בתיווך לולאה Assay איזותרמי הגברה (מנורה), עבור זיהוי מהיר של כנימת עש הטבק
29 באוקטובר 2018
הנייר הזה מדווח הפרוטוקול עבור וזמינותו זיהוי מהיר של כנימת עש הטבק מבוסס על טכנולוגיית בתיווך לופ הגברה איזותרמי (מנורה). הפרוטוקול דורש הכשרה מינימלית מעבדה, לכן, ניתן ליישם באתר בנקודות של ערך היבוא צמח כגון הקנתה ושדות תעופה.
שיטה זו מספקת כלי אבחון מהיר ואמין לזיהוי Bemisia tabaci, מזיק חרקים פולשני המשפיע על ייצור ירקות וגידולי נוי במדינות רבות ברחבי העולם. בשל קלותה, ניתן לבצע את השיטה באתר ישירות בנקודות כניסה למוצרים ליבוא צמחים, כגון נמלים ושדות תעופה, ובכך יש פוטנציאל לצמצם את הפיזור של Bemisia tabaci לאורך רשתות המסחר. כדי להתחיל, השתמש במספריים כדי לחתוך רצועת LAMP שמונה צינור לשתיים, ארבע צינורות LAMP רצועות.
לאחר מכן, תייג את הצינורות לפי הערכה המתוארת איור אחד של פרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, להכין מספיק B.tabaci LAMP תגובה מאסטר לערבב עבור 80 תגובות. לאחר מכן, לוותר על 22.5 microliters של תערובת האב לתוך כל הצינורות של רצועות LAMP ארבע צינורות.
דופק צנטריפוגה, ולשים אותם על קרח. במהירות מערבולת ודופק צנטריפוגה B.tabaci LAMP PAC. לאחר מכן, הוסיפו 2.5 מיקרוליטרים לצינור המסומנים PAC בכל אחת מרצועות ה-LAMP עם ארבעת הצינורות.
לאחר מכן, סגרו את העפעפיים, ואחסנו את יחידות ערכת B.tabaci LAMP המוכנות לשימוש במינוס 20 מעלות צלזיוס. כדי להתחיל בהפקת דנ"א, השתמש בקיסמים סטריליים כדי להעביר את דגימות החרקים לצינורות מיקרוצנטריפוגה 0.5 מיליליטר עם 30 מיקרוליטרים של פתרון מיצוי DNA. לאחר מכן, הדגירה את הדגימות במשך חמש דקות ב 95 מעלות צלזיוס ב ThermoMixer להגדיר 300 סל"ד.
בקצרה מערבולת וצנטריפוגה הדופק הדגימות. הפשרו את אחת הערכות המוכנות לשימוש של B.tabaci LAMP. לאחר מכן, מערבולת הערכה במהירות, ודופק צנטריפוגה זה.
הוסף 2.5 מיקרוליטרים של תמצית DNA מדגם לצינורות S-1 ו- S-2. לאחר מכן, להוסיף 2.5 microliters של פתרון מיצוי DNA אלקליין טהור לצינור NAC. לאחר מערבולת וצנטריפוגה דופק הערכה, להכניס את הערכה לתוך מכשיר ניתוח LAMP, ולבצע ניתוח הגברה DNA isothermal ב 65 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות.
באותה ריצה, לבצע ניתוח טמפרטורת התכה של מוצרי הגברה DNA על ידי חימום הראשון את הערכה ל 98 מעלות צלזיוס וקירור אותו ל 75 מעלות צלזיוס. אמת את קריאת LAMP באמצעות יישום האימות האוטומטי LAMP. תחילה, הגדר את מיני היעד ואת מספר הדגימות שנבדקו לפני לחיצה על לחצן צור דוח.
לבסוף, העבר את הקריאה לשדות הקלט המתאימים של יישום האימות. מיד לאחר הזנת הנתונים תוצג תוצאת האימות. בפרוטוקול זה, דגימות חרקים B.tabaci יורטו במהלך תהליך בקרת היבוא השוויצרי הרגיל נותחו באמצעות מראי LAMP.
מתוך סך של 80 דגימות שנותחו, 75 דגימות זוהו כראוי כחיוביות אמיתיות, ושתי דגימות זוהו כראוי כשליליות אמיתיות. שלוש דגימות, לעומת זאת, היו שליליות שווא וזוהו באופן שגוי כמו לא להיות B.tabaci. תת-קבוצה של הראיה בוצעה באתר על ידי פקחי בריאות המפעל בנמל התעופה של ציריך.
בתוצאות הייצוגיות זוהו נכון דגימות 1 ו-2 כ-B.tabaci באמצעות הגברה בדנ"א לאחר כ-30 דקות בטמפרטורת חישול צפויה של כ-82 מעלות צלזיוס. לאחר פיתוחה, שיטה זו סללה את הדרך לזיהוי מהיר וקל לביצוע באתר של Bemisia tabaci. הפרוטוקול מתוכנן באופן שבו הוא יכול להתבצע על ידי פקחי בריאות הצמח עם הכשרה מעבדתית מוגבלת.
לאחר אימות מוצלח באתר של השיטה בנקודת כניסה שוויצרית עבור מוצרי ייבוא צמחים, השיטה יכולה להיות מותאמת לפתוגנים צמחיים אחרים, אך גם, במידת הצורך, לפתוגנים אנושיים או וטרינריים אחרים.
סקירה כללית
מאמר זה מציג בדיקה לזיהוי מהיר של Bemisia tabaci באמצעות טכנולוגיית הגברה איזותרמית מתווכת לולאות (LAMP). השיטה תוכננה ליישום בשטח בנקודות כניסה של ייבוא צמחים, והיא דורשת הכשרה מעבדתית מינימלית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- פתולוגיה של צמחים
- ניהול מינים פולשים
- טכנולוגיה דיאגנוסטית
רקע
- Bemisia tabaci הוא מזיק חסר הגנה פולש המשפיע על יבולים ברחבי העולם.
- גילוי מוקדם הוא קריטי למניעת התפשטותו.
- שיטות קיימות עשויות שלא להתאים לבדיקות מהירות בשטח.
- טכנולוגיית LAMP מציעה פתרון מבטיח לאבחון מהיר.
מטרת המחקר
- פיתוח בדיקה מהירה ואמינה לזיהוי Bemisia tabaci.
- מתן אפשרות לבדיקה באתרים בנקודות ייבוא כגון נמלי תעופה ונמלי ים.
- הפחתת הסיכון להפצת מזיקים באמצעות סחר.
שיטות שהשתמשו בהן
- הכנת תערובת מאסטר לתגובת LAMP ומיצוי DNA.
- הגברה איזותרמית של DNA בטמפרטורה של 65 °C.
- ניתוח טמפרטורת התכה של תוצרי ההגברה.
- תיקוף של התוצאות באמצעות יישום אוטומטי.
תוצאות עיקריות
- 75 מתוך 80 דגימות זוהו נכונה כחיוביות אמיתיות.
- שתי דגימות זוהו נכונה כשליליות אמיתיות.
- שלוש דגימות היו שליליות שגויות.
- השיטה תוקפה בהצלחה באתר על ידי המפקחים.
מסקנות
- בדיקת ה-LAMP מספקת שיטה מהירה ויעילה לזיהוי מזיקים.
- ניתן לבצע אותה על ידי אנשים עם הכשרה מעבדתית מוגבלת.
- לשיטה זו יש פוטנציאל להסתגלות עבור פתוגנים אחרים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
זיהוי מולקולרי מהיר של מזיקים פולשים כגון Bemisia tabaci הוא קריטי למניעת הפסדים חקלאיים ולהגנה על שרשראות אספקה גלובליות. בדיקת ה-LAMP מאפשרת זיהוי באתר במעברי כניסה, ובכך מפחיתה את ההסתמכות על מעבדות מרכזיות ומאיצה את זמני התגובה. דבר זה תומך בניהול סיכונים פרואקטיבי בביוטכנולוגיה חקלאית ובציות לתקנות סחר בינלאומי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר זיהוי ספציפי של קומפלקס המינים Bemisia tabaci, ובכך תומך בבדיקת השערות במחקרי אינטראקציה בין וקטור לפתוגן.
- ערך תפעולי: מספק מטרה מולקולרית סטנדרטית לתיקוף כשירותו של חרק כוקטור במודלים פרה-קליניים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר אותות הגברה כמותיים תוך 60 דקות, מה שמאפשר סריקה בקיבולת גבוהה של דגימות חרקים.
- ערך תפעולי: משתמש בכמות דגימה מינימלית ובריאגנטים ליופיליזים יציבים, התומכים ביכולת הרחבה של הבדיקה ובפריסה בשטח.
מחקר תרגומי וטרום-קליני
- ערך מדעי: מאפשר ביסוס מתאם בין נוכחות הווקטור לבין הסיכון להעברת נגיף במערכות רלוונטיות למחלה.
- ערך תפעולי: תומך בניטור אורך של אוכלוסיות מזיקים במחקרי סביבה מבוקרת.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
הבדיקה משתלבת בתהליכי עבודה של שלבי הגילוי המוקדמים על ידי מתן זיהוי מהיר של הווקטור לפני מחקרי העברת פתוגנים, דבר המאפשר בחירה מושכלת של דגימות לבדיקות המשך.
- ביולוגיה של הגילוי: מאשר את זהות הווקטור כדי לצמצם התאמות שגויות בניסויי אינטראקציה בין ווקטור לנגיף.
- סריקה: מספקת קריאה בינארית (חיובי/שלילי) עם בקרות פנימיות, המבטיחות את מוכנות הבדיקה ואת השחזוריות שלה.
- אנליטיקה: משתלב עם תוכנת אימות אוטומטית לצורך פרשנות נתונים סטנדרטית ועקביות בין מעבדות.
- מחקר תרגומי: מאפשר מעקב אחר שכיחות הווקטור באזורים גיאוגרפיים הרלוונטיים לאיומים של נגיפי צמחים מתהלכים.
- שימוש חוזר ארגוני: תכנון מבוסס ערכה מאפשר שימוש חוזר במספר אתרי בדיקה והתאמה למיני ווקטורים אחרים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: משפר את רמת הביטחון ביעד על ידי הפחתת זיהוי שגוי של וקטורי חרקים במחקרים ביולוגיים.
- ערך תפעולי: מבטל את הצורך בטיהור DNA ובמחזורי תרמיים (thermocycling), ובכך מוריד חסמים טכניים ודרישות הכשרה.
- ערך אסטרטגי: מאיץ קבלת החלטות של go/no-go בהערכות סיכוני מזיקים, ומפחית אובדן יבולים פוטנציאלי והשפעה כלכלית.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף של משאבי ניטור מותאם-סיכון, בהתבסס על נתוני זיהוי וקטורים מאומתים.
שיקולי יישום
- הכשרה בסיסית בביולוגיה מולקולרית לטיפול בריאגנטים והכנת דגימות.
- גישה למכשיר גילוי פלואורסצנציה או עכירות התומך ב-LAMP.
- נהלי עבודה סטנדרטיים להובלת דגימות ובקרת זיהומים.
- שיקולי התאמה עבור מיני חרקים שונים או שלבי התפתחות שונים.
- יציבות סביבתית של ריאגנטים במהלך פריסה בשטח ואחסון.
