 מעלות; C</td></tr><tr><td>Tygon LMT-55 צינורות</td><td>סנט גוביין ביצועים פלסטיק וסחר;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15312022 תרמוסטט</td><td>BMG BIOMEDIZINTECHNIK</td><td>300-0042</td><td>230V, 90VA, 50Hz</td></tr></tbody></table>

מודל במבחנה של מערכת מקבילה-plate זלוף ללמוד חיידקי ההקפדה להשתיל רקמות

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

תעלות valved שונים ושסתומים רכוב סטנט משמשים עבור יצוא נכון חדרית בדרכי (RVOT) החלפת שסתום בחולים עם מחלת לב מולדת. בעת השימוש בחומרים תותבת עם זאת, אלה שתלי רגישים זיהומים חיידקיים ותגובות מארח שונים.
זיהוי גורמים בקטריאלי, המארח לשחק תפקיד חיוני endovascular הדבקות של מיקרואורגניזמים, יש חשיבות כדי להבין טוב יותר את הפתופיזיולוגיה של תחילת זיהומים כמו אנדוקרדיטיס זיהומית (IE) וכדי לפתח מניעתי אסטרטגיות. לפיכך, פיתוח מודלים המוסמכת לחקור אדהזיה חיידקי בתנאים הטיה פיזיולוגית נחוצה. כאן, אנו מתארים את השימוש החדש תוכנן במבחנה זלוף תא בהתבסס על לוחות מקבילים המאפשר שהמחקר של חיידקי ההקפדה מרכיבים שונים של השתלת רקמות כגון חשוף מטריצה חוץ-תאית, תאי אנדותל ואזורי אינרטי . שיטה זו בשילוב עם המושבה יוצרי יחידה (CFU) סופר מספיקה להעריך של הנטייה של שתל חומרים לקראת הדבקה חיידקית תחת זרימה. בהמשך, מערכת קאמרית הזרימה עשויה לשמש כדי לחקור את התפקיד של רכיבי הדם אדהזיה חיידקי בתנאים הטיה. להדגים כי המקור של רקמות, שלהם מורפולוגיה משטח וספציפיות חיידקים אינם היזע הגדולות בחיידקיים ההקפדה להשתיל רקמות באמצעות מודלי שלנו ללא צורך במיקור חוץ מעוצב במבחנה זלוף.

כדי להבין טוב יותר את המנגנונים מאחורי IE פיתוח, מודל זה מאפשר הערכת בקטריאלי ולהציג גורמים רקמות הקשורים במצב ויוו תחילת הזיהום.
בפירוט, הגישה הרומן במבחנה מאפשר לכמת אדהזיה חיידקי בתנאי זרימה לרקמות שונות השתל על ידי פרפוזיה חיידקים fluorescently שכותרתו על הרקמות הפעלת הלחצים הטיה בטווח פיזיולוגיים של דיין 3-10 / ס מ2 עבור RVOT. בעבודה זו, השתמשנו קצב זרימה של 4 mL/min שמשקף דיין 3/ס מ<su...

אנו מתארים שבאתר מעוצב במבחנה זרימה קאמרית מודל, אשר מאפשר החקירה של חיידקי ההקפדה להשתיל רקמות.

מודל במבחנה של מערכת מקבילה-Plate זלוף ללמוד חיידקי ההקפדה להשתיל רקמות

Various valved conduits and stent-mounted valves are used for right ventricular outflow tract (RVOT) valve replacement in patients with congenital heart ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בפתוגנזה של אנדוקרדיטיס מדביק, ופתוביוגרמות דרך שדות כגון יחסי הגומלין בין חיידקים, תאי דם ותאי אנדותל רירית שרירים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שתלי הרקמה עשויים להיחשף ישירות לאינטראקציות הדדיות עם מטרות שונות, כגון חיידקים, טסיות דם וחלבונים בתנאי זרימה מתוקנים. המשמעות של טכניקה זו להרחיב את הטיפול שלנו של אנדוקרדיטיס מדביק, כי זה יכול לפענח אינטראקציות מולקולריות חשובות וגורמים המניעים להדביק גבוה של רקמות מסוימות.שיטה זו מספקת תובנה לתוך פתוגנזה של היווצרות צמחייה. זה יכול להיות ישים גם במחקרים החוקרים חן כלי דם, ניידות התא, ביטוי תאים גנים. כדי להתחיל את הפרוטוקול, למקם ביופסיה רקמה מוכן בעבר 10 מילימטרים קוטר, ואת אותו עובי בין מגלשת מיקרוסקופ וניקוב מעגלי שמונה מילימטר, אטם גומי עם המשטח הפנימי פונה כלפי מעלה, כדי ליצור קשר עם ההשעיה החיידקית.התמקד בכיוון השתלת הרקמה בעת הנחתו במחזיק. ודאו שהמשטח הפנימי של הרקמה כבר חשוף למחזור הדם כדי ליצור קשר עם המדיום הניסיוני שלכם. לאחר מכן, הכנס את המחזיק שלך עם הרקמה לתוך גיליון אטם כי הוא מוטבע במסגרת המתכת התחתונה של התא.חבר את מסגרת המתכת העליונה עם גיליון אטם המתאים על החלק התחתון של התא עם מחזיק הרקמה שהוכן בעבר. ואז להרכיב את התא כולו עם שמונה ברגים ולבורג אגוזים. ודא כי גובה התא הוא תמיד זהה על פני שתלים באמצעות caliper או סרגל.לאחר מכן חבר את תא הזרימה עם משאבה פריסטואלית. ואז לחבר את מאגר הנוזלים 400 מיליליטר עם הצינורות. לנטרל את הרקמות עם 100 מתלים מיליליטר של עשרה עד שבעת המושבה שכותרתו פלואורסצנטית להרכיב יחידות מלוחים מאגר פוספט עם הלחץ הטהור של שלושה סועדים לסנטימטר מרובע וקצב זרימה מתאים של ארבעה מיליליטר לדקה במשך שעה אחת באמצעות המשאבה peristaltic ואת מאגר החיידקים.Recirculate ברציפות ההשעיה חיידקי 100 מיליליטר באמצעות אותו מאגר איסוף. לאחר תדלוק, לפרק את התא כדי לשחרר את השתל. לשטוף את פיסת הרקמה פעמיים עם ארבעה מיליליטר של PBS בצלחת 12 גם באמצעות שייקר מסלולית במשך שלוש דקות.ואז לחתוך את החלק הפנימי של השתל באמצעות אגרוף ביופסיה העור עם קוטר קטן יותר. מניחים כל ביופסיה רקמה לתוך צינור נפרד 14 מיליליטר המכיל מיליליטר אחד של סטרילי 0.9% נתרן כלורי. לנתק את החיידקים מן הרקמה באמצעות אמבטיה sonication במשך 10 דקות.הכינו צינור יחיד של 14 מיליליטר עם 10 מיליליטר של סטרילי 0.9% נתרן כלורי כדי לבצע דילול סדרתי של ההשעיה החיידקית המתקבלת לאחר sonication. תייג את הצינור מספר שתיים. הכן שלושה צינורות 14 מיליליטר עם 10 מיליליטר של סטרילי 0.9% נתרן כלורי עבור דילול סדרתי של ההשעיה החיידקית הראשונית נלקח לניסוי שפע.תייג את הצינורות מספר שלוש, מספר ארבע ומספר חמש. לאחר מכן, לאבטח שלוש צלחות אגר, אחד עבור חליטה חיידקית, אחד עבור חליטה שליטה של PBS, והשלישי עבור ההשעיה החיידקית הראשונית המשמשת חליטות. סמן שלושה סקטורים לכל צלחת לניסוי הרקמה באופן הבא:10-1, 10-3 ו- 10-4.כדי לספור את מספר היחידות יוצרות המושבה בהתבולות החיידקיות, סמן את הלוח כדלקמן: 10-1, 10-3, 10-5 ו- 10-7. מערבולת הצינורות המכילים את ביופסיית הרקמה במשך 15 שניות כל אחד, כדי לבצע דילול סדרתי. כדי להכין את הדילולים הסדרתיים, להעביר 100 microliters של צינור מספר אחד לצינור מספר שתיים, ומערבולת הצינור לערבב ביסודיות את הפתרון.להפיץ 100 microliters של התוכן של צינור מספר אחד ומספר שתיים על המגזרים המתאימים, 10-1 ו 10-3 של צלחת אגר. ואז להפיץ 10 microliters של צינור מספר שתיים על מגזר 10 ארבעה. חזור על שלב זה ארבע פעמים כדי להשיג ארבע גידולים נפרדים מכל נפח של 10 microliters.כדי להכין דילול סדרתי של התרבות הראשונית, מערבולת ראשונה את הדילול במשך 15 שניות ולהעביר 100 microliters של השעיה חיידקית לצינור מספר שלוש, ומערבבים במרץ על ידי מערבולת. מוסיפים 100 מיקרוליטרים של צינור מספר שלוש לצינור מספר ארבע ומערבבים שוב. חזור על ההליך לצינור מספר חמש מצינור מספר ארבע.להפיץ 100 microliters של התוכן של צינורות מספר שלוש, מספר ארבע, מספר חמש, ואת התרבות הראשונית שכותרתו בהתאמה על מגזרים 10-3, 10-5, 10-7, ו 10-1 של צלחת אגר הדם. השאירו את צלחות אגר הדם מתחת למכסה המנוע למינאר כדי לייבש את התפשטות החיידקים, בדרך כלל במשך 10 דקות. לאחר מכן, מניחים את הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס עבור דגירה לילה.לאחר הדגירה לילה, לספור את המושבות חיידקי כדי להשיג את מספר CFUs. בתנאי לחץ, התקשרות חיידקית דומה על פני רקמות השתל השונות נצפתה הן עבור סטפילוקוקוס אוראוס והן זיהום אפידרמידיס סטפילוקוקוס. בעקבות ההליכים, סטרפטוקוקוס sanguinis הפגין הפחתה משמעותית של דבקות בקיר וריד הצווארי, בהשוואה לתיקון פריקארדיום bovine.כאשר משווים את שלושת המינים של חיידקים, סטרפטוקוקוס sanguinis מציג הידבקות נמוכה משמעותית לקיר וריד הצווארי של חזיר ביחס סטפילוקוקוס aureus ו staphylococcus epidermidis. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שהכין רקמות נכונות של אותו ראש. הוא יבטיח תנאים דומים בכל דגימות הניסוי וימזער את השונות בנתונים בין סדרות ניסויים שונות.לאחר התפתחותה, טכניקה זו מאפשרת לחוקרים לחקור את מערכות ההפרעה המורכבות באופן צעד אחר צעד על ידי העשרת הגישות שלהם במודל החוץ-חוץ-חוץ-מערכתי עם אלמנטים שונים כדי לבנות מורכבות מלאה קרוב למצב הרפואי.

an-vitro-model-parallel-plate-perfusion-system-to-study-bacterial

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

שיטת לתרבות monolayer תא האנדותל לאורך כל פני השטח הפנימי של המכשיר 3D microfluidic עם כלי הדם בגודל הערוצים (&lt;30 מיקרומטר) מתואר.

מיקרופלואידיקה Endothelialized לחקר אינטראקציות כלי הדם במחלות המטולוגיות

מקור: דיטקובסקי, ב. ואחרים. מודל Invitro של מערכת פרפוזיה מקבילה לחקר היצמדות חיידקית לרקמות השתלות. J. Vis. Exp. (2019).סרטון זה מדגים את השיטה לשימוש בתא זרימה מקביל לפרפיוז חיידקים מסומנים פלואורסצנטי מעל רקמות השתל הוסקולרי, ומאפשר ניתוח מבוקר של הידבקות חיידקית ופתוגנזה מוקדמת בתנאי זרימה גזירה.

מודל זרימת הלוחה המקבילה במבחנה לחקר הידבקות חיידקית בביופסיית רקמה

מקור: קלטאיוד ארויו, מ., ואחרים. הערכת הכדאיות של קונסורציום חיידקים סינתטי בממשק המארח-מיקרוב המעי במבחנה. J. Vis. Exp. (2018).סרטון זה מדגים מודל של מארח-מיקרוב במעי במבחנה לחקר חיוניות חיידקים. קו-קולטורה של תאי Caco-2 ו-HT29-MTX מדוגרת עם חיידקים שעברו טיפול מוקדם בתנאי עיכול מדומים. שלמות מחסום האפיתל מוערכת באמצעות התנגדות חשמלית טרנס-אפיתליאלית, וחלקים מהתווך, הריר הממס, הליזאט התא ושאריות התא נאספים לניתוח במורד הזרם.

מודל המעי במבחנה להערכת הידבקות ואינטרנליזציה של חיידקים

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates a method for studying host-pathogen interactions using a micro-parallel plate flow chamber seeded with human primary endothelial cells. Following endothelial cell activation by an ionophore and perfusion with fluorescently labeled bacteria, the cells release von Willebrand factor (VWF), which binds bacterial adhesins under shear...

Micro-Parallel Plate Flow Chamber Model for Studying Bacterial Adhesion to Human Endothelial Cells

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates an in vivo method for analyzing shear-dependent bacterial adhesion in a live mouse model. Following surgical preparation and catheterization, the mesenteric vasculature is exposed for real-time imaging under a fluorescence microscope. Perfusion with an ionophore and fluorescently labeled bacteria reveals how shear stress triggers...

An In Vivo Model to Study Shear-Dependent Bacterial Adhesion

meningitidis Neisseria הוא הפתוגן ספציפי אדם שמדביק את כלי דם. בפרוטוקול זה microvessels אדם מוכנס בעכבר על ידי השתלת עור אנושי על עכברי חיסון. חיידקים לדבוק בהרחבה לכלי האנושי, שהובילו לניזק והתפתחות כלי דם של הפריחה purpuric נצפתה בדרך כלל במקרים של בני אדם.

אנושי עכבר מודל ללמוד זיהומים חיידקיים מיקוד microvasculature

כדי לחקור את האינטראקציה של חיידקים עם כלי הדם תחת לחץ גזירה, מתוארים תא זרימה ומודל מיקרוסקופיה תוך-חיונית מזנטרית in vivo המאפשרים לנתח את גורמי החיידקים והמארח התורמים להידבקות כלי הדם.

במבחנת in vivo המודל ללמוד הידבקות חיידקים לכלי השיט וול תנאי זרימה תחת

לויקוציטים בלהיטות אינטראקציה עם טסיות הדם והתאים כלי הדם לאחר פציעה קיר הספינה או בעת דלקת. כאן, אנו מתארים assay מבוסס זרימה שכבתית פשוטה כדי לאפיין את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס האינטראקציות בין לויקוציטים ושותפים הסלולר שלהם.

מבחני מבוסס זרימה שכבתית לחקור ליקוציט גיוס על תאים בתרבית וסקולרית, טסיות חסיד

פרוטוקול זה מדגים שיטות המאפשרות הרחבה בתרבות המבחנה של xenografts נגזר המטופל (PDX). צעד אחד משפר את הכדאיות הכוללת של תרבויות אשכול רב-תאי בהידרוג'לים תלת-מימדיים, באמצעות הסרה פשוטה של תאים בודדים שאינם ברי קיימא. שלב משני מדגים שיטות עבודה מומלצות לתרבות PDX בפלטפורמה מיקרו-נוזלית מנווטה.

קיימות משופרת עבור תרבויות הידרוג'ל 3D Ex vivo של Xenografts נגזר המטופל בפלטפורמה מיקרופלויד perfused

פרוטוקול זה מציג את ההתקנה והתפעול של ביוריאקטור מודפס תלת-ממדי שפותח לאחרונה עבור תרבית ex vivo של כלי דם בזילוח. המערכת תוכננה להיות מאומצת בקלות על ידי משתמשים אחרים, מעשית, במחיר סביר וניתנת להתאמה ליישומים ניסיוניים שונים, כגון ביולוגיה בסיסית ומחקרים פרמקולוגיים.

אקס ויוו תרבית זילוח של כלי דם גדולים בביוריאקטור מודפס בתלת-ממד

חקור את דבקות החיידקים לרקמות השתלה במודל מערכת זרימה במבחנה. שיטה זו מאפשרת חקירת אנדוקרדיטיס זיהומית ואינטראקציות מולקולריות בין חיידקים, תאי דם ותאי אנדותל.

מודל במבחנה של מערכת מקבילה-Plate זלוף ללמוד חיידקי ההקפדה להשתיל רקמות

גלה סרטונים נוספים