ניתוח ביטוי גנטי של תאי אנדותל נחשף להטיית מתח באמצעות מרובות במקביל-plate זרימה צ'יימברס

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה ה אנדותל, כגון מדוע כלי הדם יש הבדלים אזוריים בהתפתחות טרשת עורקים? היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת את המחקר בו זמנית של תנאים מרובים תחת לחץ גזים או תנאי מתח גזים מרובים. ההשלכות של טכניקה זו להרחיב לקראת הבנת ויסות גנים אנדותל הן במערכות העורקים והן הווריד כי שיעורי זרימה ודפוסים שונים ניתן להשתמש.

ובכן כאן, אנו מדגימים מערכת המשתמשת בזרימה למינארית יציבה. ניתן להתאים את ההתקנה לדפוסי זרימה אחרים, כולל זרימה מופרעת. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו לשמור על מונוליאר מתמשך של תאים לאורך כל הניסוי ולהשיג תוצאות עקביות בין ניסויים.

24 שעות לפני הניתוח, לספור את התאים ה אנדותל האנושי במעבר מוקדם וזרע בערך פעם אחת 10 לתאים השישי במיליליטר אחד של מדיום על שקופית זכוכית מצופה fibronectin אחד לכל באר של צלחת תרבות תא ארבע באר. אפשר לתאים לדבוק בשקופית במשך 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן מכסים כל שקופית בשלושה מיליליטר של מדיום ומ מניחים את הצלחת באינקובטור תרבות התא של 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO2 במשך 24 שעות.

ביום הניסוי, מלאו את מגש המים של סביבה גדולה, מחוממת ומובנית עם CO2 וחום מתכווננים, או חממת חוף, עם מדפים מרובים, גישה פנימית לחשמל ודלתות זכוכית, ואשרו כי פחמן דו חמצני מתאים זמין לניסוי, ושהצג CO2 מתפקד. כדי להקים את תא הזרימה, הכנס פיתוי נשי בגודל 1/8 אינץ' לקצה אחד של צינור רך מספר 16, והצמד עצירה של ארבעה לפיתוי. חבר את הקצה החופשי של הצינור לצד הזרימה של הצלחת העליונה והכנס פיתוי גברי בגודל 1/8 אינץ ' לקצה אחד של צינור רך מספר 16 שני.

חבר עצירה של ארבעה לפיתוי הגברי, והצמד את הקצה החופשי של הצינור לצד הזרימה של הצלחת העליונה. הכנס פיתוי זכר 1/8 אינץ ' ו 1/8 אינץ' נקבה לפתות לתוך כל קצה של צינור רך מספר שלישי 16, ולחבר את הצינורות למלכודת בועה באמצעות 1/8 אינץ ' פיתוי זכר. ואז לצרף stopcock ארבע דרך לקצה השני של הצינורות באמצעות הפיתוי הנשי.

באמצעות פינצטה סטרילית, להעביר שקופית אחת זכוכית זרע תא להפסקה על הצלחת התחתונה, תא זרע צד למעלה. השתמש מזרק 10 מיליליטר להוסיף 10 מיליליטר של מדיום חם לצלחת התחתונה בתוך קו אטם אדום סביב הצלחת. מאפשר למדיום לזרום דרך השקופית ולכסות את התאים.

מניחים בעדינות את הצלחת העליונה על הצלחת התחתונה דואגים ליישר את הצדדים ולבורג את הצלחות יחד בחוזקה. כדי להסיר בועות אוויר ממלכודת הבועה, פתח תחילה את עצירות הזרימה ומלכודת הבועות וסגור את עצירת הזרימה. לאחר מכן השתמש מזרק 30 מיליליטר כדי לשטוף בעדינות 20 מיליליטר של מדיום חם דרך הצלחת.

כדי להסיר בועות מהתא, סגור את עצירת מלכודת הבועה ופתח את עצירת הזרימה. להעלות את צד הזרימה של התא לזווית של 45 מעלות ולהשתמש מזרק 30 מיליליטר כדי לשטוף בעדינות 20 מיליליטר של מדיום חם מהצד הזרימה של התא. חשוב לשטוף בקצב המתאים לכיוון הזרימה ולהשתמש במיקרוסקופ כדי לאשר שמונולר תאים קונפלנטי נשאר לפני חשיפת התאים לזרימת למינאר.

לאחר מכן סגרו את העצורים משני צידי התא והכובע ותאשרו שהתאים עדיין מחוברים לשקופית תחת מיקרוסקופ אור. מניחים את תא הזרימה ואת מערכת לולאת זרימה שהורכבה בעבר לתוך החוף לאט להקטין את מהירות המשאבה של הרכבת לולאת הזרימה לפני השהיית המשאבה לגמרי. סגור את stopcocks על מערכת לולאת זרימה כדי למנוע דליפה ולחבר את התא ואת מערכת לולאה יחד באמצעות stopcocks.

כאשר כל הלולאות היו מחוברות, לפתוח מחדש את כל stopcocks לאט להגדיל את מהירות המשאבה תוך ניטור ההתקנה עבור כל דליפה או חסימה. מניחים את חיישן הזרימה על צינורות גשר התא של צד הזרימה של התא עם החיישן מכוון לכיוון הזרימה ולהתאים את מהירות המשאבה כדי לקבל את קצב הזרימה עבור שיעור הלחץ הגזיר של ריבית. לאחר מכן הפעל את מיכל CO2 כדי להשיג ריכוז של 5%C02.

לאחר השלמת תקופת הזרימה הניסיונית, הקטינו לאט את מהירות המשאבה ההיסטנטית לאפס וכבו את החשמל. סגור במהירות את כל stopcocks פתוח ולהעביר את התא ואת צינורות המצורפת עם stopcock מכל צד לראש ספסל נקי. בזהירות לפרוק את כל הברגים כדי להסיר את הצלחת העליונה ולהשתמש פינצטה האף מחט להעביר את החלקת הזכוכית מהצלחת התחתונה לצלחת בקוטר 100 מילימטר.

לשטוף את השקופית ב 10 מיליליטר של PBS קר ולבדוק את התאים תחת מיקרוסקופ כדי לאשר דבקות התא ויישור בכיוון הזרימה. לאחר שאפת PBS, להעביר את השקופית לצלחת נקייה בקוטר 100 מילימטר ולהוסיף 350 microliters של מאגר תיזה בתוספת 1/100th של בטא-Mercaptoethanol מערכת מיצוי RNA לשקופית. השתמש מגרד תאים להב פוליאתילן כדי לגרד את התאים את השקופית להטות את צלחת תרבת הרקמות כדי לאפשר את המאגר בריכה בתחתית.

השתמש במדפים כדי להסיר את השקופית ואת פיפטה התא lysate לתוך צינור 1.5 מיליליטר על קרח. לאחר מכן להוסיף 10 microliters של RNA לוציפראז מדולל לתא lysate עבור בידוד RNA במורד הזרם וניתוח על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. ליניאריזציה מוצלחת של פלסמיד לוציפראז באמצעות אנזימי הגבלה ניתן לאשר על ידי הפעלת המוצרים המתעכלים על ג'ל אגרוז ואת גודל המוצר ליניארי ניתן לאשר עם סולמות DNA בהשוואה פלסמיד נימולים.

תהליכי ייצור יכולים להוביל לשינויים קטנים בגובה התא, ולכן יש לחשב את קצב הזרימה עבור כל תא כדי להשיג את אותו מתח הגזלה. לניסויים המשלבים מתח גיזת למינאר בתאי אנדותל יונקים, RNA לוציפראז גחליל אש יכול לשמש ספייק-אין RNA אקסוגני. נורמליזציה של גן הייחוס האנדוגניים, גן הייחוס האקסוגני, וגם גנים התייחסות אנדוגניים ואאקסוגניים יחד מניבים תוצאות דומות.

שימו לב, בניסויים ייצוגיים אלה באמצעות שני תאי זרימה הפועלים בו זמנית עם לחץ גזירה בפסקל אחד לכל ניסוי, קראפל כמו גורם שני נוקאאוט באמצעות SI-RNA הניב יעילות נוקאאוט דומה בין הדגימות הביולוגיות שנבדקו. בעת ניסיון הליך זה חשוב לזכור להקים אפילו monolayer של תאים על השקופית כדי שפע של מערכת לולאת זרימה לפני חיבור תא הזרימה. בעקבות הליך זה, שיטות אחרות, כמו ריצוף RNA, ניתן להשתמש כדי להעריך ביטוי RNA רחב הגנום וקריאות אחרות, כגון DNA וחלבון, ניתן להשתמש עבור ניתוח מולקולרי נוסף.

לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה האנדרותל לחקור את הקשר בין מתח גפיים לפוטנציאל אנגיוגני בתאי אנדותל אנושיים.