Name: פולימראז כמותי המבוסס על תגובת שרשרת ניתוחים של מאתר Microbiota מעיים לאחר טיפול אנטיביוטי דרך הפה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-17T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: למדו שיטת PCR כמותי לניתוח שינויים במיקרוביוטה מעיים בעכברים לאחר טיפול אנטיביוטי דרך הפה. הפרוטוקול מאפשר מדידה מדויקת של DNA חיידקי 16S rDNA ומניעת אובדן משקל בבעלי החיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומן על ידי בריטניה המועצה למחקר רפואי (מענק מר ת/L008157/1); אר. ג'י נתמכה על ידי מארי קירי התמחות Intra-European (H2020-MSCA-אם-2015-703639); P.M.B. נתמכה על ידי studentship של המועצה למחקר רפואי בבריטניה ושותפות של המלך המכללה לונדון הדוקטורט הכשרה בתחום הביו-רפואי מדעי (מר/N013700/1).

הניסויים המתוארים כאן בוצעו באמצעות 6-8 שבועות עכברים (C57BL6/J) פראי-סוג הישן נשמר במתקן (SPF) חינם פתוגן מסוים. ניסויים בבעלי חיים כל אושרו על-ידי קולג '-לונדון המלך, את פרנסיס קריק המכון צער ואת גוף ביקורת אתית המשרד הממלכה המאוחדת. לפני תחילת כל שגרת חיים, ודא כי ההרשאות המתאימות מתקבלים באמצעות הארגון/המוסד מקומי.
1. ניהול של אנטיביוטיקה
הערה: בשתי שיטות חלופיות לטיפול אנטיביוטי מסופקים: אוראלי gavage (שלב 1.1) וניהול של אנטיביוטיקה באמצעות שתיית מים (שלב 1.2).
<ol><li>Gavage שבעל-פה<ol>
<li>הכנת המלאי של אנטיביוטיקה בודדים על ידי המסת אותם במים בלוק בריכוזים הבאים: אמפיצילין-100 מ"ג/מ"ל, גנטמיצין ב 100 מ"ג/מ"ל, Neomycin-100 מ"ג/מ"ל, מטרונידזול-10 מ"ג/מ"ל, ואנקומיצין ב 100 מ"ג/מ"ל. מסנן לחטא באמצעות מסנן 0.45 מיקרומטר. Aliquot וחנות ב-20 ° C.</li>
		<li>להכין קוקטייל של אנטיביוטיקה על ידי ערבוב את המניות המוכן מעל. עבור אמצעי אחסון של 1 מ"ל מערבבים 50 µL של אמפיצילין (5 מ"ג/מ"ל הסופי), µL 50 של גנטמיצין (5 מ"ג/מ"ל הסופי), 50 µL של Neomycin (5 מ"ג/מ"ל הסופי), µL 500 של מטרונידזול (5 מ"ג/מ"ל הסופי), µL 25 של ונקומיצין (2.5 מ"ג/מ"ל הסופי) ו- 325 µL של מים. להכין הטרייה קוקטייל לפני השימוש.</li>
		<li>לטעון את התמהיל לאנטיביוטיקה לתוך מזרק 1 מ"ל סטרילי ותקן של מחט gavage בקוטר המתאים (20 גרם במשך 15-20 g עכברים) תוך צמצום בועות.</li>
		<li>Gavage עכברים עם 200 µL של שילוב אנטיביוטיקה.<ol>
<li>. תפוס את העור מעל הכתף העכבר בחוזקה, למתוח את הראש והצוואר כדי לסדר את הוושט. כוונו את הכדור-קצה המחט האכלה לאורך הגג של הפה, לכיוון החלק האחורי של הלוע. . ואז, בעדינות. תעבירו לתוך הוושט, להזריק את הפתרון 200 μL.</li>
		</ol>
</li>
		<li>לנהל פעם קוקטייל אנטיביוטיקה כל יום משך זמן הניסוי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>אנטיביוטיקה במי השתייה התראה: לפקח בקפידה על משקל העכבר מדי יום במשך השבועיים הראשונים של הממשל לאנטיביוטיקה במי השתייה.<ol>
<li>להכין קוקטייל של אנטיביוטיקה על ידי המסת הבאות בקובץ 1 ליטר של מים בלוק: 1g של אמפיצילין (1 g/L הסופי), 1g של Neomycin (1 g/L הסופי), 1g של מטרונידזול (1 g/L הסופי), 0.5 גר' ונקומיצין (0.5 g/L הסופי) ו- 8 שקיות (0.75 גר' כל אחד) של מלאכותי ממתיק (60 g/L הסופי). לנער עד התפרקה. חנות ב 4 º C. הערה: ממתיק נוסף כדי להסתיר את הטעם של אנטיביוטיקה ולמנוע התייבשות עכברים. בעוד מספר ממתיק מותגים עשוי לעבוד, הריכוז הסופי הנדרש עשוי להיות שונה עבור כל מותג מסוים.</li>
		<li>למלא את הקוקטייל לאנטיביוטיקה לתוך בקבוק מים (~ 100 מ"ל/בקבוקים) ומניחים את הבקבוק על כלוב עכבר. הערה: השתמש חום בקבוקים או לכסות את הבקבוקים עם נייר כסף על אנטיביוטיקה מפני אור.</li>
		<li>החלף את הקוקטייל לאנטיביוטיקה מניות טריים פעמיים בשבוע למשך של הניסוי.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. איסוף דגימות צואה של צואה, תוכן מעי מעי קיר
<ol><li>שוקל, תווית 2 mL צינורות בלוק לאיסוף הדגימה.</li>
	<li>אוסף של דגימות צואה טרייה, למקם את העכבר כל restrainer ולאסוף כדורי צואה ישירות מפי-הטבעת בשפופרת איסוף. הערה: דוגמאות ניתן להשיג על ידי הצבת עכברים בתוך כלוב נקי בלוק, איסוף דגימות צואה עם מלקחיים סטיריליים נקי.</li>
	<li>המתת חסד העכברים עם CO2 חנק ואחריו נקע בצוואר הרחם.</li>
	<li>שכב לגוויה העכבר בבטן חשוף לגמרי, לרסס את אזור הבטן עם 70% אתנול.</li>
	<li>בעזרת מלקחיים סטיריליים ומספריים, עושים חתך רוחבי על הבטן כדי לחשוף את הצפק מבלי לפגוע בכל רקמות פנימיות. הרם את הצפק, בחתך לחשוף את המעיים.</li>
	<li>הסר את המעיים (מן המעי הגס לבטן) עם מלקחיים, מספריים ולמקם אותו בצלחת פטרי סטריליות.</li>
	<li>להשתמש בזהירות מלקחיים להתגרות המעי הדק (SI) העורקים מצע המעי העליון ו- fat. להרחיב את המעי ומניחים אותו על מחיקה מעבדה נקייה.</li>
	<li>עם סרגל, למדוד ולחתוך 4 ס מ של מעי דיסטלי של סי (החלק הקרוב ביותר אל המעי). חותכים וזורקים 1 ס מ של המעי מקורב אל המעי. יהיו חלק 3 ס מ של מעי עזב אשר ישמש כדי לאסוף חיידקים במעיים.</li>
	<li>החזק את חלק המעי העקום (3 ס מ) על צינור סטרילי 2 מ"ל. לאסוף את תוכן המעי על ידי הבלטת ממד ישירות על המעי ועל לאיסוף הדגימה בצינור. דוגמה זו יהיו חיידקים מהתוכן מעי.</li>
	<li>להכין מזרק 20 מ עם פוספט קרות באגירה סליין (הציבורי), להוריד את חלק המעי העקום (להשליך הזרימה דרך).</li>
	<li>מניחים את החלק העקום על מגבת נייר נקי ולפתוח אותה longitudinally עם מספריים.</li>
	<li>לגרד הפנימי של הקיר מעי עם אזמל.</li>
	<li>לאסוף את כל החיידקים על האזמל בכך שתרחץ את האזמל עם 1 מ"ל של PBS מעל שפופרת צנטרפוגה נקי. ספין-× 8000 g עבור 5 דקות כדי הצניפה החיידקים ולמחוק את תגובת שיקוע. דוגמה זו יכילו חיידקים מהקיר מעי. הערה: דגימות צואה צואה, תוכן מעי וקיר יכול להיות קפוא ומאוחסנים ב-80 מעלות צלזיוס עד השימוש.</li>
	<li>שוקל הצינורות המכילים את דגימות צואה ותוכן מעי, להפחית את המשקל משפופרות ריק (מתוך שלב 2.1) כדי להשיג את המשקל צואה בכל מדגם.</li>
	<li>תמצית ה-DNA חיידקי צואה, תוכן מעי, דגימות בקיר המעי העקום באמצעות ערכות זמינים מסחרית. לאחסן דגימות די אן איי ב-20 ° C עד השימוש.</li>
</ol>3. כימות של המעי Microbiota על ידי qPCR
הערה: הליך זה כולל את הדור של תקן (שלב 3.1) ואת השיטה עבור הגדרת qPCR עבור דגימות צואה רגילה (שלב 3.2)
<ol><li>הדור של תקן עבור qPCR<ol>
<li>השתמש תגובת שרשרת פולימראזית (PCR) כדי להגביר את הגן rRNA מטוסי אף-16 יצאו מן ה-DNA גנומי מופק תרבות חיידקי שימוש ריאגנטים13 ו- PCR התנאים המפורטים בטבלה1.</li>
		<li>להפעיל את המוצר PCR על 1.5% agarose ג'ל ולטהר את הלהקה הדנ א באמצעות ערכת חילוץ DNA זמינים מסחרית.</li>
		<li>מאתרים ומפסיקים את מטוהרים DNA פרגמנט באמצעות שיבוט קיט (ראה טבלה של חומרים, שימוש וקטור שמכיל סמנים עמידות לאנטיביוטיקה ופיוז'ן הגן β-galactosidase (LacZ) לבחירה המושבה כחול/לבן) ולהפוך המוסמכים DH10 E. coli ההוראות של היצרן. צלחת טרנספורמציה אל אמפיצילין (100 µg/mL), X-גל (20 µg/mL) לוריא Bertani (LB) אגר צלחות (10 גרם/ליטר טריפטון, 5 g/L תמצית שמרים, 10 גרם/ליטר NaCl, 15 גר'/ליטר אגר). דגירה לילה (O/N) ב 37 º C.</li>
		<li>בחר מושבה בודדת חיובית (לבן) הצלחת. לחסן אותה ב- 5 מ ל LB מרק המכיל 100 µg/mL אמפיצילין, דגירה O/N ב- 37 מעלות צלזיוס, רועדת-250 סל"ד.</li>
		<li>מן התרבות O/N, לבודד ולטהר את פלסמיד באמצעות ערכת miniprep מסחרי לפי הנחיות היצרן. הערה: חשוב על רצף של תותב פלסמיד בשלב זה, כדי להבטיח כי פלסמיד מכיל עותק אחד בלבד של הגן rRNA מטוסי אף-16 וכדי לקבוע את אורך בסיס-בזוגות (bp).</li>
		<li>Linearize את פלסמיד באנזים הגבלה שחותך את פלסמיד פעם אחת בלבד.</li>
		<li>לטהר את פלסמיד ליניארית באמצעות ערכת זמינים מסחרית.</li>
		<li>לקבוע את הריכוז של פלסמיד על ידי מדידת ספיגת ב-260 nm באמצעות ספקטרופוטומטרים.</li>
		<li>לחשב את מספר עותקים פלסמיד/µL מדגם באמצעות הנוסחה הבאה14: מספר העותקים = (כמות * × 10 6.02223) / (אורך * 1 × 109 * 650) איפה כמות ריכוז הדנ א שהושג בשלב 3.1.8 (ב ng/µL); אורך האורך הכולל של פלסמיד (עם הוספת) ב- bp. ניתן להשיג את מספר העותקים כמו עותקים/µL. הערה: ישנם כלים מקוונים המבוססת על הנוסחה לעיל, המאפשרים חישוב קל של מספר העותקים פלסמיד.</li>
		<li>Aliquot, חנות תקן כנדרש ב-20 ° C עד השימוש.</li>
	</ol>
</li>
	<li>qPCR הגדרת תקן, דגימות צואה<ol>
<li>להפשיר את qPCR רגיל (מתוך שלב 3.1.10), צואה דגימות דנ א (מתוך שלב 2.15) ואת qPCR ריאגנטים (מתוך ערכת זמינים מסחרית) על קרח. הערה: ריאגנטים qPCR השתמשו בדוגמה זו כוללים את תערובת התגובה SYBR Green qPCR תחל ואחורה (טבלה 2).</li>
		<li>לדלל את התקן במים סטרילי ללא ה-DNA בטווח של 107 ל 102 עותקים/µL (למשל, 1/5 טורי דילולים מ 107 ל 6.4 x 102 עותקים/µL). לדלל דגימת צואה DNA ל- 1/2, 1/5, 1/10.
</li>
		<li>לגרום לתגובה מיקס מאסטר עבור המספר הכולל של תגובות ועוד 1 (טבלה 2).</li>
		<li>לערבב 30 µL של האב ואת µL 5 של תבנית (תקן, מדגם או מים עבור פקד שלילי)</li>
		<li>להוסיף 10 µL של המיקס הזה מכל קידוח לתוך צלחת qPCR אופטי 384-. טוב. לבצע את התגובה לכל דולר.</li>
		<li>לסגור את המקום qPCR, צנטריפוגה בקצרה ולטעון את הצלחת על מכונת qPCR מתוכנת עם אופניים התנאים הבאים: 95 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות ואחריו 40 מחזורי 95 ° C עבור 15 s ו- 60 ° C עבור 1 דקות.</li>
		<li>להשיג ערכי CT עבור תקן ודוגמאות.</li>
		<li>ליצור עיקול רגיל ידי הערכים CT בסטנדרטים מול הלוגריתם של מספר עותק פלסמיד (כפי שמחושבת בשלב 3.1.9). לבצע רגרסיה לינאל של העקומה סטנדרטי.</li>
		<li>לחשב את מספרי עותק rDNA מטוסי אף-16 דגימות צואה על-ידי ויצירת שינוי הערכים CT (שהתקבלו בשלב 3.2.2) בעקומת סטנדרטי. הערה: מטוסי אף-16 rDNA עותק מספרי עבור כל דגימה אמור להיפתר בהתחשב הגורם דילול של המדגם (כמו להכין בשלב 3.2.2), חומצות גרעין נפח סופי זה היו eluted (בשלב 2.15) והכמות של דגימת צואה (שלב כמחושב 2.14) כדי להשיג ג'ין מעתיק לגרם של צואה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Belkaid, Y., Hand, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+microbiota+in+immunity+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Role of the microbiota in immunity and inflammation.</a> Cell. 157 (1), 121-141 (2014).</li>
<li>Hooper, L. V., Littman, D. R., Macpherson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+the+microbiota+and+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Interactions between the microbiota and the immune system.</a> Science. 336 (6086), 1268-1273 (2012).</li>
<li>Ubeda, C., Pamer, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotics%2C+microbiota%2C+and+immune+defense%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Antibiotics, microbiota, and immune defense.</a> Trends in Immunology. 33 (9), 459-466 (2012).</li>
<li>Dethlefsen, L., Huse, S., Sogin, M. L., Relman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pervasive+effects+of+an+antibiotic+on+the+human+gut+microbiota%2C+as+revealed+by+deep+16S+rRNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">The pervasive effects of an antibiotic on the human gut microbiota, as revealed by deep 16S rRNA sequencing.</a> PLoS Biology. 6 (11), e280(2008).</li>
<li>Reikvam, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+murine+intestinal+microbiota%3A+effects+on+gut+mucosa+and+epithelial+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Depletion of murine intestinal microbiota: effects on gut mucosa and epithelial gene expression.</a> PLoS One. 6 (3), e17996(2011).</li>
<li>Hill, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomic+analyses+reveal+antibiotic-induced+temporal+and+spatial+changes+in+intestinal+microbiota+with+associated+alterations+in+immune+cell+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Metagenomic analyses reveal antibiotic-induced temporal and spatial changes in intestinal microbiota with associated alterations in immune cell homeostasis.</a> Mucosal Immunology. 3 (2), 148-158 (2010).</li>
<li>Fraher, M. H., O'Toole, P. W., Quigley, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+used+to+characterize+the+gut+microbiota%3A+a+guide+for+the+clinician%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Techniques used to characterize the gut microbiota: a guide for the clinician.</a> Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 9 (6), 312-322 (2012).</li>
<li>Eckburg, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+the+human+intestinal+microbial+flora%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Diversity of the human intestinal microbial flora.</a> Science. 308 (5728), 1635-1638 (2005).</li>
<li>Sokol, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+counts+of+Fecalibacterium+prausnitzii+in+colitis+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammatiry+Bowel+Diseases%22%5BJournal%5D)">Low counts of Fecalibacterium prausnitzii in colitis microbiota.</a> Inflammatiry Bowel Diseases. 15 (8), 1183-1189 (2009).</li>
<li>Bartosch, S., Fite, A., Macfarlane, G. T., McMurdo, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+bacterial+communities+in+feces+from+healthy+elderly+volunteers+and+hospitalized+elderly+patients+by+using+real-time+PCR+and+effects+of+antibiotic+treatment+on+the+fecal+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Characterization of bacterial communities in feces from healthy elderly volunteers and hospitalized elderly patients by using real-time PCR and effects of antibiotic treatment on the fecal microbiota.</a> Applied Environmental Microbiology. 70 (6), 3575-3581 (2004).</li>
<li>Ubeda, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vancomycin-resistant+Enterococcus+domination+of+intestinal+microbiota+is+enabled+by+antibiotic+treatment+in+mice+and+precedes+bloodstream+invasion+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Vancomycin-resistant Enterococcus domination of intestinal microbiota is enabled by antibiotic treatment in mice and precedes bloodstream invasion in humans.</a> Journal of Clinical Investigation. 120 (12), 4332-4341 (2010).</li>
<li>Saez de Guinoa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD1d-mediated+lipid+presentation+by+CD11c%28%2B%29+cells+regulates+intestinal+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">CD1d-mediated lipid presentation by CD11c(+) cells regulates intestinal homeostasis.</a> EMBO Journal. 37 (5), (2018).</li>
<li>Kruglov, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonredundant+function+of+soluble+LTalpha3+produced+by+innate+lymphoid+cells+in+intestinal+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nonredundant function of soluble LTalpha3 produced by innate lymphoid cells in intestinal homeostasis.</a> Science. 342 (6163), 1243-1246 (2013).</li>
<li>Wilhelm, J., Pingoud, A., Hahn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+PCR-based+method+for+the+estimation+of+genome+sizes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Real-time PCR-based method for the estimation of genome sizes.</a> Nucleic Acids Research. 31 (10), e56(2003).</li>
<li>Kembel, S. W., Wu, M., Eisen, J. A., Green, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporating+16S+gene+copy+number+information+improves+estimates+of+microbial+diversity+and+abundance%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Incorporating 16S gene copy number information improves estimates of microbial diversity and abundance.</a> PLoS Computational Biology. 8 (10), e1002743(2012).</li>
<li>Yang, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+16S+rRNA+Gene-Targeted+Group-Specific+Primers+for+Real-Time+PCR+Analysis+of+Predominant+Bacteria+in+Mouse+Feces%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Use of 16S rRNA Gene-Targeted Group-Specific Primers for Real-Time PCR Analysis of Predominant Bacteria in Mouse Feces.</a> Applied Environmental Microbiology. 81 (19), 6749-6756 (2015).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

כאן אנו מספקים פרוטוקולים ניסיוני עבור ניהול אוראלי של אנטיביוטיקה עכברים, כימות של צואה חיידקים על ידי qPCR. השילוב של אנטיביוטיקה בשימוש זה מטרות הפרוטוקול (המכיל אמפיצילין, גנטמיצין, neomycin, מטרונידזול, ואנקומיצין) חיידקים גראם חיוביים והן גראם שליליים, המציע פעילות אחרים נגד ספקטרום מלא של חיידקים. Gavage שבעל-פה והן הממשל של אנטיביוטיקה במי השתייה להקטין במידה רבה בקטריאלי צואה לטעון5,6,12. יתר על כן, שני הטיפולים יש השפעה עמוקה פנוטיפ של העכברים כפי שהם מפתחים מספר מאפיינים טיפוסיים של עכברים מחיידקים, כולל גודל הטחול מופחתת של המעי האטום מוגדלת. הבחירה של שיטה מסוימת עבור ניהול אנטיביוטי אולי תלויה אורך הניסוי כמו שיטת gavage אוראלי דורש ניהול יומיומי של אנטיביוטיקה, להיות יותר לתקיפות, ולגרום לאי נוחות יותר בעלי חיים בטווח הארוך.
עבור המינהל של אנטיביוטיקה במי השתייה, התראה חייב להילקח עם התוספת של הממתיק לתערובת אנטיביוטי כפי זהו גורם חיוני כדי למנוע התייבשות עכברים. מספר קבוצות הראו איך הממשל של אנטיביוטיקה על שתיית מים (ללא תוספת של ממתיק) מוביל מהיר ועוצמתי במשקל עם עכברים כל לאבד יותר מ 20% ממשקל הגוף הראשונית בתוך הימים הראשונים של הניסוי5 , 6. הפרוטוקול שלנו השימוש ממתיק סכרין מבוססי שנראה מספיק כדי להסוות את הטעם אנטיביוטיים במים, עכברים במשקל בבימים הראשונים לאחר אנטיביוטיקה, אך התאוששה משקולות שלהם במהירות לאחר הזה ( איור 1). למרות זאת, בניסויים שלנו 5-10% של עכברים עדיין להגיע את מובילים האנושי של > 20% אובדן בסיסית למשקל הגוף ויש צורך לבצע המתה. גם בדקנו ממתיקים מבוססי סוכרלוז נכשל לחלוטין כדי למנוע התייבשות עכברים (100% של עכברים איבד > 20% ממשקל) בעוד מחברים אחרים פרסמו כשלים דומים ממתיקים מבוסס-ממתיק5,6. נוסף לזה, גיל, הרקע הגנטי ומצב בריאותו הכללית של העכברים המשמשים את הניסויים יש לשקול, כפי שהם עשויים להשפיע במשקל ורווחה בעלי חיים במהלך טיפול אנטיביוטי. לפיכך, פיקוח קפדני על עכברים משקל ומצב בריאותו הכללית צריכה להתבצע מדי יום במהלך השבועיים הראשונים של הממשל אנטיביוטיקה דרך הפה.
שיטות qPCR מספקים גישה מהירה וחסכונית של כימות של מטוסי אף-16 rRNA דגימות צואה. עם זאת, יש לקחת בחשבון כמה מגבלות לגבי טכניקה זו, וביניהם: אני) הדרישה תקן איכותי אמין; ii) עיצוב והיעילות של תחל qPCR; iii) העובדה מיקרואורגניזמים ייתכן שיש מספרים שונים עותק של הגן rRNA מטוסי אף-16, ובכך ג'ין עותקים ייתכן ישירות שווה תא סעיפים15. בכל זאת, qPCR היא שיטה חזקה ורגיש המאפשר ניתוח מהיר של דגימות צואה. שיטה זו יכולה להיות שימושית במיוחד לאימות במהירות את ההשפעה של טיפולים שונים (כולל אנטיביוטיקה) מאד חיידקי צואה מפורט כאן. יתר על כן, למרות אנו מספקים פרוטוקול על כימות של סה כ 16 rRNA, בשיטה זו ניתן להתאים בקלות (על ידי עיצוב ספציפי תחל16) כדי לאפשר זיהוי של הפרט taxa חיידקי, ובכך לספק הן כמותית, מידע איכותי אודות microbiome גודלו והרכבו.
לסיכום, סיפקנו שני פרוטוקולים לטיפול אנטיביוטי דרך הפה של עכברים, שיטה המבוססת על qPCR לכמת הנוצרות על-ידי אנטיביוטיקה לשינויים צואה חיידקים. אף על פי פרוטוקולים אלה יכול להיות עוד יותר ממוטב בשילוב עם גישות אחרות לפי הצרכים האישיים ניסיוני, שהם עשויים לשרת ככלים מהירה, חסכונית ואמינה לתמרן את microbiota מעיים מאתר וכדי ללמוד האפקטים של טיפול אנטיביוטי ב הומאוסטזיס מעיים ומחלות.

רירית מערכת העיכול יונקים מהווה סביבה ייחודית בידי תערובת מורכבת מאוד של המיקרואורגניזמים ליצור מערכת יחסים mutualistic עם המחשב המארח. ? מערכת ההגנה של רירית המעי כוללת שכבת האפיתל, שפע של תאים חיסוניים שמגבילות את commensals בתוך המעי תוך שמירה על מספר והמגוון שלהם. לעומת זאת, אורגניזמים commensal נדרשים להתפתחות של מערכת החיסון מתפקדת במלואה. בעוד אינטראקציות בין המארח לבין חיידקים commensal הם בדרך כלל מועיל, שזה ברור יותר ויותר ש-crosstalk המערכת החיסונית-microbiota הזה dysregulated יכול להעדיף התפתחות מחלות דלקתיות כרוניות, כגון המעי asinflammatory מחלה, דלקת מפרקים או אסטמה1,2.
ניתן לשנות את microbiota הבטן על ידי גורמים שונים, אבל אולי שינויים דרסטיים ביותר הם המושרה על ידי טיפול אנטיביוטי שמשנה קשות הן את גודל והרכב של קהילות חיידקי3,4. היתרונות של אנטיביוטיקה לטיפול בדלקות אמנם מוטלת בספק, השינויים microbiota הנגרם על ידי חשיפה לאנטיביוטיקה בבני אדם ניתן גם לשנות מערכות ההגנה החיסוניות אשר יכול להוביל השפעות מזיקות על הבריאות. למשל, טיפול אנטיביוטי בבני נקשר לסיכון מוגבר של Clostridium difficile-induced שלשולים, אסטמה, סוגים מסוימים של סרטן3. טיפול אנטיביוטי בעכברים recapitulates השפעה והשינויים לטווח ארוך נמצאו קהילות הבטן של חולים שטופלו אנטיביוטיקה, אפשרה החקירה של הקישורים מכניסטית בין שינויים בקהילות מיקרוביאלית ותפקוד תאי מערכת החיסון. עם זאת, מספר דיווחים הראו כי הניהול של אנטיביוטיקה על מי השתייה ad libitum מתבטא במשקל מורגש מאוד כמו עכברים מהפעלת שתיית מים, ככל הנראה עקב שלה טעם עבירה5,6. לפיכך, במודלים אלה התייבשות חמורה והמצוות למינהל אנטיביוטי אוראלי עשוי לסבך את הפרשנות של ניסויים במטרה לזהות את ההשפעה של טיפול אנטיביוטי בתפקוד תאי מערכת החיסון.
מספר גישות יכול לשמש כדי לחקור את גודלו והרכבו של יישובים מיקרוביאלית מעיים תא7. הדור הבא טכנולוגיות רצף סיפקו נתונים שלא יסולא בפז על העניין הזה8, עם זאת, שיטות אלה יקרים יחסית, דורשת ניתוח bioinformatic מומחה לפרשנויות של הנתונים. מצד שני, התרבות המסורתית מיקרוביולוגית, ומאפשרים זיהוי המינים חיידקי, אבל יש להם רגישות נמוכה, חלק גדול של חיידקים commensal (במיוחד anaerobes) הם מאוד קשה או בלתי אפשרי לטפח עם שיטות זמין כרגע8. טכניקות כמותיות פולימראז תגובת שרשרת (qPCR) נמצאים בשימוש יותר ויותר עבור כימות וזיהוי מינים חיידקי צואה, כפי שהם מספקים מדד שאינו תלוי-תרבות מהירה ואמינה של עומס מיקרוביאלי הכולל. בהתאם לכך, שיטות qPCR הוכיחו מועיל ללמוד לשינויים microbiota עם הגיל או עם התקדמות של מספר מחלות כולל9,של מחלות מעי דלקתיות10. בקו זה, שיטות qPCR מספקים גישה מהירה וחסכונית כדי לאמת את ההשפעה של טיפולים שונים (כולל אנטיביוטיקה) נטען חיידקי צואה, microbiota הרכב10,11,12.
כאן, אנחנו מציגים דין וחשבון מפורט שלב אחר שלב שני פרוטוקולים ברורים לניהול אנטיביוטי אוראלי עכברים, אוסף דגימת צואה, הפקת דנ א, הכנת תקנים, כימות של חיידקים דגימות צואה על-ידי qPCR. פרוטוקולים אלה מספקות שיטה אמינה לתמרן את microbiota מעיים בעכברים וכדי ללמוד ההשפעות של טיפול אנטיביוטי ב הומאוסטזיס מעיים ומחלות.

<table><tbody><tr><td>אמפיצילין, מלח נתרן</td>, <td>סיגמא-אולדריץ' (Merck)</td><td>A9518</td><td></td></tr>, <tr><td>ניאומיצין טריסולפט, מלח הידרט</td>, <td>סיגמא-אולדריץ' (Merck)</td><td>N1876</td><td></td></tr>, <tr><td>מטרונידזול</td><td>סיגמא-אולדריץ' (Merck)</td><td>M3761</td><td></td></tr>, <tr><td>ונקומיצין הידרוכלוריד</td>, <td>סיגמא-אולדריץ' (Merck)</td><td>V2002</td><td></td></tr>, <tr><td>מלח ג'נטמיצין סולפט, סיגמא-אולדריץ</td><td>' (Merck)</td><td>G3632</td><td></td></tr><tr><td>טריפטון</td><td>סיגמא-אולדריץ' (Merck)</td><td>T7293</td><td></td></tr><tr><td>תמצית שמרים</td><td>סיגמא-אולדריץ' (Merck)</td><td>Y1625</td><td></td></tr><tr><td>NaCL</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>ממתיק Sweet'n Low</td><td>Sweet'N Low</td><td></td><td>זמין בבריטניה מ-Amazon.co.uk</td></tr><tr><td>X-Gal (5-brom-4-chloro-3-indoyl B-D-galactopyranoside)</td> <td>פישר Scientific</td><td>10234923</td><td></td></tr><tr><td>פוספט חוצץ מלח&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure Agarose</td><td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td><td>16500500</td><td></td></tr><tr><td>מים בדרגת RT-PCR</td><td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td><td>AM9935</td><td></td></tr><tr><td>Phusion High Fidelity DNA Polymerase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0530</td><td></td></tr><tr><td>Deoxynucleotide (dNTP) תערובת תמיסות</td><td>ניו אינגלנד BioLabs</td><td>N0447</td><td></td></tr><tr><td>iTaq אוניברסלי SYBR ירוק Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1725124</td><td>עם שיבוט ROX</td></tr><tr><td>TOPO TA לריצוף</td><td>תרמו פישר מדעי (Invitrogen)</td> <td>450030</td><td></td></tr><tr><td>QIA מהיר DNA צואה מיני ערכה&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>51604</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep ספין ערכת Miniprep</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick gel&nbsp; ערכת מיצוי</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>מסנן מזרק 0.45 ומיקרו; m</td><td>Fisher scientific</td><td>10460031</td><td></td></tr><tr><td>Swann-MortonTM להבי אזמל סטריליים מפלדת פחמן</td> מזרק <td>11792724</td><td></td><td>מדעי פישר</td></tr><tr><td>(1 מ"ל)</td><td>מזרק BD Plastipak</td><td>303172</td><td></td></tr><tr><td>(20 מ"ל)</td><td>BD Plastipak</td><td>300613</td><td></td></tr><tr><td>1.5 מ"ל צינור מיקרוצנטריוג שקוף קריסטל</td><td>StarLab</td><td>E1415-1500</td><td></td></tr><tr><td>2 מ"ל גבוה במיוחד צינור מיקרוצנטריפוגה להתאוששות</td><td>StarLab</td><td>I1420-2600</td><td></td></tr><tr><td>מחטי מינון דרך הפה 20 גרם x 38 מ"מ מעוקל (pk/3)</td> <td>Vet-Tech</td><td>DE008A</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי סטרילין 50 מ"מ&nbsp;</td><td>אספקת מעבדה מדעית</td><td>PET2020</td><td></td></tr><tr><td>אטמי צלחת qPCR מוחלטים</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB1170</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmpTM צלחת אופטית 384 בארות&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific (Applied Biosystems)</td><td>4309849</td><td></td></tr><tr><td>ViiA7TM 7 מערכת PCR בזמן אמת עם בלוק 384 בארות</td><td>Thermo Fisher Scientific (Applied Biosystems)</td><td>4453536</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר (Nanodrop 1000)Thermo</td> <td>Fisher Scientific</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>Labnet Prism מיקרוצנטריפוגה</td><td>Labnet</td><td>C2500</td><td></td></tr><tr><td>MultiGene Optimax Thermal Cycler</td><td>לבנט</td><td>TC9610</td><td></td></tr></tbody></table>

פולימראז כמותי המבוסס על תגובת שרשרת ניתוחים של מאתר microbiota מעיים לאחר טיפול אנטיביוטי דרך הפה

Quantitative Polymerase Chain Reaction-based Analyses of Murine Intestinal Microbiota After Oral Antibiotic Treatment

Microbiota הבטן יש השפעה מרכזית על בריאות האדם. חיידקים dysbiosis קשורה immunopathologies נפוצות רבות כגון מחלות מעי דלקתיות, אסתמה ודלקת פרקים. לפיכך, הבנת המנגנונים שבבסיס crosstalk המערכת החיסונית microbiota היא בעלת חשיבות מכרעת. ניהול לאנטיביוטיקה, תוך סיוע סיווג הפתוגן, גורם גם שינויים דרסטיים גודלו והרכבו של קהילות חיידקי מעיים, אשר יכול להשפיע על בריאות האדם. טיפול אנטיביוטי בעכברים recapitulates את ההשפעה ושינויים לטווח ארוך microbiota האנושי מחולים שטופלו באנטיביוטיקה, מאפשר חקירה של הקישורים מכניסטית בין שינויים בקהילות מיקרוביאלית ותפקוד תאי מערכת החיסון. בעוד מספר שיטות טיפול אנטיביוטי של עכברים תוארו, חלק מהם לגרום התייבשות חמורה, במשקל שמסבך את הפרשנות של הנתונים. כאן, אנו מספקים שני פרוטוקולים עבור ניהול אנטיביוטי דרך הפה אשר יכול לשמש לטיפול לטווח ארוך של עכברים ללא גרימת אובדן משקל גדול. פרוטוקולים אלה להשתמש בשילוב של אנטיביוטיקה את המטרה גראם חיוביים והן גראם שליליים חיידקים, ניתן לספק גם ad libitum במי השתייה או על-ידי gavage דרך הפה. יתר על כן, אנו מתארים שיטה כימות של צפיפות מיקרוביאלי דגימות צואה על-ידי qPCR אשר יכול לשמש כדי לאמת את היעילות של טיפול אנטיביוטי. השילוב של גישות אלה מספק מתודולוגיה אמינה המניפולציה של microbiota מעיים המחקר של ההשפעות של טיפול אנטיביוטי בעכברים.

כאן אנו מספקים שני פרוטוקולים חלופי עבור טיפול אנטיביוטי דרך הפה של עכברים. איור 1 מציג את אחוז משקל הגוף (קשורים למשקל קו הבסיס המקורי עבור כל חיה) בעכברים מטופלים עם אנטיביוטיקה דרך הפה gavage (אדום) או במי השתייה (כחול) למשך 10 ימים רצופים. אין ירידה במשקל מורגש נמצא בעכברים מקבל אנטיביוטיקה מאת gavage דרך הפה. אולם, כאשר עכברים מטופלים עם אנטיביוטיקה ad libitum במי השתייה, הם לרזות (~ 10%) בתוך הימים הראשונים של הממשל לאנטיביוטיקה, אך לשחזר עלייה במשקל נורמלי לאחר מכן (איור 1). למרות זאת, בסביבות 5-10% של עכברים שקיבלו אנטיביוטיקה במי השתייה יכול להגיע &gt; 20% ירידה במשקל בתוך השבוע הראשון של הטיפול, ובמקרה הזה הם מורדמים.
כימות של חיידקים דגימות צואה מחייב שימוש מעגל סטנדרטי נאותה אשר מתקבל על ידי מתכנן את יומן הרישום של עותק מספר עבור התקן (כפי שמחושבת בשלב 3.2.2) לעומת הערכים CT המתקבל qPCR (שלב 3.2.7). איור 2A מראה דוגמה מייצגת של עיקול רגיל אשר עונה על הקריטריונים ביצועים עיקול רגיל עם ערך2 R של 0.99827, מדרון של-3.09 ויעילות ((-1 + 10^(-1/slope))*100) של 110%. ערכי R2 0.99 ו- PCR יעילות בטווח של 90-110% הם העדיפו. בתוך הטווח. ליניארית, ניתוח הרגרסיה מאפשר כימות של שפע rDNA מטוסי אף-16 בתוך דגימות צואה. איור 2B מציג את מספר העותקים rDNA מטוסי אף-16 צואה צואה, תוכן סי ו סי קיר. איור 2B נתונים מוצגים כמו מטוסי אף-16 rDNA עותקים/g דגימת צואה צואה צואה ו סי תוכן. עבור קיר סי, הנתונים מוצגים כמו המספר הכולל של מטוסי אף-16 rDNA עותקים המתקבל חיידקים התאוששה של 3 ס מ של SI קיר (כמו כמות החומר מתחיל קטן מדי כדי להשיג משקל מדויק).
כדי להעריך את ההשפעה של האנטיביוטיקה על הצפיפות של חיידקים דגימות צואה, עכברים טופלו באנטיביוטיקה מאת gavage אוראלי מדי יום למשך 10 ימים (ימים 1-10), נאספו דגימות צואה לפני (יום 0), בנקודות שונות בזמן-במהלך טיפול אנטיביוטי ( ימים 5 ו-10), ו- 7 ימים לאחר הפסקת אנטיביוטיקה המינהל (יום 17; איור 3A). כפי שמוצג באיור 3B, טיפול אנטיביוטי גורם לירידה חזקה מספר מטוסי אף-16 rDNA עותקים/g צואה זוהה ליד ימים 5 ו-10, הצפיפות של חיידקים צואה התאושש לרמות נורמליות (המקביל לטיפול מראש) 1 שבוע לאחר ניהול לאנטיביוטיקה הופסק (יום 17).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58481/58481fig1.jpg"> איור 1: הניהול של אנטיביוטיקה. העכברים קיבלו אנטיביוטיקה דרך הפה gavage (אדום) או במי השתייה (כחול) למשך 10 ימים רצופים. העלילה מציגה משקולות של עכברים לאורך משך הניסויים באופן יחסי המשקל המקורי לפני המינהל לאנטיביוטיקה (יום 0). הנתונים מוצגים זאת אומרת ± ב- SEM <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58481/58481fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58481/58481fig2.jpg"> איור 2: 16 rRNA ג'ין qPCR הגברה של תקנים, דגימות צואה. (א) רגרסיה ליניארית של עיקול רגיל עם עיקול רגיל מתארי. (B) החישוב של ג'ין abundances של דגימות צואה. הנתונים מוצגים זאת אומרת ± ב- SEM <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58481/58481fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58481/58481fig3.jpg"> איור 3: צואה חיידקים במהלך טיפול אנטיביוטי- מפרטים טכניים (A) של לוח הזמנים עבור ניהול אנטיביוטי אוראלי gavage (אלב), אוסף דגימה כמו שתוארו עם *. (B) 16 rDNA מעתיק לגרם של צואה של דגימות צואה של עכברים שייאסף הימים המצוין. הנתונים מוצגים זאת אומרת ± ב- SEM <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58481/58481fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>מגיב</td>
			<td>נפח</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>ה-DNA</td>
			<td>8 ΜL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>מאגר 10 X</td>
			<td>2 ΜL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>dNTPs (10 מ מ)</td>
			<td>0.4 ΜL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Eubacteria - F פריימר (10 מ מ)</td>
			<td>1 ΜL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Eubacteria - R פריימר (10 מ מ)</td>
			<td>1 ΜL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Taq Polimerase</td>
			<td>0.2 ΜL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
			<td>7.4 ΜL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>הנפח הכולל</td>
			<td>20 ΜL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>פריימר רצפים</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Eubacteria - F פריימר</td>
			<td>5' ACTCCTACGGGAGGCAGCAGT 3'</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Eubacteria - R פריימר</td>
			<td>5' ATTACCGCGGCTGCTGGC 3'</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>תנאי הרכיבה</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>טמפרטורה</td>
			<td>זמן</td>
			<td>מחזורים</td>
		</tr>
<tr>
<td>94 ° C</td>
			<td>5 דקות</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>94 ° C</td>
			<td>30 s</td>
			<td>10:</td>
		</tr>
<tr>
<td>60 ° C</td>
			<td>30 s</td>
			<td>10:</td>
		</tr>
<tr>
<td>72 ° C</td>
			<td>1 דקות</td>
			<td>10:</td>
		</tr>
<tr>
<td>72 ° C</td>
			<td>5 דקות</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 ° C</td>
			<td>∞</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: PCR ריאגנטים ותנאים. השולחן הזה מספק את ריאגנטים ואת תנאי הרכיבה PCR כדי להגביר את מטוסי אף-16 גנים rRNA מן התרבות חיידקי לדור של תקן לשימוש ב- מבחני qPCR. פריימר רצפים פורסמו במקור על ידי Kruglov. et al. 13.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>מגיב</td>
			<td>נפח</td>
		</tr>
<tr>
<td>מיקס מאסטר SYBR Green (2x)</td>
			<td>17.5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Eubacteria - F פריימר (10 מ מ)</td>
			<td>0.7 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Eubacteria - R פריימר (10 מ מ)</td>
			<td>0.7 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
			<td>11.1 ΜL</td>
		</tr>
</tbody></table>בטבלה 2: מיקס מאסטר qPCR. אמצעי האחסון המוצגת (נפח סופי 35 µL) הם דוגמה אחת לרוץ שהפקידים (10 µL כל אחד) על צלחת qPCR 384-טוב (לדעה נוספת לטעויות pipetting 5 µL). הסכום עשוי להיות יורה על פי מספר דוגמאות כדי להיות מנותח.

כאן אנו מספקים נתונים היסטוריים פרוטוקולים עבור המינהל אנטיביוטיקה דרך הפה עכברים, איסוף דגימות צואה, הפקת דנ א, כימות של צואה חיידקים על ידי qPCR.

פולימראז כמותי המבוסס על תגובת שרשרת ניתוחים של מאתר Microbiota מעיים לאחר טיפול אנטיביוטי דרך הפה

The gut microbiota has a central influence on human health. Microbial dysbiosis is associated with many common immunopathologies such as inflammatory ...

פרוטוקול זה מספק שיטה אמינה לכמת שינויים היא microbiota מעיים של עכברים בעקבות מתן אנטיביוטיקה דרך הפה. זה יכול לעזור מחקר על אינטראקציות microbiota לחצות מתן תובנה פתולוגיות הקשורות dysbiosis מיקרוביאלית כגון מחלות מעי דלקתיות. היתרון העיקרי של משטרים אלה טיפול אנטיביוטי הוא שהם מונעים את הירידה במשקל האופיינית הקשורים בדרך כלל עם מתן אנטיביוטיקה דרך הפה לעכברים.כדי ליצור מראש טיפול אנטיביוטי באמצעות gavage אוראלי להכין קוקטייל של אנטיביוטיקה על ידי ערבוב פתרונות מלאי כי כבר מוכן כמתואר בפרוטוקול טק. לקבלת נפח של מיליליטר לערבב 50 microliters של אמפיצילין, 50 microliters של גנטמיצין, 50 microliters של neomycin, 500 microliters של metronidazole, 25 microliters של vancomycin ו 325 microliters של מים. לטעון תערובת אנטיביוטית על מזרק מיליליטר אחד תוך ביטול כל בועות ולצרף מחט gavage gavage מתאים.תפוס את העור מעל כתף העכבר בחוזקה למתוח את הראש והצוואר כדי ליישר את הוושט. לכוון את קצה הכדור של מחט האכלה לאורך הגג של הפה לכיוון החלק האחורי של הלוע. ואז בעדינות להעביר אותו לתוך הוושט ולהזריק את 200 microliters של פתרון.יש לתת את הקוקטייל האנטיביוטי פעם ביום למשך הניסוי. לחלופין, כדי לתת אנטיביוטיקה דרך מי השתייה, להכין קוקטייל של אנטיביוטיקה כמתואר בפרוטוקול טק. חשוב לכלול ממתיק לתוך תערובת אנטיביוטית כמו זה גורם מכריע כדי למנוע התייבשות עכברים.ממלאים את הקוקטייל האנטיביוטי בבקבוק מים בכ-100 מיליליטר לבקבוק. הגן על הבקבוק מפני אור והצב בכלוב עכברים. החלף את הקוקטייל האנטיביוטי במלאי טרי פעמיים בשבוע למשך הניסוי.ניטור זהיר של משקל עכברים מצב בריאותי כללי צריך להיות preformed מדי יום לאורך ניהול אנטיביוטי. לשקול ולתייג שני צינורות autoclave מיליליטר לאיסוף מדגם. לאיסוף דגימות צואה טריות מניחים כל עכבר בריסון.ואז לאסוף כדורי צואה ישירות פי הטבעת בצינור איסוף. לאחר ביצוע המתת חסד כמתואר בפרוטוקול הטכני שכב פגר עכבר עם הבטן חשוף לחלוטין לרסס את אזור הבטן עם 70% אתנול. באמצעות מדפים מעוקרים ומספריים לעשות חתך רוחבי בבטן כדי לחשוף את peratenium מבלי לפגוע ברקמות פנימיות.הרם את peratenium ולעשות חתך לחשוף את המעיים. מוציאים את המעיים עם המדפים וה מספריים ומ מניחים אותו בצלחת פטרי סטרילית. בזהירות להשתמש בממטרים כדי להקניט את המעי הדק מן העורקים mesenteric ושומן.מרחיבים את המעי ומ מניחים אותו על מגבון מעבדה נקי. עם מידה סרגל לחתוך ארבעה סנטימטרים של ileum דיסטלי של המעי הדק. חותכים ומשליכים את סנטימטר אחד של המעי קרוב לפסק.יהיה חלק של שלושה סנטימטרים של ileum שמאל אשר ישמש לאיסוף חיידקי מעיים. החזק את החלק ileum מעל צינור סטרילי שני מיליליטר. לאסוף את התוכן במעיים על ידי הבלטה ישירה של המעי ואיסוף המדגם בצינור.מדגם זה יהיה חיידקים מן התוכן ileum. הכינו מזרק של 20 מיליליטר עם מלוחים קרים עם פוספט במאגר ושטפו את חלק האיליום המשליך את הזרימה. מניחים את מנת האיליום על צלחת פטרי סטרילית ופתיחתה לאורך עם מספריים.לגרד את החלק הפנימי של קיר ileum עם אזמל. לאסוף את כל החיידקים על האזמל על ידי שטיפת אותו עם מיליליטר אחד של PBS מעל צינור צנטריפוגה נקי. ספין בשמונה אלף פעמים G במשך חמש דקות כדי גלולה החיידקים.לאחר צנטריפוגה להשליך את העל-טבעי. דגימה זו תכיל חיידקים מקיר האילום. לשקול את הצינורות המכילים את הדגימות מן הצואה ileum.הפחת את המשקל מהצינורות הריקים כדי להשיג את משקל הצואה בכל מדגם. לחלץ DNA חיידקי מצואה, תוכן ileum, דגימות קיר ileum באמצעות ערכות מסחריות זמינות. אחסן את דגימות הדנ"א במינוס 20 מעלות צלזיוס עד לשימוש.להפשיר את תקן qPCR, דגימת צואה DNA ו qPCR reagents מתוך ערכה מסחרית זמינה על קרח. לדלל את התקן במים סטריליים DNA חינם בטווח של 10 עד 7 עד 10 לשני עותקים לכל microliter. לדלל את ה-DNA מדגם צואה לחצי אחד, חמישית ואחד עשירית ריכוזים.לאחר מכן בצע תגובת מיקס מאסטר למספר הכולל של התגובות ועוד אחת. מערבבים 30 מיקרוליטרים של התערובת הראשית ו-5 מיקרוליטרים של התבנית, שהיא תקן, מדגם או מים לבקרה השלילית. לאחר מכן להוסיף 10 microliters של תערובת זו לכל באר בצלחת qPCR אופטי 384 היטב.בצע כל תגובה ב- triplicate. לאטום את צלחת qPCR וצנטריפוגה בקצרה. לאחר מכן טען את הלוחית במחשב qPCR המתוכנת כמפורט בפרוטוקול הטכני.לבסוף להשיג את ערכי סף מחזור עבור תקן ודגימות לפני חישוב מספרי עותק rDNA 16S עבור דגימות צואה. תוצאות מייצגות מראות ירידה במשקל בעכברים לאחר מתן אנטיביוטיקה על ידי gavage אוראלי או דרך מי השתייה. לא מזוהה ירידה ניכרת במשקל בעכברים המקבלים אנטיביוטיקה על ידי gavage אוראלי.כאשר עכברים מטופלים עם אנטיביוטיקה במי השתייה הם מאבדים כ -10% ממשקל גופם בימים הראשונים של הטיפול אך לשחזר עלייה במשקל נורמלי לאחר מכן. כימות של חיידקים בדגימות צואה דורש שימוש בעקומה סטנדרטית המתקבלת על ידי התוויית לוגריתם של מספר עותק עבור התקן לעומת ערכי C-T המתקבלים ב- qPCR. בתוך הטווח הליניארי משוואת ניתוח הרגרסיה מאפשרת כימות של שפע rDNA 16S בתוך דגימות צואה.כפי שמוצג כאן עבור צואה, תוכן המעי הדק ודגימות קיר המעי הדק. לאחר חמישה או 10 ימים של מתן אנטיביוטיקה דרך הפה יש ירידה חזקה בצפיפות של חיידקים בדגימות צואה מעכברים שטופלו באנטיביוטיקה. עם זאת הצפיפות של חיידקים בצואה התאושש לרמות נורמליות שבוע לאחר הממשל האנטיביוטי נעצר.הן gavage אוראלי והן מתן של אנטיביוטיקה במי השתייה לזמן קצר להקטין את העומס חיידקי צואה בעכברים מטופלים. חוקרים הבוחרים את השיטה הבודדת שמתאימה יותר לדרישות הניסוי בהתחשב בגורמים כגון אורך הטיפול. ניתן לשנות את שיטת qPCR לכימות חיידקים כדי לכמת מסה חיידקית בודדת באמצעות פריימרים ספציפיים.זה יספק מידע כמותי וקאליטיבי על גודל המיקרוביום והרכבו.

quantitative-polymerase-chain-reaction-based-analyses-murine

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מקור: לו, ב. ס. ואחרים. זיהום כרוני בסלמונלה פיברוזיס במעי. J. Vis. Exp. (2019)הסרטון מדגים את כימות העומס החיידקי במודל עכבר של זיהום כרוני בסלמונלה טיפימוריום עמידה לסטרפטומיצין. לאחר המתת חסד וניתוח סטרילי, רקמות ציקלי וטחול נקצרות, הומוגניות עם חרוזי פלדה לשחרור חיידקים, ומדוללות באופן סדרתי. הדילול מצופה על אגר סלקטיבי, ומושבות נראות נספרות להערכת עומס חיידקי לגרם רקמה באתרים מעיים ומערכתיים.

כימות עומס חיידקי רקמה במודל עכבר של זיהום כרוני במעי

יעילות האנטיביוטיקה נקבעת לרוב על ידי ביצוע מחקרים קינטיים להרג ומדידת יחידות יוצרות מושבה (CFUs). על ידי שילוב מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) עם שיטות סטנדרטיות אלה, אנו יכולים להבחין בין ההשפעות הפרמקולוגיות של הטיפול בין אנטיביוטיקות שונות.

פרוטוקול לאפיין את השינויים המורפולוגיים של<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; בתגובה לטיפול אנטיביוטי

Bacteriocins הם האמינו לשחק תפקיד מפתח בהגדרת מגוון חיידקים נישות אקולוגיות שונות. כאן, אנו מתארים הליך יעיל כדי להעריך כיצד bacteriocins להשפיע על ההרכב microbiota המעיים במודל חיה.

שיטה להעריך אפקטים Bacteriocin על מיקרוביוטה המעיים של עכברים

כתב יד זה מתאר פרוטוקול מתוקננת מפורט של תפוקה גבוהה מטוסי אף-16 rRNA-אמפליקון רצף. הפרוטוקול מציג פרוטוקול משולב, לובשי מדים, ריאלי וזולה החל באיסוף הנתונים ניתוחים דגימת צואה. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח של מספר רב של דוגמאות עם סטנדרטים קפדניים מספר פקדים.

פרוטוקול מודרך לקבלת צואה אפיון חיידקים על ידי מטוסי אף-16 rRNA-אמפליקון רצף

העשרה סביבתית (EE) היא סביבת מגורים בעלי חיים המשמש כדי לחשוף את המנגנונים העומדים בבסיס את החיבורים בין אורח חיים, מתח, מחלה. פרוטוקול זה מתאר הליך שבאמצעותו משתמש במודל עכבר של המעי הגס tumorigenesis, EE במיוחד להגדיר שינויים microbiota המגוון הביולוגי עשוי להשפיע התמותה בעלי חיים.

שיטה כדי להגדיר את ההשפעות של העשרה סביבתית על המגוון הביולוגי Microbiome המעי הגס במודל של עכברים המעי הגס גידול

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור culturing microbiota את הבטן של המעי הגס במבחנה, באמצעות סדרה של ריאקטורים שמדמות את התנאים הפיזיולוגיים של דרכי עיכול.

מתקדמים במבחנה Culturing טכנולוגיה ללמוד את Microbiota בטן האדם

פרוטוקול זה מספק שיטת בידוד דנ"א פשוטה וחסכונית לניתוח שינויים במיקרוביוטה של מורין במעיים במהלך התפתחות מחלות אוטואימוניות.

ניתוח הדינמיקה של מיקרוביוטה בצואה בעכברים המועדים לזאבת באמצעות שיטת בידוד דנ"א פשוטה וחסכונית

כאן, אנו מתארים מתן תרופות מונחות מיקרופיפטה (MDA) כשיטה חלופית לאכילה אוראלית המתמרצת את חיית המחקר לבלוע טיפולים בקלות עם מינימום מתח ואי נוחות.

שימוש במתן תרופות מונחות מיקרופיפטה כשיטה חלופית לגבאג' אוראלי במודלים של מכרסמים

פרוטוקול זה מתאר את השלבים הנדרשים להתיישבות בעכברים עם pks+ Escherichia coli בתנאים לא דלקתיים, וכן שיטות לא פולשניות לאימות קולוניזציה והערכת התרחבות pks+ E. coli בצואה.

התיישבות עם עכברים pks+ Escherichia coli בתנאים לא דלקתיים

יש עניין גובר באפיון הכמותי של לימפוציטים במעי עקב ההכרה הגוברת בכך שתאים אלה ממלאים תפקיד קריטי במגוון מחלות מעיים ומערכתיות. בפרוטוקול זה, אנו מתארים כיצד לבודד אוכלוסיות תאים בודדים מתאי מעי דק שונים לאפיון ציטומטרי זרימה לאחר מכן.

אפיון בידוד תזרים Cytometric של Murine קטנים מעיים לימפוציטים

למדו שיטת PCR כמותי לניתוח שינויים במיקרוביוטה מעיים בעכברים לאחר טיפול אנטיביוטי דרך הפה. הפרוטוקול מאפשר מדידה מדויקת של DNA חיידקי 16S rDNA ומניעת אובדן משקל בבעלי החיים.

פולימראז כמותי המבוסס על תגובת שרשרת ניתוחים של מאתר Microbiota מעיים לאחר טיפול אנטיביוטי דרך הפה

גלה סרטונים נוספים