פולימראז כמותי המבוסס על תגובת שרשרת ניתוחים של מאתר Microbiota מעיים לאחר טיפול אנטיביוטי דרך הפה

פרוטוקול זה מספק שיטה אמינה לכמת שינויים היא microbiota מעיים של עכברים בעקבות מתן אנטיביוטיקה דרך הפה. זה יכול לעזור מחקר על אינטראקציות microbiota לחצות מתן תובנה פתולוגיות הקשורות dysbiosis מיקרוביאלית כגון מחלות מעי דלקתיות. היתרון העיקרי של משטרים אלה טיפול אנטיביוטי הוא שהם מונעים את הירידה במשקל האופיינית הקשורים בדרך כלל עם מתן אנטיביוטיקה דרך הפה לעכברים.

כדי ליצור מראש טיפול אנטיביוטי באמצעות gavage אוראלי להכין קוקטייל של אנטיביוטיקה על ידי ערבוב פתרונות מלאי כי כבר מוכן כמתואר בפרוטוקול טק. לקבלת נפח של מיליליטר לערבב 50 microliters של אמפיצילין, 50 microliters של גנטמיצין, 50 microliters של neomycin, 500 microliters של metronidazole, 25 microliters של vancomycin ו 325 microliters של מים. לטעון תערובת אנטיביוטית על מזרק מיליליטר אחד תוך ביטול כל בועות ולצרף מחט gavage gavage מתאים.

תפוס את העור מעל כתף העכבר בחוזקה למתוח את הראש והצוואר כדי ליישר את הוושט. לכוון את קצה הכדור של מחט האכלה לאורך הגג של הפה לכיוון החלק האחורי של הלוע. ואז בעדינות להעביר אותו לתוך הוושט ולהזריק את 200 microliters של פתרון.

יש לתת את הקוקטייל האנטיביוטי פעם ביום למשך הניסוי. לחלופין, כדי לתת אנטיביוטיקה דרך מי השתייה, להכין קוקטייל של אנטיביוטיקה כמתואר בפרוטוקול טק. חשוב לכלול ממתיק לתוך תערובת אנטיביוטית כמו זה גורם מכריע כדי למנוע התייבשות עכברים.

ממלאים את הקוקטייל האנטיביוטי בבקבוק מים בכ-100 מיליליטר לבקבוק. הגן על הבקבוק מפני אור והצב בכלוב עכברים. החלף את הקוקטייל האנטיביוטי במלאי טרי פעמיים בשבוע למשך הניסוי.

ניטור זהיר של משקל עכברים מצב בריאותי כללי צריך להיות preformed מדי יום לאורך ניהול אנטיביוטי. לשקול ולתייג שני צינורות autoclave מיליליטר לאיסוף מדגם. לאיסוף דגימות צואה טריות מניחים כל עכבר בריסון.

ואז לאסוף כדורי צואה ישירות פי הטבעת בצינור איסוף. לאחר ביצוע המתת חסד כמתואר בפרוטוקול הטכני שכב פגר עכבר עם הבטן חשוף לחלוטין לרסס את אזור הבטן עם 70% אתנול. באמצעות מדפים מעוקרים ומספריים לעשות חתך רוחבי בבטן כדי לחשוף את peratenium מבלי לפגוע ברקמות פנימיות.

הרם את peratenium ולעשות חתך לחשוף את המעיים. מוציאים את המעיים עם המדפים וה מספריים ומ מניחים אותו בצלחת פטרי סטרילית. בזהירות להשתמש בממטרים כדי להקניט את המעי הדק מן העורקים mesenteric ושומן.

מרחיבים את המעי ומ מניחים אותו על מגבון מעבדה נקי. עם מידה סרגל לחתוך ארבעה סנטימטרים של ileum דיסטלי של המעי הדק. חותכים ומשליכים את סנטימטר אחד של המעי קרוב לפסק.

יהיה חלק של שלושה סנטימטרים של ileum שמאל אשר ישמש לאיסוף חיידקי מעיים. החזק את החלק ileum מעל צינור סטרילי שני מיליליטר. לאסוף את התוכן במעיים על ידי הבלטה ישירה של המעי ואיסוף המדגם בצינור.

מדגם זה יהיה חיידקים מן התוכן ileum. הכינו מזרק של 20 מיליליטר עם מלוחים קרים עם פוספט במאגר ושטפו את חלק האיליום המשליך את הזרימה. מניחים את מנת האיליום על צלחת פטרי סטרילית ופתיחתה לאורך עם מספריים.

לגרד את החלק הפנימי של קיר ileum עם אזמל. לאסוף את כל החיידקים על האזמל על ידי שטיפת אותו עם מיליליטר אחד של PBS מעל צינור צנטריפוגה נקי. ספין בשמונה אלף פעמים G במשך חמש דקות כדי גלולה החיידקים.

לאחר צנטריפוגה להשליך את העל-טבעי. דגימה זו תכיל חיידקים מקיר האילום. לשקול את הצינורות המכילים את הדגימות מן הצואה ileum.

הפחת את המשקל מהצינורות הריקים כדי להשיג את משקל הצואה בכל מדגם. לחלץ DNA חיידקי מצואה, תוכן ileum, דגימות קיר ileum באמצעות ערכות מסחריות זמינות. אחסן את דגימות הדנ"א במינוס 20 מעלות צלזיוס עד לשימוש.

להפשיר את תקן qPCR, דגימת צואה DNA ו qPCR reagents מתוך ערכה מסחרית זמינה על קרח. לדלל את התקן במים סטריליים DNA חינם בטווח של 10 עד 7 עד 10 לשני עותקים לכל microliter. לדלל את ה-DNA מדגם צואה לחצי אחד, חמישית ואחד עשירית ריכוזים.

לאחר מכן בצע תגובת מיקס מאסטר למספר הכולל של התגובות ועוד אחת. מערבבים 30 מיקרוליטרים של התערובת הראשית ו-5 מיקרוליטרים של התבנית, שהיא תקן, מדגם או מים לבקרה השלילית. לאחר מכן להוסיף 10 microliters של תערובת זו לכל באר בצלחת qPCR אופטי 384 היטב.

בצע כל תגובה ב- triplicate. לאטום את צלחת qPCR וצנטריפוגה בקצרה. לאחר מכן טען את הלוחית במחשב qPCR המתוכנת כמפורט בפרוטוקול הטכני.

לבסוף להשיג את ערכי סף מחזור עבור תקן ודגימות לפני חישוב מספרי עותק rDNA 16S עבור דגימות צואה. תוצאות מייצגות מראות ירידה במשקל בעכברים לאחר מתן אנטיביוטיקה על ידי gavage אוראלי או דרך מי השתייה. לא מזוהה ירידה ניכרת במשקל בעכברים המקבלים אנטיביוטיקה על ידי gavage אוראלי.

כאשר עכברים מטופלים עם אנטיביוטיקה במי השתייה הם מאבדים כ -10% ממשקל גופם בימים הראשונים של הטיפול אך לשחזר עלייה במשקל נורמלי לאחר מכן. כימות של חיידקים בדגימות צואה דורש שימוש בעקומה סטנדרטית המתקבלת על ידי התוויית לוגריתם של מספר עותק עבור התקן לעומת ערכי C-T המתקבלים ב- qPCR. בתוך הטווח הליניארי משוואת ניתוח הרגרסיה מאפשרת כימות של שפע rDNA 16S בתוך דגימות צואה.

כפי שמוצג כאן עבור צואה, תוכן המעי הדק ודגימות קיר המעי הדק. לאחר חמישה או 10 ימים של מתן אנטיביוטיקה דרך הפה יש ירידה חזקה בצפיפות של חיידקים בדגימות צואה מעכברים שטופלו באנטיביוטיקה. עם זאת הצפיפות של חיידקים בצואה התאושש לרמות נורמליות שבוע לאחר הממשל האנטיביוטי נעצר.

הן gavage אוראלי והן מתן של אנטיביוטיקה במי השתייה לזמן קצר להקטין את העומס חיידקי צואה בעכברים מטופלים. חוקרים הבוחרים את השיטה הבודדת שמתאימה יותר לדרישות הניסוי בהתחשב בגורמים כגון אורך הטיפול. ניתן לשנות את שיטת qPCR לכימות חיידקים כדי לכמת מסה חיידקית בודדת באמצעות פריימרים ספציפיים.

זה יספק מידע כמותי וקאליטיבי על גודל המיקרוביום והרכבו.