ניתוח הטמפורלי של רוברטסונית גרעינית-כדי-cytoplasmic של חלבון 1 וירוס הרפס סימפלקס מאת Immunofluorescent קונפוקלית

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הסחר בחלבון על טרנסלוקציה גרעינית וציטופלסמית במערכת שבה הדמיית אור אינה זמינה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שזה יכול להיות מיושם כפרוטוקול כללי לחקר תנועת חלבון זמני מבלי לערב הדמיה אור. 20 עד 24 שעות לפני זיהום הנגיף זרע 5 פעמים 10 כדי 4 ריאה עוברית אנושית או תאי פיצוץ סיבי HEL ל הבאר על ארבע באר 11 מילימטר התנדנד שקופית וצמיחה בינונית עבור דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס עם חמישה אחוזים פחמן דו חמצני.

חשוב לטלטל את המגלשה ביסודיות כדי להבטיח חלוקה שווה של התאים תוך הקפדה על הימנעות לשפוך את מדיום התרבות. למחרת, להחליף את supernatants כך 70 עד 80 אחוז תרבויות confluent עם בינוני 199, המכיל 410 פלאק להרכיב יחידות לכל תא, ולמקום את השקופית ב 37 מעלות צלזיוס עם רועד, במשך שעה אחת. בסוף הדגירה, החלף את העל-טבעיים במדיום צמיחה טרי והחזר את התאים לחממה לתקופת ההדבקה הניסיונית המתאימה.

עבור כתמים immunofluorescent של תאים נגועים בנגיף, לשטוף במהירות את התאים שלוש פעמים עם PBS. ואחריו דגירה של שמונה עד עשר דקות ב-200 מיקרוליטרים של ארבעה אחוזים של פרפורמלדהיד ב-PBS ל הבאר. בסוף קיבעון, לשטוף את התאים שלוש פעמים עם 200 microliters של PBS לכל לשטוף, ולחלחל התאים עם 100 microliters של 0.2 אחוז פעילי שטח לא יוניים לבא במשך חמש עד עשר דקות.

לשטוף את התאים permeabilized שלוש פעמים PBS כפי שהודגם, ולהוסיף 200 microliters של חיץ חסימה לכל באר עבור דגירה של שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסיפו את הריכוז המתאים של הנוגדן העיקרי המעניין כל באר עבור דגירה בטמפרטורת החדר של שעתיים. בסוף הדגירה, הסר כל נוגדן ראשוני לא מאוגד עם שלוש, עשר דקות שוטף במאגר חסימה טרי, ולהוסיף נוגדן משני מתאים לכל באר עבור דגירה של שעה בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור.

בסוף הדגירה, לשטוף את התאים שלוש פעמים במאגר חסימה כפי שהודגם, ואחריו לשטוף אחד PBS ולהוסיף טיפה אחת של מדיום הרכבה antifade בתוספת DAPI לכל באר. לאחר מכן מניחים כיסוי להחליק מעל השקופית ולאטום את שיפוע הכיסוי עם לק שקוף. הפעלת לחץ עדין בעת הרכבה של תלוש הכיסוי תסיר כל מדיום הרכבה עודף, ותסייע להבטיח רכישה של תמונות באיכות גבוהה.

עבור דימות קונפוקלי של התאים הנגועים המסומן, בחר את אורכי הגל המשניים המתאימים של נוגדנים ו- DAPI והגדר את תבנית התמונה ל- 1, 024 על 1, 024 פיקסלים עם קו ממוצע של שמונה. ואז תמונה כל גם על שקופית ארבע באר תחת המטרה 100x. לספירת מספר גדול של תאים, השג חמש עד עשר תמונות משדות עוקבים באותה באר תחת המטרה 40x.

כדי לנתח את ההפצה הגרעינית והציטופלסמית של ICP0, פתח את הפרוייקט בתוכנת היישום הקונפוקל ובחר תמונה. פתחו את הכרטיסיה 'כמות' ובחרו 'מיון אזורי עניין' מתפריט 'כלים'. בחר צייר קו וצייר קו אורך לאורך התא שיש לנתח.

היסטוגרמה תופיע המציגה את עוצמת הפלואורסצנטיות לאורך הקו הן עבור החלבון המעניין והן עבור DAPI. בהתבסס על כתמי הרקע, הגדר סף קבוע לעוצמת החלבון המעניין לניתוח התת-תאי של החלבון בכל ניסוי. אם אות החלבון, בממוצע, הוא מתחת לסף באזור הגרעיני, אבל הוא מעל הסף מעבר לגבול DAPI, לסווג את אות החלבון כמו ממוקם בעיקר בתוך הציטופלסמה.

אם אות החלבון נמצא מעל הסף לאורך הגרעין, ומעבר לגבול אות ה- DAPI, קבץ את אות החלבון כגרעין בתוספת לוקליזציה ציטופלסמית. אם אות החלבון הוא מעל הסף בגרעין, אבל בממוצע הוא מתחת לסף מחוץ לגבול של קבוצת אותות DAPI אות החלבון כמו לוקליזציה גרעינית. לבסוף, לטבלה יותר מ -200 תאים נגועים מכל מדגם בנקודות זמן זיהום שונות, ולתוות את הנתונים בגרף עמודות כדי להמחיש את התנועה של החלבון של עניין לאורך זמן.

כפי שהוכח, שיטה זו מקלה על ניתוח של טרנסלוקציה גרעינית-ציטופלסמית של חלבונים מעניינים. לדוגמה, חלבון תא נגוע אפס, או ICP0 התפלגות תת תאית משתנה כמו זיהום ויראלי מתקדם. כדי להבין את האלמנטים הדרושים לסחר ICP0 במהלך ההדבקה, ניתן לעקוב אחר תנועות ICP0 בסוג פראי ווירוס הרפס סימפלקס 1 תאים נגועים בשלבי זיהום שונים, המאפשר את ההערכה של התת-תאים של ICP0 בנקודות זמן שונות של זיהום.

חשוב לזכור להשתמש בתרבויות monolayer כך virions יש גישה שווה לתאים לנרמל את ריבוי הזיהום על פי כותרת הנגיף, כך התקדמות הזיהום דומה בין ובתוך וירוסים. לאחר כל התפתחות, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחומי הביולוגיה והווירולוגיה של התא לחקור את תנועת החלבון על ידי לימוד לוקליזציה תת-תאית זמנית של חלבונים מעניינים בתוך אוכלוסיית תאים.