Name: ויזואליזציה של נדידת תאים העוסקות ב Tectum אופטיים לפתח הבחורה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-24T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: למד שיטות לסימון פלואורסצנטי של תאים נודדים ב-Tectum אופטי של עוברי תרנגולת באמצעות אלקטרופורציה ודימות time-lapse. טכניקה זו מאפשרת מעקב אחרי נדידת תאים בודדים וקולקטיבית לאורך זמן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מספר גרנט KAKENHI JSPS 15 06740 K כדי לעותר

1. אלקטרופורציה ב Ovo
<ol><li>להכין את הביטוי פלסמיד DNA תיוג פלורסנט בריכוז גבוה. לבודד דנ א מ- 200 מ של התרבות חיידקי בשיטת פירוק אלקליין תוך שימוש בעמודות אניון הבורסה לפי הפרוטוקול של היצרן (טבלה של חומרים). לערבב pCAGGS-EGFP pCAGGS-mCherryNuc-ריכוז סופי של 4 µg/µL כל. הערה: טיהור DNA פלסמיד נטולת אנדוטוקסין עשוי להיות המועדפת עבור אלקטרופורציה.</li>
	<li>דגירה ביצי תרנגולת פורייה אופקית ב 38 ° C ב- 70% לחות יחסית.</li>
	<li>אחרי 2.5 ימים, לחסל את 5 מ של אלבומין (חלבון ביצה) מן הצד המחודד של הביצה באמצעות 20 מ"ל מזרק עם מחט בקוטר 18, לאטום את החור מחט עם הקלטת.</li>
	<li>לחתוך העליון של המעטפת ביצה עם מספריים מעוגלים כדי לפתוח חור 2 ס מ קוטר ולבדוק את השלב ההתפתחותי של העובר תחת stereomicroscope (שלב 17 / המבורגר והמילטון9). לאטום את החור שוב עם הקלטת. הערה: שלב זה יכול להתבצע בכל עת במהלך E2.5-E3.0. שלבים 1.3 ו- 1.4 להנמיך את הרמה של העובר על הביצה כדי להימנע קובץ מצורף חזק של העובר גדל ואת כלי הדם כדי המעטפת העליונה.</li>
	<li>המשך דגירה עד E5.5.</li>
	<li>לפני אלקטרופורציה, להכין µL 10 על פלסמיד שהוזכרו dna צבעוניים עם 0.5 µL מהר ירוק (25 מ"ג/מ"ל), 10 מ של פוספט בלוק buffered מלוחים (PBS) המכיל פניצילין (100 יחידות/mL) סטרפטומיצין (100 μg/mL), ואת micropipettes מסיבים זכוכית צינורות קפילר באמצעות מעבד micropipette. חותכים בקצה הדיסטלי micropipette כדי להפוך בגודל המתאים של הנקבובית בהתאם לכמות הדנ א להזרקה.</li>
	<li>חותכים את הקליפה העליונה אטום עם מספריים כדי לפתוח חור 2.5 ס מ קוטר ולהגדיר את הביצה stably תחת המיקרוסקופ סטריאו. הוסף מספר טיפות של PBS לתוך הביצית. לקלף את הקרום allantoic מכסה את העובר ללא דימום באמצעות מלקחיים בסדר שני. הסר את השפיר של ראשו של העובר.</li>
	<li>כשאתם מסובבים את הראש עם microspatula, מזריקים 0.1-1 μL של ה-DNA צבעוני לתוך חלל חדרית של tectum אופטיים שמאל באמצעות micropipette מחובר צינור שאיבה. הערה: כמות ה-DNA מוזרק תלוי מטרת הניסוי. תמיסה מרוכזת של הדנ א צריך לשקוע וצרף לאורך הקיר חדרית.</li>
	<li>המקום זוג אלקטרודות מסוג forcep (3 מ מ, מרובע אלקטרודות עם מרחק 7 מ מ) כך אזור היעד של tectumis סיב אופטי ממוקם בין (איור 1שלב 1). הערה: ה-DNA היא electroporated לצד אנודת.</li>
	<li>גובה דופק מראש של 30 V, ms עם מרווח של 5 אלפיות השנייה, ארבע פעימות עוקבות של 6 V 1, 5 מילי-שניות עם מרווח 10 ms באמצעות הגנרטור דופק. הערה: התנאי אלקטרונית תלוי גודל ומרחק של האלקטרודות. זה צריך להיות מספיק חזק כדי להשיג יעילות תרביות תאים, אך זה חייב להיות צנוע מספיק כדי להבטיח להתפתחות תקינה של רקמת המטרה.</li>
	<li>לאטום את החור עם הקלטת ולהמשיך הדגירה. משרים את האלקטרודות ב- PBS להסיר אלבומין במברשת interdental בצלחת פלסטיק. חזור על 1.7-1.11 עבור כל ביצה.</li>
</ol>2. שטוח-הר תרבות על תותב תא
<ol><li>יום אחד לפני התרבות שטוח-הר, להכין את תותב תרבות תא מצופה. לצוף קצת מוסיף התרבות התא למים מזוקקים בלוק בצלחת בתרבות תא ס מ-10. לטעון פתרון של µg/mL laminin 8 ו- 80 µg/mL פולי-L-ליזין לכסות את הכיסויים ולעזוב את הכיסויים צפים בחממה תרבות CO2 תאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. הערה: למחרת, המכסים מצופים שניתן לאחסן ב 4 º C.</li>
	<li>ביום של התרבות-E7.0, הסר תותב הפתרון laminin-פולי-L-ליזין ולמקם את תותב בקערת זכוכית התחתון (איור 1שלב 2) מלא 1.1 מ של תרבות בינונית (60% מופחת סרום בינוני, 20% F12, סרום שור עוברית 10%, 10 נסיוב החתיכה %, 50 יחידות/mL פניצילין, 50 סטרפטומיצין μg/mL). לשמור את המנה בחממה תא תרבות CO2 ב 37 º C. הערה: המדיום יכול לשמש לאורך כל תקופת תרבות במשך שלושה ימים ללא שינוי.</li>
	<li>להכין את ההגדרה של תרבות. הגדר היחידה קאמרית לח מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך עם זרם הגז של 40% O2 ו 5% CO2 (גז בקר) ב 38 ° C (בקר טמפרטורה).</li>
	<li>חותכים את הראש של העובר עם מספריים. לצבוט את הראש החוצה עם המלקחיים בתוך תמיסת מלח מאוזנת הנקס קר כקרח (HBSS) בקערה התרבות תאים 6 ס מ.</li>
	<li>לבודד את tectum electroporated סיב אופטי באמצעות מלקחיים בסדר שני. להעביר את tectum עם טפי פלסטיק לתוך תבשיל אחר מלא HBSS קר כקרח. השתמש את צלחת זכוכית והקעורות מבוסס עם סיליקון שחור כמו צלוחית לחיתוך.</li>
	<li>בדוק את המיקום של תיוג תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי זריחה. לגזור tectal רקמות המקיפים את האזור תיוג עם סכין השתלה. ודא את הכיוון של הרקמה ב tectum (קדמי-אחוריים, הגבי הגחוני /).</li>
	<li>להעביר הרקמה שכותרתו עם טפי פלסטיק הכנס כך הצד פיא מצורפת את הכנס. להניח את הרקמה tectal בכיוון הרצוי ולהסיר עודפי HBSS (איור 1שלב 2).</li>
	<li>חזור על 2.4-2.7 לשם הכנת רקמות אחרות באותו הכנס. מקם את המנה בבית הבליעה prewarmed ב מיקרוסקופ קונפוקלי הפוכה (איור 1בשלב 3).</li>
</ol>3. זמן לשגות הדמיה
<ol><li>בדוק את תוויות פלורסנט ולהתמקד בתחום מיקרוסקופיים. מיקרוסקופ קונפוקלי הפוכה. להתחיל את היחידות לייזר קונפוקלי ונסה הדגימה את הסריקה קונאפוקלית כדי להתאים את הכיוון והמיקום של הרקמה לאורך ציר ה-y, X בשטח. השתמש ה-X של 10 או 20 X עדשה אובייקטיבי ללא שמן טבילה.</li>
	<li>בחר את גודל סריקה (למשל, 512 x 512 dpi). להחליט את מרווח הזמן ואת טווח הכולל של הסריקה קונאפוקלית לאורך ציר z. לקחת מרווח של 5 או 10 מיקרומטר עבור הטווח 100 מיקרומטר. להחליט את מרווח הזמן של הדמיה קונאפוקלית, הכולל הדמיה משך (למשל, 10 דקות מרווחי מעל 48 שעות). הערה: כדי להימנע לייזר phototoxicity, לאסור סריקה גודל סריקה גבוהה עם z-הפסקות קצרות עבור z ארוך-הטווח, או עם מרווחי זמן קצר במהלך משך זמן הדמיה. לדוגמה, בשעת החלת גודל סריקה גבוהה (למשל, 1024 1024 x dpi), להקטין את מספר סריקות לאורך ציר z.</li>
	<li>ערכת הפרמטרים של הריצות קונאפוקלית תוכנית 3.2 שמתואר ולהתחיל הדמיה.</li>
	<li>לאחר ההדמיה, לשלב את התמונות קונאפוקלית על ציר z שונים כדי לספק תמונות z-מחסנית עם התאמת מוקד משובח בכל נקודת זמן.</li>
	<li>צרף תמונות z-מחסנית בנקודת זמן שונים ולבנות סרט זמן לשגות בפורמט AVI.</li>
</ol>

<ol><li>Marín, O., Rubenstein, J. L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration+in+the+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cell migration in the forebrain.</a> Annual Reviews of Neuroscience. 26, 441-483 (2003).</li>
<li>Nadarajah, B., Alifragis, P., Wong, R. O. L., Parnavelas, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+migration+in+the+developing+cerebral+cortex%3A+Observations+based+on+real-time+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Neuronal migration in the developing cerebral cortex: Observations based on real-time imaging.</a> Cerebral Cortex. 13, 607-611 (2003).</li>
<li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipolar+migration%3A+the+third+mode+of+radial+neuronal+migration+in+the+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Multipolar migration: the third mode of radial neuronal migration in the developing cerebral cortex.</a> Journal of Neuroscience. 23, 9996-10001 (2003).</li>
<li>Martini, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biased+selection+of+leading+process+branches+mediates+chemotaxis+during+tangential+neuronal+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Biased selection of leading process branches mediates chemotaxis during tangential neuronal migration.</a> Development. 136, 41-50 (2009).</li>
<li>Polleux, F., Whitford, K. L., Dijkhuizen, P. A., Vitalis, T., Ghosh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+cortical+interneuron+migration+by+neurotrophins+and+PI3-kinase+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Control of cortical interneuron migration by neurotrophins and PI3-kinase signaling.</a> Development. 129, 3147-3160 (2002).</li>
<li>Watanabe, Y., Yaginuma, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tangential+cell+migration+during+layer+formation+of+chick+optic+tectum%5BTitle%5D)+AND+%22Development%2C+Growth+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Tangential cell migration during layer formation of chick optic tectum.</a> Development, Growth and Differentiation. 57, 539-543 (2015).</li>
<li>Watanabe, Y., Sakuma, C., Yaginuma, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NRP1-mediated+Sema3A+signals+coordinate+laminar+formation+in+the+developing+chick+optic+tectum%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">NRP1-mediated Sema3A signals coordinate laminar formation in the developing chick optic tectum.</a> Development. 141, 3572-3582 (2014).</li>
<li>Watanabe, Y., Sakuma, C., Yaginuma, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dispersing+movement+of+neuronal+tangential+migration+in+superficial+layers+of+the+developing+chick+optic+tectum%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Dispersing movement of neuronal tangential migration in superficial layers of the developing chick optic tectum.</a> Developmental Biology. 437, 131-139 (2018).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Morphology%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).</li>
<li>Cordelières, F. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+cell+tracking+and+analysis+in+phase-contrast+videos+%28iTrack4U%29%3A+development+of+Java+software+based+on+combined+mean-shift+processes%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Automated cell tracking and analysis in phase-contrast videos (iTrack4U): development of Java software based on combined mean-shift processes.</a> PLOS One. 8, e81266(2013).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, 676-682 (2012).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

הפרוטוקול המתואר לעיל ממוטבת לגילוי נדידת תאים שכבות שטחיות6,8. הוא ישים לגילוי שכבה אמצעית ההעברה נחלים (סרט 5)6,7, רק על ידי הסטה העיתוי של אלקטרופורציה (E5.5 כדי E4.5) ואת תחילתה של תרבות והדמיה (E7.0 כדי E6.0).
ההליך הציג מורכב תא תיוג אלקטרופורציה ב ovo, תרבות שטוח-הר, זמן לשגות קונאפוקלית הדמיה (איור 1</stro...

המחקר של נדידת תאים מתקדמת עם טכניקה לקידום הדמיה בשידור חי. לאחר התא פלורסנט תיוג, התנועה הטמפורלי של תאים עם תוויות תרבות מאכל או ויוו ניתן להקליט תחת מיקרוסקופ וידאו. במחקר של התפתחות עצבית, שינויים מורפולוגיים של נדידת תאים או מתארך אקסונים יש כבר נותחה באמצעות הדמיה בצילום מואץ. עבור הדמיה יעיל, זה חיוני כדי להחיל שיטה מתאימה להכנה תא פלורסנט תיוג ורקמות, בהתבסס על מטרת ניסוי וניתוח. לניתוח נדידת תאים במוח המתפתח, התרבות פרוסה כבר בשימוש נפוץ להתבונן נדידת תאים מקבילים למדור פרוסה, כגון תא רדיאלי ההעברה1,2,3. מערכת התרבות פרוסה משמש גם לגילוי תא וצורניים ההעברה4,5, אבל זה לא מתאים לניתוח כיוונית במקרים שבו התאים לפזר בניצב בסעיף פרוסה.
Tectum סיב אופטי מורכב מבנה מרובה שכבות, שהוקמה על ידי נדידת תאים רדיאלי, וקולו במהלך התפתחות עובריים. היווצרות שכבה tectal תלוי בעיקר ההעברה רדיאלי של קודמן עצביים postmitotic תאים מאזור חדרית, היעד הסופי שלהם ברבדים בקורלציה עם תאריך הלידה שלהם ב אזור חדרית6. באשר וצורניים ההעברה, דיווחנו בעבר שני זרמים של העברות בשכבות הביניים ושיטחית ב tectum אופטיים המתפתח הבחורה. בשכבות הביניים במהלך E6-E8, התאים דו קוטבי עם תהליך ארוך המובילים ותהליך נגרר דק נודדים dorsally או ventrally לאורך fasciculus האקסון של אקסונים efferent tectal הפועלות dorso-ventrally7. לאחר העברה זו axophilic, התאים להבדיל לתוך הנוירונים multipolar הנמצא בשכבות העמוקות. בשכבות שטחיות במהלך E7-E14, התאים נודדים לפזר בצורה אופקית על ידי רפורמה תהליך המוביל מסועף ופיזור לתוך כיוונים מספר8. לאחר פיזור ההעברה, התאים האחרונים להבדיל בסופו של דבר לתוך הנוירונים שטחית מורפולוגיות שונות. בשני המקרים, תרבות שטוח-הר יעיל כדי לבחון את תנועת התא מקביל פני השטח pial.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול הדמיה בצילום מואץ להמחיש נדידת תאים לתעל פיתוח צ'יק tectum סיב אופטי7,8. שילוב של התא תיוג על ידי אלקטרופורציה ב ovo, ותרבות עוקבות שטוח-mount על הוספה התרבות תאים מאפשרת גילוי של כיוון התנועה והעברה תא נודדים. המטרה של שיטה זו היא כדי להקל על הזיהוי של שני התנהגות תא בודד לטווח הארוך, פעולה קולקטיבית של קבוצת תאים במישור האופקי.

<table><tbody><tr><td><חזק>חומרים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Midi Plus EF</td><td>MACHEREY-NAGEL</td><td>740422.5</td><td>ערכת טיהור DNA פלסמיד ללא אנדוטוקסין</td></tr><tr><td>20 מ"ל מזרק</td><td>TERUMO</td><td>SS-20ESZ</td><td></td></tr><tr><td>18 מד מחט</td><td>TERUMO</td><td>NN-1838R</td><td></td></tr><tr><td>מהיר ירוק</td><td>Wako</td><td>061-00031</td><td></td></tr><tr><td>100x פניצילין וסטרפטומיצין</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>צינור נימי זכוכית</td><td>Narishige</td><td>G-1</td><td></td></tr><tr><td>תרבית תאים הכנס</td><td>Millipore</td><td>Millicell CM-ORG</td><td></td></tr><tr><td>למינין</td><td>SIGMA</td><td>L2020</td><td>ציפוי של תרבית הכנס</td></tr><tr><td>פולי-L-ליזין</td><td>מכון פפטיד</td><td>3075</td><td>ציפוי של תרבית הכנס</td></tr><tr><td>צלחת תחתונה מזכוכית</td><td>Matsunami</td><td>D11130H</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td>מדיום תרבית</td></tr><tr><td>F12</td><td>Gibco</td><td>11765-054</td><td>תרבית</td></tr><tr><td>בינונית סרום בקר עוברי</td><td>Gibco</td><td>12483</td><td>סרום</td></tr><tr><td>אפרוח</td> בינוני <td>Gibco</td><td>16110082</td><td>תרבית בינונית</td></tr><tr><td>10xHBSS</td><td>Gibco</td><td>14065-056</td><td></td></tr><tr><td>סכין מיקרוכירורגית</td><td>התמחויות כירורגיות שיתוף פעולה</td><td>72-1501</td><td></td></tr><tr><td><חזק>שם</חזק></td><td><חזק>חברה</חזק></td><td><חזק>מספר קטלוגי</חזק></td><td><חזק>הערות</חזק></td></tr><tr><td><חזק>ציוד<חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מספריים מעוקלים</td><td>כאחד</td><td>מס' 11</td><td></td></tr><tr><td>מעבד מיקרופיפטה</td><td>מכשיר SUTTER</td><td>P97 / IVF</td><td></td></tr><tr><td>אלקטרודה מסוג מלקחיים</td><td>BEX</td><td>LF646P3x3</td><td></td></tr><tr><td>מחולל דופק</td><td>BEX</td><td>CUY21EX</td><td>אלקטרופורטור</td></tr><tr><td>פלואורסצנטי מיקרוסקופ סטריאוסקופי</td><td>Leica</td><td>MZ16F</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך</td><td>בקר</td><td></td> גז אולימפוס IX81 <td></td></tr><tr><td></td><td>בקר טמפרטורה Tokken</td><td>MIGM/OL-2</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Tokai Hit</td><td>MI-IBC</td><td></td></tr><tr><td>לייזר קונפוקלי</td><td>יחידה אולימפוס</td><td>FV300</td><td></td></tr></tbody></table>

ויזואליזציה של נדידת תאים העוסקות ב tectum אופטיים לפתח הבחורה

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

הדמיה בצילום מואץ היא שיטה חזקה כדי לנתח בהתנהגות התא נודדים. לאחר התא פלורסנט תיוג, ניתן לרשום את התנועה של התאים עם תוויות בתרבות תחת מיקרוסקופ וידאו. לניתוח נדידת תאים במוח המתפתח, התרבות פרוסה משמש בדרך כלל כדי להתבונן נדידת תאים מקבילים למדור פרוסה, כגון נדידת תאים רדיאלי. עם זאת, ניתן להשיג מידע מוגבל השיטה התרבות פרוסה לנתח נדידת תאים בניצב המקטע פרוסה, כגון נדידת תאים וצורניים. כאן, אנו מציגים את הפרוטוקולים הדמיה בצילום מואץ להמחיש נדידת תאים העוסקות ב tectum אופטיים לפתח הבחורה. שילוב של התא תיוג על ידי אלקטרופורציה ב ovo ותרבות עוקבות שטוח-mount על תותב התרבות התא מאפשר זיהוי של התא נודדים, בתנועה במישור האופקי. יתר על כן, שיטת שלנו מקלה על גילוי של התנהגות תא בודד וגם פעולה קולקטיבית של קבוצת תאים בטווח הארוך. בשיטה זו ניתן להחיל באופן פוטנציאלי כדי לזהות את השינוי רציפים של התווית על-ידי פלורסנט המיקרו-המבנה, כולל התארכות עצב העקירה עצבית רקמות או תאים בתוך הרקמה ללא עצביות.

איור 2 מציג את ההעברה וצורניים שטחית מטמיעים בתרבות שטוח-הר בזמן שחלף (0, 9, 18, 27 h) לאחר תחילת הקלטה. הסרט 1 הוא סרט בצילום מואץ של מינימום 10-מרווחי על פני תקופה של 28 שעות ו 50 דקות. במסגרת נבחרת עבור התמקדות התאים נודדים מהפינה השמאלית התחתונה עם תוויות של המסגרת למרחב ללא תווית (איור 3 א). התנועה ההמונית של התאים נודדים (GFP; לוח השמאלי העליון, סרט 1), יכ...

אנו מתארים את פעולות השירות עבור תיוג פלורסנט tangentially גידול תאים על-ידי אלקטרופורציה ולאחר עבור הדמיה בצילום מואץ של התנועה תאים עם תוויות בתרבות שטוח-הר כדי להמחיש נודדות תא התנהגות tectum אופטיים לפתח הבחורה .

ויזואליזציה של נדידת תאים העוסקות ב Tectum אופטיים לפתח הבחורה

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה ההתפתחותית, כגון המנגנונים של נדידת תאים עצביים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאתה יכול לזהות הגירת תאים בודדים וקולקטיביים בטווח הארוך. לאחר בידוד 200 מיליליטר של תרבות חיידקית בשיטת תמיסת אלקליין, מערבבים את שתי הפלסמידים, כך שהריכוז הסופי של כל אחד מהם הוא ארבעה מיקרוגרם למיקרוליטר.הדגירה של ביצי העוף הפוריות אופקית ב-38 מעלות צלזיוס ב-70% לחות יחסית. לאחר יומיים וחצי, השתמש במזרק 20 מיליליטר עם מחט מד 18 כדי לחסל חמישה מיליליטר של אלבומין מהצד המחודד של הביצה. לאטום את החור עם קלטת.לאחר מכן, השתמש במספריים מעוקלים כדי לחתוך את החלק העליון של קליפת הביצה ולפתוח חור, שני סנטימטרים קוטר. תחת סטריאומיקרוסקופ, בדוק את השלב ההתפתחותי של העובר. לאטום את החור הגדול הזה עם קלטת.ממשיכים את הדגירה בטמפרטורה של 38 מעלות צלזיוס ו-70 אחוז לחות יחסית עד E5.5. לפני אלקטרופורציה, להכין 10 microliters של ה-DNA פלסמיד שהוזכרו בצבע עם 0.5 microliters של ירוק מהיר. כמו כן, להכין 10 מיליליטר של PBS autoclaved המכיל 100 יחידות למיליליטר של פניצילין, ו 100 מיקרוגרם למיליליטר של סטרפטומיצין.השתמש במעבד מיקרופיט להכנת מיקרופיטים עשויים צינורות נימי זכוכית. חותכים את הקצה הדיסטלי של micropipette לגודל נקבובית מתאים עבור כמות ה-DNA להיות מוזרק. השתמש במספריים כדי לחתוך את הקליפה העליונה האטומה כדי לפתוח מחדש חור, שני סנטימטרים וחצי קוטר, ולהגדיר את הביצה ביצית בתוך מיקרוסקופ סטריאו.הפקד כמה טיפות של פתרון PBS מוכן לתוך הביצה. באמצעות שני מטחנים עדין, לקלף את הממברנה allantoic מכסה את העובר, נזהר לא לגרום לדימום. לאחר מכן להסיר את amnion מהראש של העובר.בעת סיבוב הראש עם microspatula, להשתמש micropipette מחובר צינור יניקה, כדי להזריק בין 0.1 ו microliter אחד של ה-DNA הצבעוני לתוך חלל החדר של טקאטום אופטי שמאל. מניחים זוג מלקחיים סוג אלקטרודות סביב אזור היעד של טקאטום אופטי. השתמש במחולל הדופק כדי לטעון פעימה מוקדמת של 30 וולט למשך אלפית שנייה עם מרווח של חמש אלפיות שנייה, ולפולסים הבאים של שישה וולט במשך חמש אלפיות שנייה עם מרווח של 10 אלפיות שנייה.אחרי כל זה, לאטום את החור עם סרט, ולהמשיך דגירה ב 38 מעלות צלזיוס ו 70 אחוז לחות יחסית. משרים את האלקטרודות בכלי פלסטיק מלא PBS, ולהשתמש במברשת interdental כדי להסיר את האלבום. חזור על התהליך מחיתוך הקליפה הראשונית לאלקטרופוזיה עבור כל ביצה.יום אחד לפני תרבות Flat-Mount, החל להכין את תרבות התאים המקודדים הוסף על ידי הוספת autoclave למים מזוקקים לצלחת תרבות תאים 10 ס"מ. לצוף קצת תרבות תאים מוסיף על המים. בתתוצר המכיל שמונה מיקרוגרם למיליליטר למינין, ו-80 מיקרוגרם למיליליטר פולי L, הקפדה לכסות את ההוספות.אינקובט לילה ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור פחמן דו חמצני תרבות התא. ביום התרבות ב E7.0, הסיר את פתרון למינין ופולי l-ליסין מן הכנס. לאחר מכן, להעביר את הכנס לצלחת תחתית זכוכית מלא 1.1 מיליליטר של מדיום תרבות.מעבירים את המנה לתרבות התאים חממת פחמן דו חמצני ב 37 מעלות צלזיוס. הגדר יחידת תא לח על מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך עם זרימת גז של 40% חמצן ו 5% פחמן דו חמצני, וטמפרטורה של 38 מעלות צלזיוס. כדי להתחיל להכין דגימת רקמה על הכנס, להשתמש מדפים כדי לצבוט את הראש העובר לתוך צלחת תרבות תאים שישה סנטימטר המכיל HBSS קר כקרח.השתמש בשני מלקחיים עדין כדי לבודד את טקאטום אופטי אלקטרופולד. ואז להשתמש טפטפת פלסטיק להעביר אותו לתוך צלחת זכוכית קעורה מבוסס עם סיליקון שחור ומלא HBSS קר כקרח. בדוק את מיקום התיוג תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי פלואורסצנטי.באמצעות סכין מיקרו כירורגית, לחתוך את רקמת tectal המקיף את התיוג תוך שים קץ לכיוון הרקמה ב tectum. לאחר מכן, השתמש בטפטפת פלסטיק כדי להעביר את הרקמה המסוווית לתוספת כך שהצד של הסיכה מחובר לתוספת. מניחים את רקמת העצם בכיוון הרצוי ולהסיר כל HBSS עודף.חזור על תהליך הכנת הרקמה עבור כל דגימות רקמה אחרות המיועדות לאותו הכנס. לאחר מכן מניחים את המנה בתא המעוצב מראש של המיקרוסקופ הקונפוקל ההפוך. באמצעות מיקרוסקופ קונפוקל הפוך, לבדוק את תיוג פלואורסצנטי ולמקד את השדה המיקרוסקופי.הפעל את יחידת הקונפוקל בלייזר. דגימת סריקת הקונפוקל על מנת להתאים את הכיוון והמיקום של הרקמה לאורך צירי x ו- y בשדה. לאחר מכן, בחר את גודל הסריקה.החלט על מרווח הזמן והטווח הכולל של סריקת הקונפוקל לאורך ציר z. קח מרווח של חמישה או 10 מיקרומטר לטווח 100 מיקרומטר. בחר את מרווח הזמן של דימות הקונפוקל ואת משך הדימות הכולל.לאחר הגדרת הפרמטרים של התוכנית הפועלת על-ידי הקונפוקל, התחל בהדמיה. לאחר השלמת ההדמיה, שילבו את תמונות הקונפוקל בציר C שונה כדי להפיק תמונות מחסנית z עם התאמת מוקד סופית בכל נקודת זמן. לאחר מכן צרפו את תמונות המחסנית Z בנקודות זמן שונות כדי לבנות סרט לשגות בזמן.במחקר זה, נדידת תאים מזוהה בשכבות שטחיות באמצעות אלקטרופורציה באובו, תרבות תאי הרכבה שטוחה והדמיה קונפוקלית של זמן לשגות. התאים הנודדים באופן משיק והגרעין בשכבות השטחיות של הפקטום האופטי נראים כאן אפס שעות, תשע שעות, 18 שעות ו-27 שעות לאחר תחילת ההקלטה. סרט לשגות זמן של מרווחי זמן של 10 דקות על פני תקופה של 28 שעות ו 50 דקות, מראה את התנועה ההמונית של תאים נודדים ואת הגרעינים שלהם.הסרט הממוזג מראה בבירור את תנועת ההמונים של התאים הנודדים. הכיווניות של נדידת התאים יכולה להיבחן על ידי התמקדות בתאים המתפזרים מהמרכז המסווים לכל הכיוונים. התמונות הברורות של התנועה הגרעינית, מאפשר מעקב אוטומטי של ההגירה הגרעינית באמצעות תוסף מעקב חלקיקים.ניתן לדמיין שינויים זמניים במסלולי הנדידה המשיק ולהוכיח שההגירה המתפזרת היא רב-כיוונית. תמונות הגדלה גבוהות יותר ניתן לנקוט במרווחים של חמש דקות. כדי לחקור התנהגות תא בודדת עם השינוי המורפולוגי הרציף של התהליך המוביל, התהליך הנגרר והגרעין.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע תיוג של פעולות מאירות. כדי לענות על שאלות נוספות כמו מנגנוני ההנחיה של אקסום.

visualization-tangential-cell-migration-developing-chick-optic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

כאן אנו מתארים פרוטוקול לבחון את ההגירה של ותאי גלייה לתוך העין תסיסנית מתפתחות באמצעות ניתוח מיקרוסקופי לחיות יחד עם התאים GFP גליה מתויג.

הדמיה חיה של נדידת תאים גליה את הדיסק העין דמותי תסיסנית

מאמר זה מתאר תיוג פני...

מעקב אחר דפורמציות המוךפו&quot;גנטי שהולך רקמות בעובר צ&#39;יק מוקדם

מקור: Williams, A. L., et al. הדמיית זמן-lapse מרובת פוטונים כדי להמחיש התפתחות בזמן אמת: הדמיה של תאי פסגה עצבית נודדים בעוברי דג זברה. J. Vis. Exp. (2017)סרטון זה מציג פרוטוקול הדמיה מרובה פוטונים כדי לדמיין את הנדידה של תאי פסגה עצבית בעובר דג זברה בזמן אמת ברזולוציה גבוהה.

הדמיה של נדידת תאי פסגה עצבית בעובר דג זברה באמצעות הדמיית זמן-lapse מרובת פוטונים

פרוטוקול זה מציג שיטה יעילה להדמיה של נוירואפיתל עין גולם חי של דרוזופילה. שיטה זו מפצה על תנועת רקמות וטופולוגיה לא אחידה, משפרת את ההדמיה של גבולות התא באמצעות שימוש בחלבוני צומת מרובים המתויגים ב-GFP, ומשתמשת במתקן הדמיה המורכב בקלות.

Live-הדמיה של דרוזופילה גלמי עין

מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של גיליון אור היא כלי מצוין להדמיית התפתחות עוברית. הוא מאפשר הקלטה של סרטוני זמן-lapse ארוכים של עוברים חיים בתנאים כמעט פיזיולוגיים. אנו מדגימים את היישום שלו להדמיית התפתחות עין דג הזברה על פני קני מידה רחבים מרחביים-זמניים ומציגים צינור לאיחוי ודה-קונבולוציה של מערכי נתונים מרובי תצוגות.

באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי גיליון אור פיתוח תמונה דג הזברה העין

שילוב של טכניקות אופטי מתקדם של סריקת מיקרוסקופ עם זמן עירור קרינה פלואורסצנטית פוטון מרובה אורך גל לייזר בוצע כדי ללכוד דימות ברזולוציה גבוהה, תלת מימדי, בזמן אמת של הרכס העצבי הגירה ב Tg (sox10:EGFP) ו- Tg (foxd3:GFP) דג זברה עוברי.

פוטון רב זמן לשגות הדמיה כדי להמחיש את התפתחות בזמן אמת: ויזואליזציה של העברת תאי הרכס העצבי עוברי דג זברה

הvivo לשעבר פרוסה מאפשרת העצב outculמניע העצבים כדי להיות בתמונה בזמן אמת. פרוסות מופקים על ידי הטבעת e 10.5 איי. איי. או. עוברי העוברים ב-agarose, הפרוסות על הרטט, וגדלים בחממה בשלב העליון. התפקיד של מסלולים הדרכה אקסון מוערך על ידי הוספת מעכבי התקשורת התרבות.

לשעבר Vivo Oculomotor ניע את התרבות של מעובריים GFP-הביע עכברים עבור זמן הדמיה של מניע העצבי החיצוני

גנגוליה (CG) היא חלק ממערכת העצבים הפאראסימפתטית. תרבויות נוירואליות של אפרוח CG הנוירונים הוכחו להיות מודלים תא יעיל במחקר של אינטראקציות שרירים עצביים. אנו מתארים פרוטוקול מפורט עבור הניתוח, דיסוציאציה ותרבות מבחנה של CG נוירונים מ עוברי האפרוח.

בידוד ותרבות של צ'יק סילייון גנגליון נוירונים

פרוטוקול זה מתאר גישה לתיוג תותוג טומוטו והדמיה רב ממדית של התפתחות עיניים מוקדמות של דגי זברה. אנו מתארים תיוג, הטמעה והדמיה בארבעה ממדים (4D) באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית לסריקת לייזר, ושיקולים למיטוב רכישת ערכות נתונים לניתוח מנגנונים של מורפוגנזה של אופטית.

הדמיה תלת מימדית של מורפוגנזה של גביע זברה אופטי

כאן, פרוטוקול מסופק להדמיה בהילוך מהיר של מורפוגנזה עינית באמצעות מיקרוסקופ יריעת אור זמין מסחרית ותחנת עבודה לעיבוד תמונה כדי לנתח את הנתונים המתקבלים. פרוטוקול זה מפרט את ההליכים להרדמה עוברית, הטבעה באגרוז בטמפרטורת התכה נמוכה, השעיה בתא ההדמיה, הגדרת פרמטרי ההדמיה, ולבסוף ניתוח נתוני ההדמיה באמצעות תוכנת ניתוח תמונות.

הדמיה של מורפוגנזה עינית על ידי מיקרוסקופיה של גיליון אור באמצעות rx3:GFP דגי זברה מהונדסים

המאמר מסביר כיצד להסיר באופן כירורגי עיניים מזחלי דגי זברה חיים כצעד ראשון לקראת חקירת האופן שבו קלט רשתית משפיע על צמיחת והתפתחות של טקטום אופטי. בנוסף, המאמר מספק מידע על הרדמה של זחלים, קיבוע וכריתת מוח, ולאחר מכן אימונוהיסטוכימיה והדמיה קונפוקלית.

הסרת עיניים בזחלי דגי זברה חיים לבחינת גדילה והתפתחות תלויי עצבנות של מערכת הראייה

למד שיטות לסימון פלואורסצנטי של תאים נודדים ב-Tectum אופטי של עוברי תרנגולת באמצעות אלקטרופורציה ודימות time-lapse. טכניקה זו מאפשרת מעקב אחרי נדידת תאים בודדים וקולקטיבית לאורך זמן.

ויזואליזציה של נדידת תאים העוסקות ב Tectum אופטיים לפתח הבחורה

גלה סרטונים נוספים