ויזואליזציה בזמן אמת וניתוח Chondrocyte לפציעה בגלל העמסה מכנית ב Explants הסחוס מאתר באופן מלא ללא פגע

שיטה זו מאפשרת חקירה של ההשפעות של משטרי טעינה מכניים שונים, תנאים סביבתיים, או שלבים של ניוון הסחוס על הפגיעות של chondrocytes articular situ. הכוחות הפיזיים. שלא כמו טכניקות אחרות, מדידות אלה מבוצעות בזמן אמת ובסחוס שלם לחלוטין מבלי להתפשר על תנאי הגבול המקומיים.

יתרון נוסף של טכניקה זו הוא שהיא משתמשת במודל עכבר, המאפשר בדיקה של איך גנים ספציפיים משפיעים על הרגישות של chondrocytes situ בפציעה מכנית. עבור ניתוח של עצם הירך הדיסטלית, מניחים את העכבר בתקרת העל-חושית ולעשות חתך עור חמישה מילימטר על החלק האחורי של הברך. להאריך את החתך כל הדרך סביב הברך.

ולמשוך בחזרה את העור כדי לחשוף את מפרק הברך ושרירי הרגליים. החל מהקצה הפרוקסימלי של עצם הירך, השתמש בלהב אזמל מספר אחת עשרה כדי לחתוך לאורך העצם בכיוון הדיסטלי. מיקום הלהב בין יחידת גיד השריר הארבע ראשי לבין הצד האחורי של פיר הירך.

תרחיב את החתך מעבר לפטלה. חיתוך דרך אמצע גיד patellar כדי להסיר את יחידת גיד השריר quadriceps. לאחר מכן, החל מהקצה הפרוקסימלי של עצם הירך, מקם את להב האזמל בין יחידת גיד שריר הברך לבין הצד האחורי של פיר הירך וחותכים לאורך העצם בכיוון הדיסטלי.

כאשר החתך מתקרב למפרק הברך, חותכים דרך הרקמה הרכה, ומסיים את החתך מעבר למפרק הברך. משוך בחזרה את שרירי הארבע ראשי ואת שרירי מיתרי הברך כדי לחשוף את עצם הירך. וחותכים כל שריר עודף בצדדים הצדדיים והמתווכים של העצם.

חותכים את שריר השוקית בצד האחורי של השוקה הפרוקסימלית. ולהפוך את הרגל כדי לדמיין את הצד האחורי של עצם הירך. הסר את הרקמה העודפת סביב מפרק הברך כדי לחשוף את התכרבלים הדיסטליים של עצם הירך ואת המשטח האחורי של השוקה הפרוקסימלית.

חותכים את הרצועות הצולבות הקדמיות וה האחוריות הרחק מהתרנגול הירך. ולמשוך את השוקה מעצם הירך, חותך את כל הרצועות כדי להפריד את הרגל התחתונה מעצם הירך. באמצעות מספריים ניתוח סטנדרטי, לחתוך דרך עצם הירך בקצה הפרוקסימלי של העצם כשמונה מילימטרים מעל מפרק טיביופומורלי מהצד הצדדי.

ולהשתמש במדפים של תכשיטן כדי להסיר את הרקמות הרכות שמסביב מעצם הירך. ואז לחשוף את הסחוס על שני condyles בקצה הדיסטלי של עצם הירך. מעת לעת לחות את פני השטח של העור עם HBSS.

עבור ניתוח של הבטן, למקם את העכבר במצב supine. ולהשתמש מספריים מיקרו לעשות חתך חמישה מילימטר בצד האחורי של המרפק. הארכת החתך סביב המרפק והחזרת העור לאחור כדי לחשוף את השרירים על הזרוע והכתף.

החל מהקץ הפרוקסימלי של הבטן, למקם את הלהב של אזמל מספר אחת עשרה בין יחידת גיד שריר תלת ראשי ואת הצד האחורי של הבטן. וחותכים לאורך העצם בכיוון הדיסטלי. מרחיבים את החתך לכיוון הקצה הדיסטלי של הבטן, דרך גיד תלת תים ומוציאים את תלת ראשי לכיוון הקצה הפרוקסימלי של הבטן עד ראש הבטן נחשף.

חותכים את רקמת החיבור סביב ראש הגוף מבלי לגעת במשטח המקשר. ולהסיר את האיבר מהגוף. לחות את פני השטח של העור של ראש הגוף עם HBSS.

כדי לנתק את הזרוע מהזרוע, השתמש במלקיחות כדי לשבור את הקצה הפרוקסימלי של הגומד בצד האחורי של הזרוע. וחותכים את רקמת החיבור סביב הקצה הדיסטלי של עצם הבטן, מסירים כל רקמה עודפת על העצם. לאחר מכן השתמש במספריים לנתח סטנדרטי כדי להסיר את שופרוטי דלטויד בצד האחורי של עצם הבטן.

והצב את הדגימה שנותחה לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר המכיל HBSS. עבור Calcein AM הכתמת הדגימות, להעביר את העצמות לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר המכיל 500 microliters של 10.05 מיקרו טוחנת Calcein ב HBSS. ומ מניחים את הצינור במיקסר תרמו ב 37 מעלות צלזיוס ב 800 סל"ד, מוגן מפני אור.

לאחר שלושים דקות, לשטוף את הדגימה HBSS טרי במשך עשר דקות. ולהעביר את הדגימה על מגלשת הזכוכית של מיקרוסקופ מותאם אישית רכוב מכשיר בדיקה מכנית, כך פני השטח של העורק של תרכובות הירך האחורית או ראש ההומרל יושב על הזכוכית. לחות הדגימה עם HBSS ולה מניחים את המכשיר עם הדגימה על שלב מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

תמונה chondrocytes articular מוכתם Calcein AM לפני יישום העומס תחת הגדלה 4x. התאימו את קביעות הרכישה כדי למטב את איכות התמונה. כדי להחיל טעינה מכנית סטטית, להחזיק עומס סטטי שנקבע על גבי הדגימה, כך הסחוס המחשוף דחוס על זכוכית הכיסוי במשך חמש דקות לפני הסרת העומס.

כדי להחיל עומס מכני השפעה, טיפה משפיע גלילי של משקל ידוע על הדגימה מגובה שנקבע, שחרור העומס חמש שניות לאחר הפגיעה. מיד לאחר הסרת כל אחד מהעומסים, הדגירה את הדגימה ב 60 יודיד פרופרידיום מיקרו טוחן מוכן טרי במיליליטר אחד של HBSS. במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן לצלם מחדש את chondrocytes articular על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטי כפי שהודגם רק.

כדי לכמת את האזור של תאים פצועים ומתים בשל משטר הטעינה המכאנית המיושמת, פתח תחילה את המיקרוגרפים של משטח המשטחים שנרכשו לפני ואחרי יישום של עומס מכני ב- ImageJ. שלב את התמונות לערימה. קבעו את קנה המידה של התמונות בהתאם לרזולוציית התמונה.

לאחר מכן, הגדר את האזור שבו התאים הפכו קלסין שלילי PI חיובי. תאים אלה נחשבים פצועים או מתים. לאחר מכן לקבוע את האזור של תאים מתים פצועים באמצעות כלי המדידה.

לפחות שישה נבדקו להחיל את פרוטוקולי הטעינה לשכפל אזורים מקומיים הניתנים לכימות של פגיעה בתא בסחוסים הירך והעצם המתקבלים שמונה עד עשרה שבועות שסתום C עכברים. בכל פרוטוקולי הטעינה שנבדקו, עוצמת עומס גבוהה יותר ועוצמות פגיעה גבוהות יותר החריפו באופן משמעותי את ההיקף spacial של פגיעה בתא הן בעצם הירך והן בהומרי. בעת ביצוע הניתוחים חשוב לזכור לא ליצור קשר עם הסחוס המפרקי עם הכלים הכירורגיים, בכך עלול לסכן את הבסיס על ידי היכולת של הדגימות.

השימוש במודל שיקוף זה עשוי להקל על מחקר דלקת מפרקים ניוונית, כמו המחלה נגרמת בקלות בעכברים באמצעות מניפולציות גנטיות, תזונתיים או כירורגיים. הפלטפורמה שלנו מספקת גם כלי לחקור שאלות מדעיות בסיסיות ולמיון התערבויות טיפוליות המכוונות לפגיעות המכנית של כונדרוציטים.