Name: ניתוח ביטוי גנטי של תאי אנדותל נחשף להטיית מתח באמצעות מרובות במקביל-plate זרימה ציימברס (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: למדו ניתוח ביטוי גנטי של תאי אנדותל תחת הטיית מתח באמצעות מערכת זרימה במקביל. השיטה מאפשרת חקר רגולציה גנית במערכות עורקיות וורידיות ומספקת מסגרת למחקר עתידי על השפעות מתח גזירי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי CIHR מגב 142307 P.A.M. H.S.J.M. הוא הנמען של קנדי מוסדות של הבריאות מחקר תוכנית אימונים במלגת רפואה רגנרטיבית. H.S.J.M., A.N.S., K.H.K. ו- M.K.D. הם הנמענים המלכה אליזבת השנייה לתואר שני מלגות המדע והטכנולוגיה.

<ol><li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell heterogeneity.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (1), (2012).</li>
<li>Baeyens, N., Bandyopadhyay, C., Coon, B. G., Yun, S., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+fluid+shear+stress+sensing+in+vascular+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Endothelial fluid shear stress sensing in vascular health and disease.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 821-828 (2016).</li>
<li>Garcia-Cardena, G., Comander, J., Anderson, K. R., Blackman, B. R., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomechanical+activation+of+vascular+endothelium+as+a+determinant+of+its+functional+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Biomechanical activation of vascular endothelium as a determinant of its functional phenotype.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (8), 4478-4485 (2001).</li>
<li>Cybulsky, M. I., Marsden, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+disturbed+blood+flow+on+endothelial+cell+gene+expression%3A+a+role+for+changes+in+RNA+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Effect of disturbed blood flow on endothelial cell gene expression: a role for changes in RNA processing.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (9), 1806-1808 (2014).</li>
<li>Man, H. S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenic+patterning+by+STEEL%2C+an+endothelial-enriched+long+noncoding+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Angiogenic patterning by STEEL, an endothelial-enriched long noncoding RNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2401-2406 (2018).</li>
<li>Won, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relative+reduction+of+endothelial+nitric-oxide+synthase+expression+and+transcription+in+atherosclerosis-prone+regions+of+the+mouse+aorta+and+in+an+in+vitro+model+of+disturbed+flow%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Relative reduction of endothelial nitric-oxide synthase expression and transcription in atherosclerosis-prone regions of the mouse aorta and in an in vitro model of disturbed flow.</a> The American Journal of Pathology. 171 (5), 1691-1704 (2007).</li>
<li>Baeyens, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+remodeling+is+governed+by+a+VEGFR3-dependent+fluid+shear+stress+set+point%5BTitle%5D)+AND+%22eLIFE%22%5BJournal%5D)">Vascular remodeling is governed by a VEGFR3-dependent fluid shear stress set point.</a> eLIFE. 4, 04645(2015).</li>
<li>Davies, P. F., Civelek, M., Fang, Y., Fleming, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+atherosusceptible+endothelium%3A+endothelial+phenotypes+in+complex+haemodynamic+shear+stress+regions+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">The atherosusceptible endothelium: endothelial phenotypes in complex haemodynamic shear stress regions in vivo.</a> Cardiovascular Research. 99 (2), 315-327 (2013).</li>
<li>Lane, W. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel-plate+flow+chamber+and+continuous+flow+circuit+to+evaluate+endothelial+progenitor+cells+under+laminar+flow+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), 3349(2012).</li>
<li>Gray, K. M., Stroka, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+endothelial+cell+mechanosensing%3A+New+insights+gained+from+biomimetic+microfluidic+models%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Vascular endothelial cell mechanosensing: New insights gained from biomimetic microfluidic models.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 71, 106-117 (2017).</li>
<li>Bussolari, S. R., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apparatus+for+subjecting+living+cells+to+fluid+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Apparatus for subjecting living cells to fluid shear stress.</a> Review of Scientific Instruments. 53 (12), 1851-1854 (1982).</li>
<li>Resnick, N., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemodynamic+forces+are+complex+regulators+of+endothelial+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Hemodynamic forces are complex regulators of endothelial gene expression.</a> The FASEB Journal. 9 (10), 874-882 (1995).</li>
<li>Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemodynamic+shear+stress+and+its+role+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis.</a> The Journal of the American Medical Association. 282 (21), 2035-2042 (1999).</li>
<li>DeStefano, J. G., Xu, Z. S., Williams, A. J., Yimam, N., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+shear+stress+on+iPSC-derived+human+brain+microvascular+endothelial+cells+%28dhBMECs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+and+Barriers+of+the+CNS%22%5BJournal%5D)">Effect of shear stress on iPSC-derived human brain microvascular endothelial cells (dhBMECs).</a> Fluids and Barriers of the CNS. 14 (1), 20(2017).</li>
<li>Thormar, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+the+efficiency+of+double-stranded+DNA+formation+in+cDNA+synthesis+for+the+imprecision+of+microarray+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Importance of the efficiency of double-stranded DNA formation in cDNA synthesis for the imprecision of microarray expression analysis.</a> Clinical Chemistry. 59 (4), 667-674 (2013).</li>
<li>Johnston, S., Gallaher, Z., Czaja, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exogenous+reference+gene+normalization+for+real-time+reverse+transcription-polymerase+chain+reaction+analysis+under+dynamic+endogenous+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regenation+Research%22%5BJournal%5D)">Exogenous reference gene normalization for real-time reverse transcription-polymerase chain reaction analysis under dynamic endogenous transcription.</a> Neural Regenation Research. 7 (14), 1064-1072 (2012).</li>
<li>Vaughan-Shaw, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+to+overcome+the+inhibitory+effect+of+heparin+on+DNA+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Oncology+%28Dordrecht%29%22%5BJournal%5D)">A simple method to overcome the inhibitory effect of heparin on DNA amplification.</a> Cellular Oncology (Dordrecht). 38 (6), 493-495 (2015).</li>
<li>Collins, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haemodynamic+and+extracellular+matrix+cues+regulate+the+mechanical+phenotype+and+stiffness+of+aortic+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Haemodynamic and extracellular matrix cues regulate the mechanical phenotype and stiffness of aortic endothelial cells.</a> Nature Communications. 5, 3984(2014).</li>
<li>Fichtlscherer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs+in+patients+with+coronary+artery+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs in patients with coronary artery disease.</a> Circulation Research. 107 (5), 677-684 (2010).</li>
<li>Smith, R. D., Brown, B., Ikonomi, P., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exogenous+reference+RNA+for+normalization+of+real-time+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Exogenous reference RNA for normalization of real-time quantitative PCR.</a> Biotechniques. 34 (1), 88-91 (2003).</li>
<li>Kohn, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+effects+of+matrix+stiffness+and+fluid+shear+stress+on+endothelial+cell+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Cooperative effects of matrix stiffness and fluid shear stress on endothelial cell behavior.</a> Biophysical Journal. 108 (3), 471-478 (2015).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

מאמץ גזירה הוא מצב הפיזיולוגיות ממיקרו הפונקציה אנדותל, בחלקו, על-ידי המשפיעים על מצב יציב ג'ין ביטוי2,5. מודלים של הכונה בתנאים שונים של גזירה יתרום להבנה גדולה יותר של פונקציית אנדותל. זרימת עבודה מעשית זו כוללת מעגל זרימה באמצעות תא הזרימה במקביל-plate מקורי ליין. et al. 9 , מייצג למינריות, שאינם פועמת זרימה. הסידור הכללי נועדה להקל על הניסויים אשר דורשים תאי זרימה מרובים ולצמצם את השתנות ניסיוני בהגדרה זו.
<p class="jove_c...

תאי אנדותל כלי הדם בצורת תאי הציפוי הפנימי של כלי הדם במערכת הלב וכלי הדם הסגורה של מינים גבוה יותר. הם יוצרים את הממשק בין הדם לבין רקמות, מאופיינים luminal ומשטחים abluminal. אנדותל היא מערכת מגוונת, פעיל, והוא מסתגלת המווסת את זרימת הדם מזין סחר, חסינות, הצמיחה של כלי דם חדשים1. בגוף, תאי אנדותל קיימים בדרך כלל בסביבה שבה הם נחשפים לכוח חיכוך של מחזור הדם, גזירה2. גזירה הרגולטור חשוב של ביטוי גנים תא אנדותל3, תאי אנדותל לנסות לשמור על גזירה בתוך2,בטווח נתון4. תאי אנדותל מדגימים האנגיוגנזה תכנים בהעדר מאמץ גזירה5 שיכולות לשפר רקמות זלוף. דפוסים אזוריים של זרימה מופרעת, גזירה שינו משויכות הביטוי של גנים דלקתיים6 לבין התפתחות טרשת עורקים7,8. כך, דגמים הכוללים מאמץ גזירה הם מרכיב מרכזי להבנת הכונה אנדותל.
נתאר שיטת לימוד של הכונה בתאי אנדותל כלי הדם תחת גזירה. מערכת זו משתמשת זרימה פועמת ואת מחקה רמות הנוזלים גזירה, ריכוז חמצן את התנאים מודל עבור תאי אנדותל עורקי. פרוטוקול זה כולל פרטים על שיטות נוקאאוט גנטי באמצעות התערבות ב RNA (RNAi), הסידור של יישום באמצעות מכשירים במקביל-plate זרימה, שיטות ספייק-אין של אקסוגני הפניה RNA לפני הניתוח על ידי מאמץ גזירה תגובת שרשרת של פולימראז כמותית-טרנסקריפטאז (RT-qPCR). צינור זה משמש עבור הלומדים הכונה בתאי האנדותל הנוכחות ואת היעדר למינריות גזירה, כולל עיבוד של המנגנון הזרימה במקביל-plate מתוארת על ידי ליין. et al. 9. הגדרת המסוים הזה נועד לקדם את ההערכה בו זמנית של מספר תנאים ניסיוני המאפשר השוואה ישירה של תנאים גזירה, כמו גם את הנורמליזציה של RNA ניתוח. יחידה גדולה מחוממת עם מבוקרת לחות מנוצל כדי לאפשר זרימה נפרדת צ'יימברס מרובים, משאבות לנהל בו זמנית עם זרימה המחירים פיקוח להרכבה הקאמרית לכל הזרימה בזמן אמת. היישום של זה משמש נוקאאוט גנטי באמצעות RNAi בסביבה של זרימה שכבתית/גזירה, אך ניתן ליישם היבטים של פרוטוקול זה כל הערכה של RNA ביטוי.
גישות נפוצות היישום של גזירה עבור תאי אנדותל כוללים מערכות microfluidic10, עם מד צמיגות חרוט ופלייט-11קאמרית הזרימה במקביל-plate12. Microfluidic מערכות מיצרנים שונים היו שימושיים בלימוד mechanobiology ו- mechanotransduction תא מרובים, סוגי רקמות ואת מגוון רחב של גירויים ביופיזיקלי. עבור תאי אנדותל, הם שימשו ללמוד תאי אנדותל בידוד, כמו גם את האינטראקציה של תאי אנדותל וסחר של תאי החיסון או גידול10. עם זאת, מערכות אלו מתאימים פחות ההתאוששות של מספר גדול של תאים9. מד צמיגות קונוס-ו-plate והן במקביל-plate זרימה צ'יימברס לאפשר ההתאוששות של מספר גדול של תאים confluent monolayers12. מערכות אלה ניתן להפיק מגוון של הכוחות ודפוסי הטיה12. במקביל-plate זרימה קאמרית הרכבה9 יש את היתרון הזה הדמיה בזמן אמת יכול להתבצע דרך חלון זכוכית להערכת המורפולוגיה הסלולר בכל נקודת זמן. יתר על כן, ניתן לאסוף את perfusate בתנאים סטריליים. עבור מערכת המספרים המובאים כאן, הזרם ניתן גם לנטר בזמן אמת, מלכודת קאמרית מרובה, המאפשרת קיום התנאים הטיה בין צ'יימברס.
לניסויים נציג, הוא יפתור אנדותל תאים (HUVEC), אשר מייצגים סוג תאי אנדותל macrovascular, משמשים, ונשתמש התנאים גזירה (1 הרשות הפלסטינית) משקפים מצבים עורקי (0.1 - 0.7 הרשות הפלסטינית). עם זאת, ניתן להשתמש בפרוטוקול זה עם סוגי תאים אנדותל אחרים, התנאים גזירה יכול להיות מותאם על פי השאלה ניסיוני. לדוגמה, ההערכה של תאי אנדותל אדם תנאים בהם מודל מחזור ורידים ידרוש רמות נמוכות יותר של גזירה (Pa 1-6), מחקרים כי מודל זרימת microvascular נעזרו גזירה רמות של 0.4 - הרשות הפלסטינית 1.213 , 14. בנוסף, גזירה יכול להשתנות אפילו בין תאי אנדותל בתוך כלי דם באותו6. הסידור הנוכחי, מערכת מעקב יחיד משמש זה יכול לעקוב אחר בו זמנית ארבע לולאות זרם נפרד. עבור מעבדות צריכה לולאות זרם נוסף, יש שטח בסביבה ייעודית למערכת ניטור נוספים.
RT-qPCR משמש את כימות מוחלטת של ביטוי גנים בהגדרה של גזירה. הביטוי היחסי של הגנים יעד משמש לעתים קרובות כדי להשוות RNA הביטוי על-פני תנאים. מינים מסוימים RNA יכול להתקיים כמויות נמוכות מאוד או להיעדר, ובכך שמסבך מידות יחסית. לדוגמה, זמן noncoding RNAs בתאי האנדותל שיכולים להפעיל אפקטים חזק במספרים עותק נמוך יחסית לכל תא5. בנוסף, הבדלי יעילות פריימר יכול להוביל פרשנות שגויה של ניצול שיטת הסף (Ct) של מחזור דלתא-delta לנתח את הנתונים. כדי לטפל חשש זה, אנו מבצעים כימות מוחלטת על ידי יצירת עיקול רגיל באמצעות כמות ידועה של פלסמיד ה-DNA. יתר על כן, משלימים לסינתזת DNA (cDNA) הוא תהליך לא יעיל, הבדלים cDNA יעילות יכול להסביר הבדלים בביטוי RNA בין בתנאים ובין דגימות15. היישום של גזירה ו/או תרביות תאים ריאגנטים יכול להשפיע על התפשטות תאים אפופטוזיס, הכדאיות, או להוסיף רכיבים עלולים להפריע סינתזה RNA בידוד ו/או cDNA. להביא בחשבון האפשרות של הטיה מן הבידוד רנ א cDNA סינתזה, אנו משתמשים בספייק RNA פקד מסונתז במעבדה, הוסיף בזמנו של החילוץ-RNA, נמדד עם כל cDNA סינתזה ויה RT-qPCR. פעולה זו מאפשרת לא רק את ההתאמה טכני הבדלי סינתזה RNA חילוץ ו- cDNA אך גם מאפשר חישוב כמויות מוחלטת בכל תא, כאשר ספירת ידוע.
מערכת זו משתמשת צעדים נוספים כדי לשמור על דמיון או בחשבון הבדלים טכניים בין תנאי. שלבים אלה מודגשת במיוחד בגלל האופי המורכב של ניסויים אלה, בהם מעורבים מספר set-ups פיזי ותנאים ניסיוני זה יכול להוביל השתנות ניסיוני.

<table><tbody><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA</td><td>gibco</td><td>25300-062</td><td></td></tr><tr><td>10 מ"ל מזרק</td><td>BD</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>10 מ"מ2 צלחת תרבות</td><td>Sarstedt</td><td>83.3902</td><td></td></tr><tr><td>30 מ"ל מזרק</td><td>BD</td><td>302832</td><td></td></tr><tr><td>4 כיווני Stopcocks</td><td>דיסקופיקס</td><td>D500</td><td></td></tr><tr><td>רדיד</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr>אלומיניום<td>BEACH</td><td>Darwin Chambers Company</td><td>MN: HO85, SN: 4947549</td><td></td></tr><tr><td>מגרדי</td><td></td><td></td><td></td>תאים</tr><tr><td>CO2 מטר</td><td>BioSphenix, Ltd.</td><td>MN: P120, SN: 0342</td><td></td></tr><tr><td>CO2 חיישן</td><td>BioSphenix, Ltd.</td><td>MN: C700, SN: 52852</td><td></td></tr><tr><td>מים מזוקקים</td><td>gibco</td><td>15230-170</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח חוצצת פוספט של Dulbecco (DPBS) -/-</td><td>gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>גידול תאי אנדותל בינוני 2</td><td>תא פרומו</td><td>C-22011</td><td></td></tr><tr><td>צמיחת תאי אנדותל בינוני 2 תוסף תערובת תוספים</td> תא <td>פרומו</td><td>C-39216</td><td></td></tr><tr><td>פיברונקטין (טהור)</td><td></td> מסנן <td>11051407001</td><td></td>סיגמא-אולדריץ'</tr><tr><td>(0.20 אום)</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826.001</td><td></td></tr><tr><td>בולם זרימה ו-Cap</td><td>U of T חנות</td><td></td><td></td>ניפוח זכוכית</tr><tr><td>מד זרימה: 400 Series</td><td>Console Transonic Scisense Inc.</td>מד זרימה <td>T402</td><td></td></tr><tr>: צינורות טרנסוניק<td>מסדרת 400</td><td>Scisense Inc.</td><td>מאגר זרימה TS410</td><td></td></tr><tr><td>ו-Cap</td><td>U של חנות</td><td></td><td></td>ניפוח זכוכית T</tr><tr><td>חיישן זרימה</td><td>Transonic Scisense Inc.</td><td>ME4PXL</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp 737F תנור</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>FI-737F</td><td></td></tr><tr><td>J בד</td><td>J</td><td></td><td></td></tr><tr><td>בד מיקרוסקופ שקופיות (25 x 75 x 1 מ"מ)</td> <td>Fisherfinest</td><td>12-544-4</td><td></td></tr><tr><td>נרתיק עיקור נייר</td><td>משאבת Cardinal Health</td><td>92713</td><td></td></tr><tr><td>(Masterflex L/S Economy Drive)</td> <td>Cole-Parmer</td><td>7554-90</td><td></td></tr><tr><td>ראש משאבה (Masterflex L/S Easy Load)</td><td>Cole-Parmer</td><td>7518-00</td><td></td></tr><tr><td>מלבני 4 בארות צלחת</td><td>תרמו מדעי</td><td>267061</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><חזק>שם</חזק></td><td><חזק>חברה</חזק></td><td><חזק>מספר קטלוגי</חזק></td><td><חזק>הערות</חזק></td></tr><tr><td><חזק>צינורות</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Masterflex C-Flex L/S 25 צינורות רכים</td><td>Cole-Parmer</td><td>06424-25</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex C-Flex L/S 14 צינורות רכים</td><td>Cole-Parmer</td><td>06424-14</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex C-Flex L/S 16 צינורות רכים</td><td>Cole-Parmer</td><td>06424-16</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex PharMed BPT L/S 13 צינורות קשים</td><td>Cole-Parmer</td><td>06508-13</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex PharMed BPT L/S 14 צינורות קשיחים</td><td>Cole-Parmer</td><td>06508-14</td><td></td></tr><tr><td>שם</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td><strong></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3/16" זכר Luer</td><td>Cole-Parmer</td><td>45518-08</td><td>עבור צינורות #25</td></tr><tr><td>1/8 אינץ' זכר Luer</td><td>Cole-Parmer</td><td>30800-24</td><td>עבור #16 צינורות</td></tr><tr><td>1/8 אינץ' נקבה</td><td>Luer Cole-Parmer</td><td>30800-08</td><td>עבור #16 צינורות</td></tr><tr><td>1/16 אינץ' זכר Luer</td><td>Cole-Parmer</td><td>45518-00</td><td>עבור #14 צינורות</td></tr><tr><td>1/16 אינץ' נקבה Luer</td><td>Cole-Parmer</td><td>45508-00</td><td>עבור #14 צינורות</td></tr><tr><td>שם</td><td>חברה</חזק></td><td><חזק>מספר קטלוגי</חזק</td><td>><חזק>הערות</חזק</td></tr><tr><td>><חזק>ריאגנטים נוקדאון</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אוליגופקטמין ריאגנט</td><td>Invitrogen</td><td>12252-011</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I סרום מופחת</td><td>בינוני gibco</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>שם<</td><td> strong>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>in vitro שעתוק </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Generuler 1kb+ סולם DNA</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM1331</td><td></td></tr><tr><td>MEGAclear Kit</td><td>Ambion</td><td>AM1908</td><td></td></tr><tr><td>mMESSSEGE mMACHINE SP6 ערכת תמלול</td><td>אמביון</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>pSP-luc +</td> <td>Promega</td><td>E4471</td><td></td></tr><tr><td>סולם DNA מפותל סופר</td><td>ניו אינגלנד BioLabs Inc.</td><td>N0472S</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Ethidium Bromide</td><td>Invitrogen</td><td>15585011</td><td></td></tr><tr><td>XhoI אנזים הגבלה</td><td>ניו אינגלנד BioLabs Inc.</td><td>R0146S</td><td></td></tr><tr><td>שם</td><td>חברה</td><td>מספר קטלוגי</td><td>תגובות</td></tr><tr><td>RNA מיצוי </חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>בטא-מרקפטואתנול</td><td>Sigma</td><td>M3148-100mL</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr></tbody></table>

ניתוח ביטוי גנטי של תאי אנדותל נחשף להטיית מתח באמצעות מרובות במקביל-plate זרימה צ'יימברס

Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers

אנו מתארים זרימת עבודה עבור הניתוח של ביטוי גנים מתאי אנדותל בכפוף זרימה שכבתית קבועה באמצעות תאי זרימה במקביל-plate בפיקוח מרובים. תאי אנדותל ליצור תאי הציפוי הפנימי של כלי הדם, באופן כרוני חשופים לכוח חיכוך של זרימת הדם הנקרא גזירה. בתנאים פיזיולוגיים, תאי אנדותל פונקציה בנוכחות גזירה לתנאים שונים. לפיכך, היישום של גזירה תנאים במבחנה במודלים יכול לספק תובנות רבות יותר על תגובות אנדותל vivo בתוך. תא הזרימה במקביל-plate שפורסמו קודם לכן על ידי ליין. et al. 9 הוא מותאם ללמוד הכונה אנדותל הנוכחות ואת היעדר זרימה שכבתית (שאינם פועמת) קבוע. עיבודים מפתח בקביעת עבור זרימה שכבתית כפי שהוצג כאן כוללים סביבה גדול, ייעודי הבית זרימה בו-זמניות מעגלים, הפיקוח על המחירים זרימה ב בזמן אמת, והכללה של אקסוגני הפניה RNA על נירמול של נתונים כמותיים PCR בזמן אמת. כדי להעריך טיפולים/תנאים מרובים עם היישום של גזירה, זרימת החשמל מרובים, משאבות משמשים בו זמנית בתוך החממה מחוממת, humidified אותו. קצב הזרימה של כל מעגל זרימה נמדד באופן רציף בזמן אמת לתקנן את התנאים גזירה לאורך כל הניסויים. כי ניסויים אלה יש תנאים מרובים, אנו משתמשים גם של RNA אקסוגני עזר זה עלה בבזמנו של RNA חילוץ עבור נירמול של החילוץ-RNA, הראשון-strand cDNA סינתזה היעילות. השלבים למזער את השונות בין הדגימות. אסטרטגיה זו מועסק בצבר שלנו לניתוח ביטוי גנים עם גזירה ניסויים באמצעות תא הזרימה במקביל-צלחת, אבל חלקים של אסטרטגיה זו, כגון אקסוגני הפניה ספייק-ב-RNA, יכול בקלות, באופן חסכוני לשמש יישומים אחרים.

לינאריזציה מוצלחת של פלסמיד לוציפראז באמצעות אנזימי הגבלה אושר על-ידי מוצרי מתעכל פועל על ג'ל agarose (איור 1). הגודל של המוצר ליניארית אושר באמצעות סולמות DNA ו by comparison with פלסמיד נימולים.
לנו יש להתאים את הסידור קאמרית במקביל-plate זרימה של ליין. et al. 9 לניסויים הדורשים תנאים מרובים/טיפולים עם גזירה או גזירה תנאים מרובים. אנו משתמשים סביבה ייעודי, החוף, אש...

כאן מוצג זרימת עבודה עבור ניתוח ביטוי תרבות, גנים של תאי אנדותל תחת גזירה נוזלים. כלול הוא סידור הפיזי בו זמנית דיור וניטור צ'יימברס מרובים זרימה בסביבה מבוקרת, את השימוש RNA אקסוגני עזר עבור ה-PCR כמותי.

We describe a workflow for the analysis of gene expression from endothelial cells subject to a steady laminar flow using multiple monitored parallel-plate ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה ה אנדותל, כגון מדוע כלי הדם יש הבדלים אזוריים בהתפתחות טרשת עורקים? היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת את המחקר בו זמנית של תנאים מרובים תחת לחץ גזים או תנאי מתח גזים מרובים. ההשלכות של טכניקה זו להרחיב לקראת הבנת ויסות גנים אנדותל הן במערכות העורקים והן הווריד כי שיעורי זרימה ודפוסים שונים ניתן להשתמש.ובכן כאן, אנו מדגימים מערכת המשתמשת בזרימה למינארית יציבה. ניתן להתאים את ההתקנה לדפוסי זרימה אחרים, כולל זרימה מופרעת. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו לשמור על מונוליאר מתמשך של תאים לאורך כל הניסוי ולהשיג תוצאות עקביות בין ניסויים.24 שעות לפני הניתוח, לספור את התאים ה אנדותל האנושי במעבר מוקדם וזרע בערך פעם אחת 10 לתאים השישי במיליליטר אחד של מדיום על שקופית זכוכית מצופה fibronectin אחד לכל באר של צלחת תרבות תא ארבע באר. אפשר לתאים לדבוק בשקופית במשך 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן מכסים כל שקופית בשלושה מיליליטר של מדיום ומ מניחים את הצלחת באינקובטור תרבות התא של 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO2 במשך 24 שעות.ביום הניסוי, מלאו את מגש המים של סביבה גדולה, מחוממת ומובנית עם CO2 וחום מתכווננים, או חממת חוף, עם מדפים מרובים, גישה פנימית לחשמל ודלתות זכוכית, ואשרו כי פחמן דו חמצני מתאים זמין לניסוי, ושהצג CO2 מתפקד. כדי להקים את תא הזרימה, הכנס פיתוי נשי בגודל 1/8 אינץ' לקצה אחד של צינור רך מספר 16, והצמד עצירה של ארבעה לפיתוי. חבר את הקצה החופשי של הצינור לצד הזרימה של הצלחת העליונה והכנס פיתוי גברי בגודל 1/8 אינץ ' לקצה אחד של צינור רך מספר 16 שני.חבר עצירה של ארבעה לפיתוי הגברי, והצמד את הקצה החופשי של הצינור לצד הזרימה של הצלחת העליונה. הכנס פיתוי זכר 1/8 אינץ ' ו 1/8 אינץ' נקבה לפתות לתוך כל קצה של צינור רך מספר שלישי 16, ולחבר את הצינורות למלכודת בועה באמצעות 1/8 אינץ ' פיתוי זכר. ואז לצרף stopcock ארבע דרך לקצה השני של הצינורות באמצעות הפיתוי הנשי.באמצעות פינצטה סטרילית, להעביר שקופית אחת זכוכית זרע תא להפסקה על הצלחת התחתונה, תא זרע צד למעלה. השתמש מזרק 10 מיליליטר להוסיף 10 מיליליטר של מדיום חם לצלחת התחתונה בתוך קו אטם אדום סביב הצלחת. מאפשר למדיום לזרום דרך השקופית ולכסות את התאים.מניחים בעדינות את הצלחת העליונה על הצלחת התחתונה דואגים ליישר את הצדדים ולבורג את הצלחות יחד בחוזקה. כדי להסיר בועות אוויר ממלכודת הבועה, פתח תחילה את עצירות הזרימה ומלכודת הבועות וסגור את עצירת הזרימה. לאחר מכן השתמש מזרק 30 מיליליטר כדי לשטוף בעדינות 20 מיליליטר של מדיום חם דרך הצלחת.כדי להסיר בועות מהתא, סגור את עצירת מלכודת הבועה ופתח את עצירת הזרימה. להעלות את צד הזרימה של התא לזווית של 45 מעלות ולהשתמש מזרק 30 מיליליטר כדי לשטוף בעדינות 20 מיליליטר של מדיום חם מהצד הזרימה של התא. חשוב לשטוף בקצב המתאים לכיוון הזרימה ולהשתמש במיקרוסקופ כדי לאשר שמונולר תאים קונפלנטי נשאר לפני חשיפת התאים לזרימת למינאר.לאחר מכן סגרו את העצורים משני צידי התא והכובע ותאשרו שהתאים עדיין מחוברים לשקופית תחת מיקרוסקופ אור. מניחים את תא הזרימה ואת מערכת לולאת זרימה שהורכבה בעבר לתוך החוף לאט להקטין את מהירות המשאבה של הרכבת לולאת הזרימה לפני השהיית המשאבה לגמרי. סגור את stopcocks על מערכת לולאת זרימה כדי למנוע דליפה ולחבר את התא ואת מערכת לולאה יחד באמצעות stopcocks.כאשר כל הלולאות היו מחוברות, לפתוח מחדש את כל stopcocks לאט להגדיל את מהירות המשאבה תוך ניטור ההתקנה עבור כל דליפה או חסימה. מניחים את חיישן הזרימה על צינורות גשר התא של צד הזרימה של התא עם החיישן מכוון לכיוון הזרימה ולהתאים את מהירות המשאבה כדי לקבל את קצב הזרימה עבור שיעור הלחץ הגזיר של ריבית. לאחר מכן הפעל את מיכל CO2 כדי להשיג ריכוז של 5%C02.לאחר השלמת תקופת הזרימה הניסיונית, הקטינו לאט את מהירות המשאבה ההיסטנטית לאפס וכבו את החשמל. סגור במהירות את כל stopcocks פתוח ולהעביר את התא ואת צינורות המצורפת עם stopcock מכל צד לראש ספסל נקי. בזהירות לפרוק את כל הברגים כדי להסיר את הצלחת העליונה ולהשתמש פינצטה האף מחט להעביר את החלקת הזכוכית מהצלחת התחתונה לצלחת בקוטר 100 מילימטר.לשטוף את השקופית ב 10 מיליליטר של PBS קר ולבדוק את התאים תחת מיקרוסקופ כדי לאשר דבקות התא ויישור בכיוון הזרימה. לאחר שאפת PBS, להעביר את השקופית לצלחת נקייה בקוטר 100 מילימטר ולהוסיף 350 microliters של מאגר תיזה בתוספת 1/100th של בטא-Mercaptoethanol מערכת מיצוי RNA לשקופית. השתמש מגרד תאים להב פוליאתילן כדי לגרד את התאים את השקופית להטות את צלחת תרבת הרקמות כדי לאפשר את המאגר בריכה בתחתית.השתמש במדפים כדי להסיר את השקופית ואת פיפטה התא lysate לתוך צינור 1.5 מיליליטר על קרח. לאחר מכן להוסיף 10 microliters של RNA לוציפראז מדולל לתא lysate עבור בידוד RNA במורד הזרם וניתוח על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. ליניאריזציה מוצלחת של פלסמיד לוציפראז באמצעות אנזימי הגבלה ניתן לאשר על ידי הפעלת המוצרים המתעכלים על ג'ל אגרוז ואת גודל המוצר ליניארי ניתן לאשר עם סולמות DNA בהשוואה פלסמיד נימולים.תהליכי ייצור יכולים להוביל לשינויים קטנים בגובה התא, ולכן יש לחשב את קצב הזרימה עבור כל תא כדי להשיג את אותו מתח הגזלה. לניסויים המשלבים מתח גיזת למינאר בתאי אנדותל יונקים, RNA לוציפראז גחליל אש יכול לשמש ספייק-אין RNA אקסוגני. נורמליזציה של גן הייחוס האנדוגניים, גן הייחוס האקסוגני, וגם גנים התייחסות אנדוגניים ואאקסוגניים יחד מניבים תוצאות דומות.שימו לב, בניסויים ייצוגיים אלה באמצעות שני תאי זרימה הפועלים בו זמנית עם לחץ גזירה בפסקל אחד לכל ניסוי, קראפל כמו גורם שני נוקאאוט באמצעות SI-RNA הניב יעילות נוקאאוט דומה בין הדגימות הביולוגיות שנבדקו. בעת ניסיון הליך זה חשוב לזכור להקים אפילו monolayer של תאים על השקופית כדי שפע של מערכת לולאת זרימה לפני חיבור תא הזרימה. בעקבות הליך זה, שיטות אחרות, כמו ריצוף RNA, ניתן להשתמש כדי להעריך ביטוי RNA רחב הגנום וקריאות אחרות, כגון DNA וחלבון, ניתן להשתמש עבור ניתוח מולקולרי נוסף.לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה האנדרותל לחקור את הקשר בין מתח גפיים לפוטנציאל אנגיוגני בתאי אנדותל אנושיים.

gene-expression-analysis-endothelial-cells-exposed-to-shear-stress

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

דוח זה מספק תיאור ויזואלי של ניתוח מקבילות צלחת קאמרית תזרים לחקר אינטראקציות אנדותל ליקוציט תחת לחץ גזירה פיזיולוגי. שיטה זו שימושית במיוחד עבור חוקרים את התפקיד של E-selectin ligands האנדותל (E) ו-selectin ליקוציט כי ליקוציט ההדק מתגלגל על ​​משטחים תא האנדותל.

ניתוח של הרולינג E-selectin בתיווך פיזיולוגי ליקוציט על כלי הדם האנדותל

אנחנו המתאר שיטה תאים חסיד נתונים ללחץ הזרימה למינרית גזירה במעגל תזרים סטרילי מתמשך. הדבקה של התאים, מורפולוגיה ניתן ללמוד דרך תא שקוף, דגימות שהתקבלו במעגל לניתוח המטבוליט ותאי שנקטפו לאחר חשיפה גזירה לניסויים עתידיים או תרבות.

במקביל, צלחת תזרים לשכת ואת מעגל זרימה רציפה להערכת ובתאים אנדותל תחת מתח זרימה למינרית שאר

חדרי זרימת microfluidic חרוט על ידי photolithography מפוברק מ PDMS מוחלים לחקור התוצאות התפקודיות הקשורות בתפקוד EC ודלקת. בניסוי מייצג, את היכולת של מאמץ גזירה ההפרש לווסת הידבקות התא monocytic כדי הפעלת ציטוקינים EC monolayers באה לידי ביטוי.

על שבב phenotyping דלקתיות האנדותל

מחקר זה השתמש במערכת microfluidic צלחת רב גם, להגדיל באופן משמעותי את התפוקה של מחקרים מתגלגלים תא תחת זרימת גזירה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית. לאור החשיבות של מתגלגל תא בתא רב שלבי ביות מפל ואת החשיבות של ביות התא הבאה משלוח מערכתי של אוכלוסיות אקסוגניים של תאים בחולים, מערכת זו מציעה פוטנציאל כפלטפורמת הקרנה כדי לשפר את הטיפול המבוסס על תאים.

ניתוח שיטתי של במבחנה תא רולינג באמצעות מערכת microfluidic צלחת רב גם

ידוע כי רמות ודפוסים שונים של גזירה נוזלית מווסתים את ביטוי הגנים האנדותליים, הפנוטיפ והרגישות למחלות. אנו דנים בהרכבה ושימוש ב'טבעות גזירה': מודל המייצר דפוסי מתח גזירה חד-כיווניים ותקופתיים. טבעות גזירה פשוטות להרכבה, חסכוניות ויכולות לייצר תשואות תאים גבוהות.

האסיפה והיישום של &#39;טבעות Shear&#39;: מודל האנדותל חדשני Orbital, חד-כיוונית תקופתית נוזלי זרימת מתח שאר

המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר את חדר הזרימה המקביל של לוח הצלחת לשימוש בחקירת הפעלה בזמן אמת של ערוצי יונים מכניטיים הרגישים על ידי הטיית מתח.

הקלטות אלקטרופיזיולוגיות של זרמי יונים של תא בודד תחת לחץ הטיה מוגדר היטב

פרוטוקול זה מתאר שיטת ציפוי להגבלת צמיחת תאי אנדותל לאזור מסוים של צלחת 6 בארות ליישום לחץ גזירה באמצעות מודל שייקר מסלולית.

פילוח הצמיחה של תאי אנדותל ב 6-באר צלחות על שייקר מסלולית למחקרים מכניים

כאן, אנו מקימים פרוטוקול כדי לדמיין ולנתח בו זמנית מתחמי SMAD מרובים באמצעות בדיקת קשירת קרבה (PLA) בתאי אנדותל החשופים לתנאי לחץ גזיר נוזלים פתולוגיים ופיזיולוגיים.

הדמיה וכימות של TGFβ/BMP/SMAD איתות בתנאי לחץ שונים של גיסת נוזלים באמצעות קרבה-קשירה-אסאי

אנו מתארים פרוטוקול לבידוד ותרבית תאי אנדותל של ורידים ספניים אנושיים (hSVECs). אנו מספקים גם שיטות מפורטות לייצור לחץ גזירה ומתיחה כדי לחקור לחץ מכני ב- hSVECs.

בידוד תאי אנדותל של וריד ספנוס אנושי וחשיפה לרמות מבוקרות של לחץ גזירה ומתיחה

כאן אנו מציגים פרוטוקול לייצור והפעלה של מערכת מיקרופלואידית החושפת תאי אנדותל להיפרגליקמיה אוסצילטורית מסונכרנת ולמתח גזירה פועם. גישה זו מספקת מודל פיזיולוגי רלוונטי לחקר תפקוד לקוי של אנדותל סוכרתי. פרוטוקול זה מאפשר מדידה כמותית של לחץ חמצוני ותגובות תאי אנדותל.

מערכת מיקרופלואידית למידול תפקוד לקוי של האנדותל תחת מאמץ גזירה פיזיולוגי פועם והיפרגליקמיה אוסצילטורית

למדו ניתוח ביטוי גנטי של תאי אנדותל תחת הטיית מתח באמצעות מערכת זרימה במקביל. השיטה מאפשרת חקר רגולציה גנית במערכות עורקיות וורידיות ומספקת מסגרת למחקר עתידי על השפעות מתח גזירי.

ניתוח ביטוי גנטי של תאי אנדותל נחשף להטיית מתח באמצעות מרובות במקביל-plate זרימה צ'יימברס

גלה סרטונים נוספים