Name: הכנה של חוט השדרה חריפה פרוסות תאים כל תיקון-קלאמפ הקלטה בנוירונים הסובסטנציה Gelatinosa (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: למדו את שיטת ה-patch-clamp בתאים שלמים לרישום נוירונים מ-substantia gelatinosa בפרוסות חוט שדרה in vitro. שיטה זו מאפשרת חקר תכונות ממברנה, העברה סינפטית ומנגנוני כאב כרוני.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים הלאומי מדעי הטבע קרן של סין (מס 81560198, 31660289).

כל הפרוטוקולים ניסיוני תיאר אושרו על-ידי חיה אתיקה הוועדה של נאנצ'אנג האוניברסיטה (נאנצ'אנג, סין, No.2017 האתית-010). כל המאמצים נעשו כדי למזער את הלחץ והכאב של החיות ניסיוני. ההקלטות אלקטרופיזיולוגיות שבוצעה כאן בוצעו בטמפרטורת החדר (RT, 22 – 25 ° C).
1. בעלי חיים
<ol><li>השתמש חולדות ספראג-Dawley (בן 3-5 שבועות) של מין או. בית החיות תחת מחזור 12 שעות אור-כהה, נותן להם ad libitum גישה נאותה מזון ומים.</li>
</ol>2. הכנת החומרים והפתרונות
<ol><li>פתרונות<ol>
<li>להכנת נוזל מוחי שדרתי מלאכותי (כלנית חדד) (במ מ): 117 NaCl, 3.6 אשלגן כלורי, 1.2 NaH2PO4·2H2O, 2.5 CaCl2·2H2O, 1.2 MgCl2·6H2O, 25 NaHCO3, ד 11-גלוקוז, חומצה אסקורבית 0.4 ו- 2 פירובט נתרן. ראה טבלה 1.</li>
		<li>להכין סוכרוז-כלנית חדד (במ מ): 240 סוכרוז, 2.5 אשלגן כלורי, 1.25 NaH2PO4·2H2O, 0.5 CaCl2·2H2O, 3.5 MgCl2·6H2O, 25 NaHCO3, חומצה אסקורבית 0.4 ו נתרן 2 פירובט. עיין בטבלה 2.</li>
		<li>להכין K+-המבוסס על פתרון תאיים (במ מ): 130 K-gluconate, 5 אשלגן כלורי, נה 102-phosphocreatine, 0.5 EGTA, 10 HEPES, 4 מ ג-ATP ו Li 0.3-GTP. עיין בטבלה 3.</li>
		<li>להכין Cs+-המבוסס על פתרון תאיים (במ מ): 92 CsMeSO4, 43 CsCl, נה 102-phosphocreatine, 5 tetraethylammonium (תה) - קלרנית, 0.5 EGTA, 10 HEPES מ ג - ATP ו Li 0.3-GTP. עיין בטבלה 4. הערה: כל הפתרונות חייבים להיות מוכנים באמצעות מים מזוקקים. חנה המבר ואת סוכרוז-חנה המבר צריך להיות carbogenated (95% O2 ו- 5% CO2 תערובת) לפני השימוש כדי לשמור על pH אופטימלי של 7.4 ולאחר osmolality הפתרונות הללו שני צריך להיות מותאם כדי mOsm 300 – 310. כי חומצה אסקורבית יכול להשפיע על ערוצי סידן, סוכן זה חייב להיות מושמט אם אחד רוצה להקליט זרמים סידן. Osmolality ו- pH של פתרונות תאיים עליו להיות נמדד, התרגלו 290-300 mOsm ו- 7.2 – 7.3, בהתאמה. מומלץ לסנן את הפתרונות תאיים עם 0.2 µm מסננים ולאחסן את הפתרונות כמו aliquots 1 מ"ל ב-20 ° C. Cs+ ותה מוחלות ב Cs+-המבוסס על פתרון תאיים לערוץ אשלגן בלוק, אשר תורמת באמצעות המגבר להחזיק את הקרום פוטנציאל קבוע ב 0 mV בעת הקלטת הזרמים postsynaptic מעכבות (IPSCs).</li>
		<li>להכין את הפתרון neurobiotin 488 0.05%. לפזר 2 מ ג של neurobiotin 488 ב 4 מ של K+-המבוסס על פתרון תאיים ולהתאים את osmolality כדי 290-300 mOsm באמצעות מים מזוקקים או סוכרוז במידת הצורך. הערה: 1 מ מ סוכרוז מגדילה osmolarity 1 mOsm.</li>
		<li>להכין 3% אגר כבלוק בחוט השדרה. להמיס 7.5 גר' של אגר ב 250 מ של מים מטוהרים בתוך זכוכית, ולאחר מכן להשתמש מיקרוגל אחמם את זה עד רותחים ולנקות. מערבולת הפתרון, שופכים את התערובת לתוך 17.5 ס"מ x 10.5 ס"מ x 1.8 ס מ קופסת פלסטיק התמצקות לאחר מכן. שמור על אגר ב 4 ° C לפני השימוש.</li>
		<li>להכין 4% paraformaldehyde (PFA) עיבוד immunohistochemical. מיקס 40 גר' אבקת PFA ~ 800 מיליליטר מחוממים (כ 60 ° C) 1 x PBS פתרון (130 מ"מ NaCl, 7 מ מ נה2HPO4, 3 מ מ NaH2PO4). לאט לאט להתאים את ה-pH על-ידי הוספת 1 טיפות N NaOH עד PFA אבקת התפרקה לחלוטין. ברגע הפתרון כבר ברור, לכוונן את עוצמת הקול הכולל עד 1 ליטר עם 1 x PBS. להתאים מחדש את ה-pH ל 7.2 – 7.4 באמצעות 1 HCl N בעת הצורך, ואז לסנן את הפתרון PFA 4%, לאחסן אותו ב-20 ° C עד השימוש. הערה: PFA הוא רעיל, כך נדרש ללבוש מסיכות, כפפות, כמו גם בטיחות משקפיים. לנהל את תהליך הכנת 4% PFA בתוך ברדס מאוורר. אבקת PFA יכול להיות מומס לחלוטין ב- pH של 9 – 10.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
כלי נגינה
	<ol>
<li>מערכת אלקטרופיזיולוגיות טיפוסי, להשתמש במיקרוסקופ זקוף מצויד עם ניגודיות התערבות דיפרנציאלית אינפרא-אדום (IR-DIC), מטרה טבילה במי ברזולוציה גבוהה, מצלמת CCD/CMOS, מגבר תיקון-קלאמפ, בעל micropipette ו- a micromanipulator המאפשר התאמת משובח של העמדה פיפטה. שלב XY נחוץ גם כדי להזיז את המיקרוסקופ.</li>
		<li>הר כל הציוד על שולחן בידוד רטט מוקף כלוב פאראדיי. לחבר צג וידאו מצלמת וידאו כדי לבחון את הנוירונים והמחש את micropipettes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Micropipettes
	<ol>
<li>להפוך אלקטרודות הקלטה מ זכוכית בורוסיליקט נימים באמצעות של פולר micropipette. הטווחים ההתנגדות פיפטה אופייני של MΩ 3-6 כאשר מלא עם פתרון תאיים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
בלוק אגר
	<ol>
<li>הכן של 1.2 ס מ x 1.5 ס"מ x 2.0 ס מ אגר בלוק. חתוך את הבלוק לתוך הצורות המוצגות באיור 1 כנדרש.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. חוט השדרה חריפה פרוסה הכנה
הערה: פרוסות חוט השדרה רוחבי או parasagittal מוכנות כמו בעבר תיאר18,19,20.
<ol><li>לפני transcardial זלוף והפקת חוט השדרה, להכין ~ 500 מל סוכרוז-כלנית חדד equilibrated עם 95% O2 ו- 5% CO2 , מגניב הפתרון כקרח (0 – 4 ° C).</li>
	<li>לקרר כל דיסקציה הכלים (למשל, לנתח מספריים, מספריים איריס, מלקחיים במיתולגיות, מלקחיים בסדר, מלקחיים מעוקלים) על הקרח. הדיאגרמה ההכנה של חוט השדרה חריפה פרוסה מוצג באיור1.</li>
	<li>Transcardial זלוף<ol>
<li>לאחר זריקה אחת (i.p. בקרום הבטן,) של urethane (1.5 g/ק ג), להמתין 2-3 דקות, להעריך את עומק ההרדמה של חולדות באמצעות בדיקה תגובות קמצוץ הבוהן או הזנב. ברגע מטוס כירורגי של הרדמה נשמר, מניחים את החולדה על קרח כתוש במצב פרקדן. הערה: עבור הפקת הרדמה עמוקה מספיק עבור אי-תפיסת הכאב במהלך ניקור חזה, בצע את ההנחיות IACUC המקומי שלך.</li>
		<li>בחתך (3-4 ס מ) דרך העור מן הסרעפת יווארה לעצם הבריח, ולאחר מכן בצע חתך רוחבי מתחת לרמה של הסרעפת.</li>
		<li>לאחוז ולגדל הסרעפת עם זוג מלקחיים מעוקל לחשוף את הסרעפת לחלוטין. עושים חתך רוחבי דרך הסרעפת ולאחר מכן לחתוך בית החזה בין החזה הצלעות בשני הצדדים כדי לפתוח את החזה. השתמש המלקחיים מעוקל להבין הסרעפת קשת הצלעות הוא קבוע, הלב חשוף במידה מספקת.</li>
		<li>החזקת את הלב עם מלקחיים מעוקל עוד בעדינות, ולאחר מכן להכניס מחט 22 גרם דרך החדר השמאלי לבסיס של קשת אבי העורקים.</li>
		<li>לחתוך אטריום ימין עם מספריים בסדר באופן מיידי ולאחר מכן התחל את זלוף של קר כקרח, מחומצן סוכרוז-חנה המבר דרך מערכת הכבידה. הערה: transcardial מהיר ולא מספיקות זלוף עם סוכרוז כקרח-חנה המבר יכול להקל על התקררות מהירה של חוט השדרה, תוך ריכוז נתרן וסידן עשויה לעזור להקל על רעילות סינאפסות ולהגן על תפקוד. בנוסף, ניקוי תאי דם אדומים יהיה מועיל להפחתת רקע ההכתמה של biocytin בעת ביצוע מחקר מורפולוגי. זלוף נחשב מספיק מרוצה עוד הנוזל יציאה אטריום ימין נקי, צבע הכבד של החולדה, כפות רגליים הוא חיוור. קצה המחט 22 גרם צריך להיות בוטה כדי למנוע קריעה מבחינה והלב.</li>
	</ol>
</li>
	<li>חיתוך בחוט השדרה וחלוקת<ol>
<li>עושים חתך אורכי (5 ס מ) על העור בחזרה מן סימטרית כדי rostral, ואז לחתוך את בית החזה בין עמוד השדרה ואת הצלעות משני צדדיו של מדינת זלוף.</li>
		<li>עושים חתך בסוף סימטרית של עמוד השדרה, להשתמש במספריים לחתוך משם הרקמות הסובבות, לבודד במהירות על קטע lumbosacral של עמוד השדרה.</li>
		<li>להעביר את המקטע lumbosacral צלחת זכוכית המכיל חנה המבר מבוססי סוכרוז קר כקרח. עם הצד הבטני כלפי מעלה, השתמש בסדר מספריים לחתוך דרך pedicle בחוליות בשני הצדדים ולחשוף את חוט השדרה בקפידה. לבודד של 2 ס מ ארוך חוט השדרה עם התרחבות lumbosacral (L1-S3) ולהעביר את המקטע בעמוד השדרה עוד צלחת זכוכית מלא עם סוכרוז קר-כלנית חדד.</li>
		<li>הסר את קרומי המוח ואת קרום pia-בחופשיות תחת מיקרוסקופ ויבתר. חותכים כל הגחוני / ואת השורשים העזוב משם מהר ככל האפשר.</li>
		<li>במקום חוט השדרה על בלוק אגר בעבר החתוך. כדי להכין פרוסות רוחבי, לצרף את הצד הבטני של חוט השדרה אגר ותנו הצד הגבי לכיוון הלהב. כדי להכין פרוסות parasagittal, לצרף הצד הבטני עם דבק מגע אגר בכיוון אנכי כמוצג באיור1. לאחר מכן, הר אגר גוש על פלטפורמה vibratome עם דבק מגע. להכין 300 – 500 מיקרומטר רוחבי או פרוסות parasagittal עם מהירות מראש של 0.025 mm/s, תדירות הרטט של 80 הרץ.</li>
		<li>השתמש פיפטה של חיתוך פלסטיק כדי להעביר את הפרוסות על רשת ניילון בתוך תא האחסון המכיל ברציפות מחומצן כלנית חדד-32 מעלות צלזיוס במשך לפחות 30 דקות לפני ההקלטה. הערה: לטפל כדי למנוע פגיעה בחוט השדרה, במיוחד קרן הגבי, בעת הסרת את קרומי המוח ואת השורשים בעמוד השדרה. צריך להיות פרוס חוט השדרה הגבי-ventrally. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, הפרוסות כדאי להיערך במהירות (תוך 15-20 דקות). עובי הפרוסה בעמוד השדרה צריך להיות לא יותר מ-600 מיקרומטר לספק ניראות התא. בנוסף, ניתן להשתמש בטכניקה המתוארת לעיל כדי לקבל פרוסות בעמוד השדרה אופקי.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. כל תא תיקון-קלאמפ הקלטות
<ol><li>כדי לנהל את הקלטות תאים כל תיקון-קלאמפ ס ג נוירונים, השתמש K+-המבוסס על פתרון תאיים ברוב המקרים הקלטה, תוך יישום מדעי המחשב+-המבוסס על פתרון רק עבור ההקלטה של זרמי postsynaptic מעכבות.</li>
	<li>להניע בעדינות פרוסה חוט השדרה אל התא הקלטה, ולאחר מכן לשמור אותו עם חוט הפלטינה בצורת U מחובר עם חוטי ניילון בחוזקה ליציבות פרוסה אופטימלית. בהתמדה perfuse את הפרוסה עם חנה המבר מבעבע-RT דרך מערכת הכבידה ולהגדיר את קצב זלוף ב- 4-2 מ ל/דקה כדי להשיג חמצון מספיקות.</li>
	<li>לזהות את האזור של SG (רצועה שקופה) באמצעות עדשה מיקרוסקופ ברזולוציה נמוכה, לבחור נוירון בריא באמצעות המטרה ברזולוציה גבוהה כמו תא היעד, להתאים אותו למרכז המסך צג וידאו.</li>
	<li>למלא את micropipette של אמצעי אחסון המתאים של K+-מבוסס או Cs+-המבוסס על פתרון תאיים כנדרש, להכניס את micropipette בעל אלקטרודה, ולוודא כי הפתרון תאיים יוצר קשר החוט כסף בפנים מחזיק.</li>
	<li>להכניס את micropipette המוקד, לטבול אותו לתוך חנה המבר באמצעות micromanipulator ולאחר מכן החל לחץ חיובי מתון (~ 1 psi כאשר נמדד עם manometer) כדי לאלץ את micropipette מן כל לכלוך ופסולת.</li>
	<li>להעביר את micropipette לעבר יישוב נוירון בהדרגה. שחרור הלחץ חיובי ברגע פיפטה גישות הנוירון וטפסים גומת חן קטן מאוד על קרום עצביים כדי ליצור gigaseal.</li>
	<li>לשנות את החזקת פוטנציאל ל-70 mV, אשר קרוב פיזיולוגיים נח קרומית אפשרית (RMP) של תא. לאחר מכן, חלות יניקה ארעי ועדין micropipette קרע את הקרום, ליצור תצורת תאים כל טוב. הערה: לאחר העברת הפרוסה לחדר ההקלטה, ודא זלוף יציב למשך לפחות 5 דקות לנקות את הלכלוך על פני פרוסה. ראוי לציין כי היכולת להבחין בין נוירונים בריא, לא בריא/מת היא בעלת חשיבות עליונה עבור הקלטה יציבה ואטימות טובים. נוירון לא בריא/מת יש מראה נפוח או מכווצים, יחד עם גרעין גדול לעין, בעוד נוירון בריא מאופיין על-ידי צורה תלת-ממדי (3D) עם קרום מבריק וחלק, בגרעין בלתי נראה. כדי להשיג תצורה של תאים שלמים, זה חיוני כדי לפצות על קיבול מהירה או איטית שלב אחר שלב בעת הצורך. במלון RT, מחושבת לצומת נוזלי פוטנציאל להיות 15.1 – 15.2 mV ו- 4.3 – 4.4 mV ב- K+-מבוסס ו Cs+-המבוסס על פתרון תאיים, בהתאמה. במחקרים שלנו, נתוני ההקלטות תוקנו לא עבור צומת נוזלי פוטנציאל.</li>
	<li>הקלטות של מאפייני קרום פנימי<ol>
<li>להקליט את מאפייני פסיבי קרום פנימי: שיא RMP מיד (תוך 20 s) לאחר הפסקת. לקבוע את ההתנגדות קלט העצבית על ידי מדידת מתח התגובה depolarizing הנוכחי (pA 10, 500 ms) בכל RMP במצב הנוכחי-קלאמפ.</li>
		<li>הרשומה ירי מאפיינים: לבחון את דפוס הירי של כל נוירון הנוכחי-קלאמפ עם סדרה של 1 s depolarizing פולסים הנוכחי (25 – 150 הרשות הפלסטינית עם הרשות הפלסטינית 25 הפרש קבוע)-RMP. למדוד את הסף, משרעת ו בחצי-רוחב של פוטנציאלי פעולה יחיד במצב לא מקוון.</li>
		<li>להקליט הנוכחי subthreshold: כדי להעריך את הזרמים subthreshold הסומטית, החזק את הקרום פוטנציאליים ב-50 mV במצב מתח-קלאמפ. לאחר מכן, להחיל שורה של hyperpolarizing מתח פולסים של משך s 1 מ-60 mV ל-120 mV, עם הקטנת 10-mV.</li>
		<li>להקליט זרמים postsynaptic מעוררים (EPSCs): EPSCs שיא עם K+-המבוסס על פתרון תאיים במצב מתח-קלאמפ ב פוטנציאל החזקה של-70 mV.</li>
		<li>IPSCs שיא: להחיל Cs+-המבוסס על פתרון תאיים הקלטה IPSCs. לאחר תצורת כל תא הוא הוקם, להחזיק את הקרום פוטנציאליים ב-70 mV ~ 5 דקות ולאחר מכן תשנה החזקת פוטנציאליים 0 mV בהדרגה. המתן מספר דקות לייצוב ולאחר מכן התחל להקליט את האירועים IPSC. הערה: יש לבחור רק נוירונים עם RMP של פחות מ-50 mV והצגה להחטיא ללימוד נוסף. סדרת resistances במחקר שלנו. בדרך כלל 10-30 MΩ, לא להיות כלולים הקלטה ברגע ההתנגדות סדרת שינויים על ידי יותר מ 20%. EPSCs יכול להיות מאושרות עם יישום אמבט של 50 מיקרומטר APV ו 20 מיקרומטר CNQX, בעוד IPSCs יכול להיות מאושרות עם 10 מיקרומטר bicuculline ו 1 מיקרומטר סטריכנין.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. מחקר מורפולוגי
<ol><li>לניסויים מורפולוגי, להשתמש K+-המבוסס על פתרון תאיים המכילה 0.05% neurobiotin 488.</li>
	<li>לאחר שמירה על יציבה אלקטרופיזיולוגיות מהקלטה של 20 דקות לפחות, הסר את micropipette בכיוון כלפי מעלה כדי לאפשר את קרום התא לאטום מחדש ולהעביר את הפרוסה חוט השדרה במיכל מלא עם 4% מחברים. לסדר את הפרוסות ב- 4% PFA RT עבור 1 h ולאחר מכן 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.</li>
	<li>לשטוף את הפרוסות ב- PBS ולאחר מכן לטבול אותם 50% אתנול למשך 30 דקות. לאחר עוד שלושה שוטף ב- PBS, לטעון את הפרוסות בעובי המקורי שלהם על גבי שקופיות עם מדיום הרכבה.</li>
	<li>השתמש מיקרוסקופ קונפוקלי (ראה טבלה של חומרים) עבור ייבוא תמונות ושיחזור 3D עצביים. סרוק את הנוירונים דרך עדשה X 20 עם z-ערימת 1.5 מיקרומטר.</li>
</ol>

<ol><li>Todd, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+circuitry+for+pain+processing+in+the+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (12), 823-836 (2010).</li>
<li>Yoshimura, M., Nishi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blind+patch-clamp+recordings+from+substantia+gelatinosa+neurons+in+adult+rat+spinal+cord+slices%3A+pharmacological+properties+of+synaptic+currents%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Blind patch-clamp recordings from substantia gelatinosa neurons in adult rat spinal cord slices: pharmacological properties of synaptic currents.</a> Neuroscience. 53 (2), 519-526 (1993).</li>
<li>Maxwell, D. J., Belle, M. D., Cheunsuang, O., Stewart, A., Morris, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+of+inhibitory+and+excitatory+interneurons+in+superficial+laminae+of+the+rat+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology.+584+%28Pt%22%5BJournal%5D)">Morphology of inhibitory and excitatory interneurons in superficial laminae of the rat dorsal horn.</a> The Journal of Physiology. 584 (Pt. 2, 521-533 (2007).</li>
<li>Grudt, T. J., Perl, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlations+between+neuronal+morphology+and+electrophysiological+features+in+the+rodent+superficial+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Correlations between neuronal morphology and electrophysiological features in the rodent superficial dorsal horn.</a> The Journal of Physiology. 540 (Pt 1), 189-207 (2002).</li>
<li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+feed-forward+spinal+cord+glycinergic+neural+circuit+gates+mechanical+allodynia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">A feed-forward spinal cord glycinergic neural circuit gates mechanical allodynia.</a> Journal of Clinical Investigation. 123 (9), 4050-4062 (2013).</li>
<li>Zheng, J., Lu, Y., Perl, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+neurones+of+the+spinal+substantia+gelatinosa+mediate+interaction+of+signals+from+primary+afferents%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Inhibitory neurones of the spinal substantia gelatinosa mediate interaction of signals from primary afferents.</a> The Journal of Physiology. 588 (Pt 12), 2065-2075 (2010).</li>
<li>Balasubramanyan, S., Stemkowski, P. L., Stebbing, M. J., Smith, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sciatic+chronic+constriction+injury+produces+cell-type-specific+changes+in+the+electrophysiological+properties+of+rat+substantia+gelatinosa+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Sciatic chronic constriction injury produces cell-type-specific changes in the electrophysiological properties of rat substantia gelatinosa neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 96 (2), 579-590 (2006).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+signal-regulated+kinase+%28ERK%29+activation+is+required+for+itch+sensation+in+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Brain%22%5BJournal%5D)">Extracellular signal-regulated kinase (ERK) activation is required for itch sensation in the spinal cord.</a> Molecular Brain. 7, 25(2014).</li>
<li>Kopach, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+alters+trafficking+of+extrasynaptic+AMPA+receptors+in+tonically+firing+lamina+II+neurons+of+the+rat+spinal+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Inflammation alters trafficking of extrasynaptic AMPA receptors in tonically firing lamina II neurons of the rat spinal dorsal horn.</a> Pain. 152 (4), 912-923 (2011).</li>
<li>Takasu, K., Ono, H., Tanabe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+hyperpolarization-activated+cyclic+nucleotide-gated+cation+channels+at+primary+afferent+terminals+contribute+to+chronic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Spinal hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation channels at primary afferent terminals contribute to chronic pain.</a> Pain. 151 (1), 87-96 (2010).</li>
<li>Iura, A., Takahashi, A., Hakata, S., Mashimo, T., Fujino, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reductions+in+tonic+GABAergic+current+in+substantia+gelatinosa+neurons+and+GABAA+receptor+delta+subunit+expression+after+chronic+constriction+injury+of+the+sciatic+nerve+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pain%22%5BJournal%5D)">Reductions in tonic GABAergic current in substantia gelatinosa neurons and GABAA receptor delta subunit expression after chronic constriction injury of the sciatic nerve in mice.</a> European Journal of Pain. 20 (10), 1678-1688 (2016).</li>
<li>Alles, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+nerve+injury+increases+contribution+of+L-type+calcium+channels+to+synaptic+transmission+in+spinal+lamina+II%3A+Role+of+alpha2delta-1+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pain%22%5BJournal%5D)">Peripheral nerve injury increases contribution of L-type calcium channels to synaptic transmission in spinal lamina II: Role of alpha2delta-1 subunits.</a> Molecular Pain. 14, 1-12 (2018).</li>
<li>Santos, S. F., Rebelo, S., Derkach, V. A., Safronov, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitatory+interneurons+dominate+sensory+processing+in+the+spinal+substantia+gelatinosa+of+rat%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Excitatory interneurons dominate sensory processing in the spinal substantia gelatinosa of rat.</a> The Journal of Physiology. 581 (Pt 1), 241-254 (2007).</li>
<li>Lu, Y., Perl, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+organization+of+excitatory+circuits+between+neurons+of+the+spinal+superficial+dorsal+horn+%28laminae+I+and+II%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modular organization of excitatory circuits between neurons of the spinal superficial dorsal horn (laminae I and II).</a> The Journal of Neuroscience. 25 (15), 3900-3907 (2005).</li>
<li>Hantman, A. W., van den Pol, A. N., Perl, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+physiological+features+of+a+set+of+spinal+substantia+gelatinosa+neurons+defined+by+green+fluorescent+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Morphological and physiological features of a set of spinal substantia gelatinosa neurons defined by green fluorescent protein expression.</a> The Journal of Neuroscience. 24 (4), 836-842 (2004).</li>
<li>Yasaka, T., Tiong, S. Y., Hughes, D. I., Riddell, J. S., Todd, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Populations+of+inhibitory+and+excitatory+interneurons+in+lamina+II+of+the+adult+rat+spinal+dorsal+horn+revealed+by+a+combined+electrophysiological+and+anatomical+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Populations of inhibitory and excitatory interneurons in lamina II of the adult rat spinal dorsal horn revealed by a combined electrophysiological and anatomical approach.</a> Pain. 151 (2), 475-488 (2010).</li>
<li>Yin, H., Park, S. A., Han, S. K., Park, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+5-hydroxytryptamine+on+substantia+gelatinosa+neurons+of+the+trigeminal+subnucleus+caudalis+in+immature+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Effects of 5-hydroxytryptamine on substantia gelatinosa neurons of the trigeminal subnucleus caudalis in immature mice.</a> Brain Research. 1368, 91-101 (2011).</li>
<li>Hu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lidocaine+Inhibits+HCN+Currents+in+Rat+Spinal+Substantia+Gelatinosa+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesia+and+Analgesia%22%5BJournal%5D)">Lidocaine Inhibits HCN Currents in Rat Spinal Substantia Gelatinosa Neurons.</a> Anesthesia and Analgesia. 122 (4), 1048-1059 (2016).</li>
<li>Peng, H. Z., Ma, L. X., Lv, M. H., Hu, T., Liu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minocycline+enhances+inhibitory+transmission+to+substantia+gelatinosa+neurons+of+the+rat+spinal+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Minocycline enhances inhibitory transmission to substantia gelatinosa neurons of the rat spinal dorsal horn.</a> Neuroscience. 319, 183-193 (2016).</li>
<li>Peng, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+presynaptic+HCN+channels+to+excitatory+inputs+of+spinal+substantia+gelatinosa+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Contribution of presynaptic HCN channels to excitatory inputs of spinal substantia gelatinosa neurons.</a> Neuroscience. 358, 146-157 (2017).</li>
<li>Liu, N., Zhang, D., Zhu, M., Luo, S., Liu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minocycline+inhibits+hyperpolarization-activated+currents+in+rat+substantia+gelatinosa+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Minocycline inhibits hyperpolarization-activated currents in rat substantia gelatinosa neurons.</a> Neuropharmacology. 95, 110-120 (2015).</li>
<li>Brown, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+whole-cell+recording+from+visually+preselected+neurons+of+perirhinal+cortex+in+brain+slices+from+young+and+aging+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Methods for whole-cell recording from visually preselected neurons of perirhinal cortex in brain slices from young and aging rats.</a> Journal of Neuroscience Methods. 86 (1), 35-54 (1998).</li>
<li>Rothman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neurotoxicity+of+excitatory+amino+acids+is+produced+by+passive+chloride+influx%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The neurotoxicity of excitatory amino acids is produced by passive chloride influx.</a> The Journal of Neuroscience. 5 (6), 1483-1489 (1985).</li>
<li>Rice, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+ascorbate+in+the+preparation+and+maintenance+of+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Use of ascorbate in the preparation and maintenance of brain slices.</a> Methods. 18 (2), 144-149 (1999).</li>
<li>Takasu, K., Ogawa, K., Minami, K., Shinohara, S., Kato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injury-specific+functional+alteration+of+N-type+voltage-gated+calcium+channels+in+synaptic+transmission+of+primary+afferent+C-fibers+in+the+rat+spinal+superficial+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Injury-specific functional alteration of N-type voltage-gated calcium channels in synaptic transmission of primary afferent C-fibers in the rat spinal superficial dorsal horn.</a> European Journal of Pharmacology. 772, 11-21 (2016).</li>
<li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitatory+synaptic+transmission+in+the+spinal+substantia+gelatinosa+is+under+an+inhibitory+tone+of+endogenous+adenosine%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Excitatory synaptic transmission in the spinal substantia gelatinosa is under an inhibitory tone of endogenous adenosine.</a> Neuroscience Letters. 477 (1), 28-32 (2010).</li>
<li>Funai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+dexmedetomidine+augments+inhibitory+synaptic+transmission+in+the+superficial+dorsal+horn+through+activation+of+descending+noradrenergic+control%3A+an+in+vivo+patch-clamp+analysis+of+analgesic+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Systemic dexmedetomidine augments inhibitory synaptic transmission in the superficial dorsal horn through activation of descending noradrenergic control: an in vivo patch-clamp analysis of analgesic mechanisms.</a> Pain. 155 (3), 617-628 (2014).</li>
<li>Yamasaki, H., Funai, Y., Funao, T., Mori, T., Nishikawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+tramadol+on+substantia+gelatinosa+neurons+in+the+rat+spinal+cord%3A+an+in+vivo+patch-clamp+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Effects of tramadol on substantia gelatinosa neurons in the rat spinal cord: an in vivo patch-clamp analysis.</a> PLoS One. 10 (5), e0125147(2015).</li>
<li>Furue, H., Narikawa, K., Kumamoto, E., Yoshimura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responsiveness+of+rat+substantia+gelatinosa+neurones+to+mechanical+but+not+thermal+stimuli+revealed+by+in+vivo+patch-clamp+recording%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Responsiveness of rat substantia gelatinosa neurones to mechanical but not thermal stimuli revealed by in vivo patch-clamp recording.</a> The Journal of Physiology. 521 (Pt 2), 529-535 (1999).</li>
<li>Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+brain+slice+methods+for+adult+and+aging+animals%3A+application+of+targeted+patch+clamp+analysis+and+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics.</a> Methods in Molecular Biology. 1183, 221-242 (2014).</li>
<li>Ting, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Acute+Brain+Slices+Using+an+Optimized+N-Methyl-D-glucamine+Protective+Recovery+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), e53825(2018).</li>
<li>Li, J., Baccei, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+Tissue+Damage+Promotes+Spike+Timing-Dependent+Synaptic+Long-Term+Potentiation+in+Adult+Spinal+Projection+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neonatal Tissue Damage Promotes Spike Timing-Dependent Synaptic Long-Term Potentiation in Adult Spinal Projection Neurons.</a> The Journal of Neuroscience. 36 (19), 5405-5416 (2016).</li>
<li>Ford, N. C., Ren, D., Baccei, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NALCN+channels+enhance+the+intrinsic+excitability+of+spinal+projection+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">NALCN channels enhance the intrinsic excitability of spinal projection neurons.</a> Pain. , (2018).</li>
<li>Cui, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+synaptic+transmission+from+primary+afferents+to+spinal+substantia+gelatinosa+neurons+by+group+III+mGluRs+in+GAD65-EGFP+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Modulation of synaptic transmission from primary afferents to spinal substantia gelatinosa neurons by group III mGluRs in GAD65-EGFP transgenic mice.</a> Journal of Neurophysiology. 105 (3), 1102-1111 (2011).</li>
<li>Yang, K., Ma, R., Wang, Q., Jiang, P., Li, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optoactivation+of+parvalbumin+neurons+in+the+spinal+dorsal+horn+evokes+GABA+release+that+is+regulated+by+presynaptic+GABAB+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Optoactivation of parvalbumin neurons in the spinal dorsal horn evokes GABA release that is regulated by presynaptic GABAB receptors.</a> Neuroscience Letters. , 55-59 (2015).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

פרטים זה פרוטוקול השלבים להכנת פרוסות בחוט השדרה, אשר השתמשנו בהצלחה בעת ביצוע ניסויים תאים כל תיקון-קלאמפ ב ס ג נוירונים18,19,20,21. על-ידי יישום שיטה זו, דיווחנו לאחרונה minocycline, דור שני של טטרציקלין, יכול לשפר במידה ניכרת הסינאפסית מעכבות באמצעות מנגנון presynaptic ס ג נוירונים19. בנוסף, סוכן זה יכול להקטין משרעת של אניh , עוד לעכב את דעתנית של ס ג נויר...

Gelatinosa הסובסטנציה (SG, הנדן השנייה של ' קרן ' בעמוד השדרה הגבי) היא מרכז חשוב עוררין ממסר עבור משדר וויסות מידע חושי. הוא מורכב interneurons סינאפסות, אשר מקבלים תשומות הסיבים מביא העיקרי, interneurons מקומיים, מעכבות מערכת יורד1אנדוגני. במהלך העשורים האחרונים, הפיתוח של חוט השדרה חריפה פרוסה הכנה, כניסתו של תאים כל תיקון-קלאמפ הקלטה אפשרו מחקרים שונים המאפיינים אלקטרופיזיולוגיות ו מורפולוגי פנימי של ס ג נוירונים2, 3 , 4 , כמו גם מחקרים של המעגלים המקומיות ב ס ג5,6. בנוסף, באמצעות במבחנה חוט השדרה פרוסה ההכנה, חוקרים יכולים לפרש את השינויים ב-7,excitabilities עצביים8, הפונקציה של יון ערוצי9,10, ו פעילות סינפטית11,12 בתנאים פתולוגיים שונים. מחקרים אלה יש העמיקה הבנתנו התפקיד כי ס ג נוירונים לשחק בפיתוח ותחזוקה של נוירופתי בגירוד וכאב כרוני.
במהותה, היא תנאי מוקדם מפתח כדי להשיג פריט חזותי ברור של סומא עצביים, אידיאלי תאים כל תיקון חוט השדרה חריפה בפרוסות כדי להבטיח את איכות מעולה של פרוסות אז ניתן להשיג את הנוירונים patchable ובריאה. עם זאת, הכנת חוט השדרה פרוסות כרוך במספר שלבים, כגון ביצוע laminectomy הגחוני של הסרת קרום pia-בחופשיות, אשר עשוי להיות מכשולים בהשגת פרוסות בריא. למרות שלא קל להכין פרוסות חוט השדרה, ביצוע הקלטות במבחנה על חוט השדרה פרוסות יש מספר יתרונות. לעומת ההכנות התרבות תאים, חוט השדרה פרוסות יכול חלקית לשמר קשרים סינפטיים הגלום שנמצאים במצב רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. בנוסף, תיקון שלם-תא-הקלטה באמצעות חוט השדרה פרוסות קלאמפ יכול להיות בשילוב עם טכניקות אחרות, כגון תיקון כפול קלאמפ13,14,15,מחקרים מורפולוגי16 תא בודד RT-PCR 17. לכן, טכניקה זו מספקת מידע נוסף על אפיון את הבדלים אנטומיים, גנטיים בתוך אזור מסוים, מאפשר חקירה של ההרכב של המעגלים המקומיות.
כאן, אנו מספקים תיאור בסיסי ומפורט של השיטה שלנו עבור הכנת חריפה השדרה פרוסות ורכישת תאים כל תיקון-קלאמפ הקלטות מ ג נוירונים.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td>משמש להכנת ACSF ו-PBS</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>60130</td><td>משמש להכנת תמיסה תוך-תאית מבוססת ACSF, סוכרוז-ACSF ו-K+ NaH</td></tr><tr><td>2PO4&middot; 2H2O</td><td>Sigma</td><td>71500</td><td>משמש להכנת ACSF, סוכרוז-ACSF ו-PBS</td></tr><tr><td>CaCl2&middot; 2H2O</td><td>Sigma</td><td>C5080</td><td>משמש להכנת ACSF וסוכרוז-ACSF</td></tr><tr><td>MgCl2&middot; 6H2O</td><td>Sigma</td><td>M2670</td><td>משמש להכנת ACSF וסוכרוז-ACSF</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>משמש להכנת ACSF וסוכרוז-ACSF</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td>משמש להכנת</td></tr><tr><td>חומצה אסקורבית</td><td>ACSF Sigma</td><td>P5280</td><td>משמש להכנת ACSF וסוכרוז-ACSF</td></tr><tr><td>נתרן פירובט</td><td>סיגמא</td><td>A7631</td><td>משמש להכנת ACSF וסוכרוז-ACSF</td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>Sigma</td><td>S7903</td><td>משמש להכנת סוכרוז-ACSF</td></tr><tr><td>K-גלוקונאט</td><td>Wako</td><td>169-11835</td><td>משמש להכנת תמיסה תוך-תאית מבוססת K+</td></tr><tr><td>Na2-Phosphocreatine</td><td>Sigma</td><td>P1937</td><td>משמש להכנת תמיסה תוך-תאית</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td>משמש להכנת תמיסה תוך-תאית</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td>משמש להכנת תמיסה תוך-תאית</td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>Sigma</td><td>A9187</td><td>משמש להכנת תמיסה תוך-תאית</td></tr><tr><td>Li-GTP</td><td>Sigma</td><td>G5884</td><td>משמש להכנת תמיסה תוך-תאית</td></tr><tr><td>CsMeSO4</td><td>Sigma</td><td>C1426</td><td>משמש להכנת תמיסה תוך-תאית מבוססת Cs+</td></tr><tr><td>CsCl</td><td>Sigma</td><td>C3011</td><td>משמש להכנת תמיסה תוך-תאית מבוססת Cs+</td></tr><tr><td>TEA-Cl</td><td>Sigma</td><td>T2265</td><td>משמש להכנת תמיסה תוך-תאית מבוססת Cs+ תמיסה</td></tr><tr><td>נוירוביוטין 488</td><td>וקטור</td><td>SP-1145</td><td>0.05% נוירוביוטין 488 יכול לשמש למחקרים מורפולוגיים</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma</td><td>A7002</td><td>3% בלוק אגר שימש בפרוטוקול שלנו</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>4% paraformaldehyde שימש לעיבוד אימונוהיסטוכימי</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Hengxing Chemical ריאגנטים</td><td></td><td>המשמשים להכנת PBS</td></tr><tr><td>Mount Coverslipping Medium</td><td>Polyscience</td><td>18606</td><td></td></tr><tr><td>Urethan</td><td>National Institute for Food and Drug</td><td>Control 30191228</td><td>1.5 גרם/ק"ג, i.p.</td></tr><tr><td>נימי זכוכית בורוסיליקט</td> World <td>Precision Instruments</td><td>TW150F-4</td><td>1.5 מ"מ OD, 1.12 מ"מ</td></tr><tr><td>ID חולץ מיקרופיפטה</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td>משמש להכנת מיקרופיפטות</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000S</td><td></td></tr><tr><td>שולחן בידוד רעידות</td><td>תאגיד ייצור טכני</td><td>63544</td><td></td></tr><tr><td>מצלמת</td> <td>CCD אינפרא אדוםDage-MIT</td><td>IR-1000</td><td></td></tr><tr><td>מגבר מהדק תיקון</td><td>HEKA</td><td>EPC-10</td><td></td></tr><tr>מכשיר <td>סאטר</td><td>מיקרומניפולטור</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>שלב XY</td><td>Burleigh</td><td>GIBRALTAR XY</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ זקוף</td><td>אולימפוס</td><td>BX51WI</td><td></td></tr><tr><td>אוסמומטר</td><td>מתקדם</td><td>FISKE 210</td><td></td></tr><tr><td>PH</td><td>מטר מטלר טולדו</td><td>FE20</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקול</td><td>Zeiss</td><td>LSM 700</td><td></td></tr></tbody></table>

הכנה של חוט השדרה חריפה פרוסות תאים כל תיקון-קלאמפ הקלטה בנוירונים הסובסטנציה gelatinosa

Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons

מחקרים שנעשו לאחרונה תאים כל תיקון-קלאמפ של נוירונים הסובסטנציה gelatinosa (SG) סיפקו גוף גדול של מידע אודות המנגנונים בעמוד השדרה שידור חושית, תקנה nociceptive ופיתוח כרוני כאב או גירוד. מימושים של הקלטות אלקטרופיזיולוגיות יחד עם לימודי מורפולוגי המבוסס על השירות של חוט השדרה חריפה פרוסות השתפרו עוד יותר את ההבנה שלנו של מאפייני עצביים, ההרכב של המעגלים המקומיות ב ס ג. כאן, אנו מציגים מדריך מפורט ומעשי עבור הכנת חוט השדרה פרוסות הצג נציג כל-תא ולהקליט תוצאות מורפולוגי. פרוטוקול זה מאפשר שימור עצביים אידיאלי, ניתן לחקות תנאים ויוו במידה מסוימת. לסיכום, היכולת לקבל הכנה של במבחנה של חוט השדרה פרוסות מאפשרת יציבה זרם, מתח-להדק הקלטות, ובכך יכול להקל על נתונים היסטוריים חקירות המאפיינים קרום פנימי, המעגלים המקומיות, מבנה עצביים באמצעות גישות מגוונות.

חוט השדרה חריפה פרוסות הוכנו על פי התרשים המוצג באיור1. לאחר חיתוך שחזור, פרוסה חוט השדרה הועברה לחדר ההקלטה. נוירונים בריא אותרו על סמך מראה חיצוני סומא באמצעות מיקרוסקופ IR-DIC. הבא, פוטנציאל פעולה של ס ג נוירונים היינו שהפיק סדרה של depolarizing פולסים הנוכחי (משך s 1) כאשר נוירונים התקיימו RMP. כפי שמוצג באיור 2, ירי הדפוסים שנצפו בס ג נוירונים הכלולים טוניק-ירי, נדחתה ירי, gap-ירי, הראשונית-פרץ, phasic מתפרצת, יחיד-ספייק, בע...

כאן, אנו מתארים את השלבים החיוניים להקלטות תאים כל תיקון-קלאמפ זני הסובסטנציה gelatinosa (SG) נוירונים בתוך הפרוסה חוט שדרה במבחנה . שיטה זו מאפשרת את מאפייני קרום פנימי, הסינאפסית ואפיון מורפולוגי של ס ג נוירונים שילמדו.

הכנה של חוט השדרה חריפה פרוסות תאים כל תיקון-קלאמפ הקלטה בנוירונים הסובסטנציה Gelatinosa

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms ...

שיטה זו יכולה לעזור להבהיר את מנגנוני עמוד השדרה שבבסיס שידור חושי, ויסות nociceptive וכאב כרוני או התפתחות כאב היתרון העיקרי של טכניקה זו היא שזה יכול לאפשר שימור עצבי אידיאלי והוא יכול לחקות תנאים in-vivo במידה מסוימת. התחל על ידי משיכת אלקטרודות הקלטה ממיקרו-capillaries זכוכית borosilicate באמצעות מושך נימי. לאחר מכן, למלא תבנית עם אגר מותך להכין 1.2 ס"מ על ידי 1.5 ס"מ על ידי 2.0 ס"מ אגר בלוק.חתוך את הבלוק לערוץ מרכזי אם אתה מתכנן מקטעים רוחביים. או בשר ערוץ עם קצה הבלוק עבור חלקים parasagittal. לפני שפע transcardial ומיצוי חוט השדרה, להכין 500 מיליליטר של סוכרוז מבוסס ACSF.קירור הפתרון לקור כקרח ומצייד ב-95%O2 וב-5%CO2. מקררים את כל כלי הניתוח על הקרח. הפוך חתך אורך חמישה סנטימטרים על העור האחורי מן caudal כדי rostral.לאחר מכן, לחתוך דרך כלוב הצלעות בין עמוד השדרה והצלעות משני הצדדים. השתמש במספריים כדי לחתוך בקצה caudal של עמוד השדרה. ואז לחתוך את הרקמות שמסביב במהירות לבודד את קטע lumbosacral של עמוד השדרה.מעבירים את קטע הלומבוסקרל לצלחת זכוכית המכילה סוכרוז קר כקרח מבוסס ACSF. כאשר הצד הגחון כלפי מעלה, השתמש במספריים עדין כדי לחתוך את פדיקל החוליות באופן דו-צדדי ולחשוף את חוט השדרה בזהירות. לבודד קטע באורך שני סנטימטרים של חוט השדרה עם הגדלת lumbosacral ולהעביר את קטע עמוד השדרה לתוך צלחת זכוכית אחרת מלא סוכרוז קר ACSF.עבודה תחת מיקרוסקופ ניתוח כדי להסיר את קרום הלחם ואת קרום פיא ארכנואיד. חותכים את כל השורשים הגחוני והדורסי מהר ככל האפשר. יש להיזהר מפגיעה בחוט השדרה, במיוחד בקרן הגבית בעת הסרת קרום המוח ושורשי עמוד השדרה.מניחים את חוט השדרה על גוש אגר שבעבר נחתך. כדי להכין פרוסות רוחביות, חבר את הצד הגחוני של חוט השדרה לאגר עם הצד הגבי לכיוון הלהב. להכנת פרוסות parasagittal, לחבר את הצד הגחון עם דבק סופר אגר בכיוון אנכי.לאחר מכן, הר את גוש אגר לפלטפורמה של רטט עם דבק-על. והכן 300 עד 500 מיקרון פרוסות רוחביות או parasagittal עם מהירות מתקדמת של 0.025 מילימטרים לשנייה ותדר רטט של 80 הרץ. חוט השדרה צריך להיות פרוס דורסו-ventrally.לקבלת התוצאות הטובות ביותר, יש להכין את הפרוסה תוך 15 עד 20 דקות. עובי פרוסת עמוד השדרה צריך להיות לא יותר מ 600 מיקרון כדי לספק את הראות של התא. השתמש פיפטה קצוצה פלסטיק להעביר את הפרוסות על רשת ניילון בתא אחסון המכיל ACSF מחומצן ברציפות ב 32 מעלות צלזיוס.כדי לנהל הקלטות מהדק טלאי שלם מתאי ג'לטינוסה או SG, השתמש בפתרונות תאיים מבוססי אשלגן יון להקלטה תוך החלת פתרון מבוסס צסיום רק להקלטה של זרמים פוסט סינפטיים מעכבים. מעבירים בעדינות את פרוסת חוט השדרה לתא ההקלטה. ואז לייצב אותו בחוזקה עם חוט פלטינה בצורת U עם חוטי ניילון ליציבות פרוסה אופטימלית.יש לנפח בהתמדה את הפרוסה עם ACSF מבעבע בטמפרטורת החדר ולהגדיר את קצב ההתנפחות על שניים עד ארבעה מיליליטר לדקה כדי להשיג חמצון מספיק. לאחר מכן, באמצעות עדשת מיקרוסקופ ברזולוציה נמוכה, לזהות את האזור של נוירונים SG כמו רצועה שקופה. בחר נוירון בריא, המאופיין בצורה תלת מימדית עם קרום בהיר וחלק כתא היעד באמצעות המטרה ברזולוציה גבוהה ולהתאים אותו למרכז מסך צג הווידאו.מלאו פיפסה זעירה בנפח מתאים של תווי יון אשלגן או פתרון תאי המבוסס על יון צסיום. לאחר מכן הכנס את המיקרו-פיפטה למחזיק האלקטרודה וודא שהתסופה תאית יוצרת קשר עם חוט הכסף בתוך המחזיק. הכניסו את המיקרו פיפטה לפוקוס ולהשתמש במיקרומניפולטור כדי לטבול אותו ב-ACSF.החל לחץ חיובי קל כדי לכפות משם כל לכלוך ופסולת. הזז בהדרגה את המיקרו פיפטה לכיוון הנוירון הממוקד. ברגע שהפיפטה מתקרבת לנוירון וגומה קטנה מאוד נוצרת על הממברנה העצבית, שחררו את הלחץ החיובי כדי ליצור ג'יגה-זל.לשנות את פוטנציאל ההחזקה למינוס 70 מילי-וולט, וזה קרוב לפוטנציאל הממברנה הפיזיולוגי של תא. לאחר מכן, יש למרוח יניקה נדונה ועדינה על המיקרו פיפטה כדי לקרוע את הממברנה וליצור תצורה טובה של תא שלם. שיא תכונות ירי על ידי בדיקת דפוס הירי של כל נוירון מהדק הנוכחי עם סדרה של שנייה אחת depolarizing פולסים הנוכחי של 25 כדי 150 picoamps עם 25 מרווחים picoamp במנוחה פוטנציאל קרום.כדי להקליט זרמי תת-אחיזה סומטיים, החזק את פוטנציאל הממברנה במינוס 50 מילי-וולט במצב מהדק מתח ולאחר מכן החל סדרה של פולסים מתח היפרפולאריזציה של משך שניה אחת ממינוס 60 מילי-וולט למינוס 120 מילי-וולט עם הפחתה של 10 מילי-וולט. הקלט זרמים סינפטיים סינציוניים עם פתרון תאי מבוסס יון אשלגן במצב מהדק מתח בפוטנציאל החזקה של מינוס 70 מילי-וולט. הקלט IPSC של באמצעות פתרון תאי מבוסס יון צסיום לרישום IPSC של.לאחר החזקת פוטנציאל הממברנה במינוס 70 מילי-וולט למשך כחמש דקות, לשנות בהדרגה את פוטנציאל ההחזקה לאפס מילי-וולט. המתן מספר דקות לייצוב ולאחר מכן התחל לתעד את אירועי IPSC. דפוסי ירי שנקבעו על ידי הזרקת סדרה של שנייה אחת depolarizing פולסים הנוכחי לתוך נוירון SG במנוחה פוטנציאל קרום עשוי להיות מסווג כמו ירי טוניק, עיכוב ירי, פער ירי, פרץ ראשוני, phasic-מתפרץ, חד ספייק וירי מסרב.תמונה זו מציגה את פרוטוקול מעורר עבור זרמי subthreshold במהדק מתח. עקבות מייצגים אלה מראים את התגובה להזרקה זרם היפרפולאריזציה מסווג IH, IA ו- IT. זהו זכר מייצג של SEPSC של נרשם נוירונים SG במינוס 70 millivolts בהיעדר נוכחות של 50 micromolar APV ו 20 מיקרומולר CNQX. מעקב זה מציג את SEPC של נרשם לפני התוספת של APV ו CNQX על ציר זמן מורחב.בעקבות הליך זה הן השיטות כמו הקלטות מהדק תיקון מזווג או אופטוגנטיקה ניתן לבצע כדי לענות על שאלות נוספות כמו אפיון microcircuits עצבי ספציפי בסובסטנציה ג'לטינוסה.

preparation-acute-spinal-cord-slices-for-whole-cell-patch-clamp

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

סרטון זה מדגים טכניקה להקלטת מהדק טלאי מפני השטח של הממברנה הדנדריטית. זה עוזר לבחון ישירות את התכונות החשמליות של דנדריטים ותעלות יונים מגודרות מתח בסיסיות בנוירונים דופמינרגיים.

הקלטות מהדק טלאי מהדנדריט של נוירון דופמינרגי בפרוסת מוח

סרטון זה מדגים את ההליך לביצוע רישומים אלקטרופיזיולוגיים בתאי עצב מסוג substantia gelatinosa (SG) של פרוסות חוט השדרה, תוך שימוש בטכניקות של מהדק טלאי של תאים שלמים כדי לנתח דפוסי ירי של נוירונים. שיטה זו מאפשרת לחקור תגובות עצביות לגירויים בנוירוני SG של חוט השדרה.

רישום מהדק טלאי של תא שלם בנוירון ג'לטינוזה מהותי של פרוסת חוט השדרה

הקלטת זרמי Ca2+ בקרום הפנים של השחרור הפרה-סינפטי היא המפתח להבנה מדויקת של כניסת Ca2+ ושחרור נוירוטרנסמיטרים. אנו מציגים דיסוציאציה חריפה של חוט השדרה הצמד המניב אקסונים רשתית מבודדים פונקציונליים, המאפשרים הקלטה ישירות מקרום הפנים המשוחרר של מסופים פרה-סינפטיים בודדים.

החריפה דיסוציאציה של האקסונים Reticulospinal צמד ים כדי לאפשר הקלטה משחרור הפנים ממברנה של מסופי Presynaptic פונקציונליים פרט

הקלטות מהדק טלאי ומילוי ביוציטין תוך-תאי בו זמנית של נוירונים מצומדים סינפטית בפרוסות מוח חריפות מאפשרים ניתוח מתואם של תכונותיהם המבניות והתפקודיות. מטרת פרוטוקול זה היא לתאר את השלבים הטכניים החיוניים של רישום אלקטרופיזיולוגי ממיקרו-מעגלים עצביים והניתוח המורפולוגי שלהם לאחר מכן.

אלקטרו ומורפולוגי אפיון של שבבים עצביים במוח חריף Slices שימוש מותאם Patch-קלאמפ הקלטות

כאן, מוצג הליך להפעלה סלקטיבית של חלבון עצבי עם פולס קצר של אור על ידי קידוד גנטי של חומצת אמינו לא טבעית תגובתית-אור לחלבון עצבי מטרה המתבטא בתאי עצב בתרבית או in vivo.

שליטה אופטית של חלבון עצבי באמצעות חומצות אמינו לא טבעי מקודדים גנטיים בנוירונים

פרוטוקול זה מדגים יישום אופטימיזציה N-מתיל-D-glucamine (NMDG) שיטת שחזור מגן המוח פרוסה ההכנה. ניסוח מדיה בודד משמש להשיג באופן אמין פרוסות המוח בריא של בעלי חיים בכל גיל, וגם עבור יישומים שונים ומגוונים ניסיוני.

הכנת פרוסות המוח חריפה באמצעות אופטימיזציה N-מתיל-D-שיטת שחזור מגן glucamine

פרוטוקול זה מתאר צעדים פרוצדורליים בסיסיים לביצוע הקלטות תיקון- clamp כל תא. טכניקה זו מאפשרת חקר ההתנהגות החשמלית של נוירונים, וכאשר ביצע פרוסות המוח, מאפשר הערכה של פונקציות עצביים שונים מתא עצב שעדיין משולבים מעגלים במוח השתמרות טוב יחסית.

הקלטות תיקון מהדק כל תא פרוסות המוח

אנחנו מראים איך להכין פרוסות אלכסוניות של חוט השדרה בעכברים צעירים. הכנה זו מאפשרת גירוי של שורשי הגחון.

הכנת פרוסות קורד אלכסון שדרה עבור גחון רוט גירוי

הקלטות מהדק טלאי תת-תאיות מציעות את האפשרות לחקור את התכונות הפונקציונליות של דנדריטים. עם זאת, מבנים עדינים אלה אינם נגישים בקלות בשל קוטרם הקטן. הפרוטוקול המתואר כאן נועד להקל על איסוף הקלטות יציבות ואמינות מהדנדריטים של נוירוני דופמין בפרוסות במבחנה.

הקלטות תיקון מהדק subcellular מן האחוזה Somatodendritic של נוירונים Nigral דופמין

אנו מציגים פרוטוקול להכנת פרוסות חריפות מההיפוקמפוס הגבי-ביניים של עכברים. אנו משווים הכנה רוחבית זו עם חתך קורנל במונחים של איכות הקלטות ושמירה על תכונות מורפולוגיות של נוירונים מוקלטים.

הכנת פרוסות חריפות מהיפוקמפוס הגבי להקלטה של תא שלם ושחזור עצבי בGyrus דנטאטה של עכברים בוגרים

פרוטוקול זה מתאר שיטה המשתמשת במהדק טלאי כדי לחקור את התגובות החשמליות של נוירונים מוטוריים לגירוי חוט השדרה (SCS) ברזולוציה מרחבית-זמנית גבוהה, אשר יכולה לסייע לחוקרים לשפר את כישוריהם בהפרדת חוט השדרה ובשמירה על קיום התא בו זמנית.

הכנת Ex vivo של פרוסת חוט השדרה להקלטת מהדק טלאי של כל התא בנוירונים מוטוריים במהלך גירוי חוט השדרה

למדו את שיטת ה-patch-clamp בתאים שלמים לרישום נוירונים מ-substantia gelatinosa בפרוסות חוט שדרה in vitro. שיטה זו מאפשרת חקר תכונות ממברנה, העברה סינפטית ומנגנוני כאב כרוני.

הכנה של חוט השדרה חריפה פרוסות תאים כל תיקון-קלאמפ הקלטה בנוירונים הסובסטנציה Gelatinosa

גלה סרטונים נוספים