Name: שיטת פעילות אנדוטוקסין לאיתור דם כולו אנדוטוקמיה בחולים חולי אנוש (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: למדו את פרוטוקול מדידת פעילות אנדוטוקסין בדם כולל של חולים במצב קריטי. שיטה זו מאפשרת זיהוי מוקדם של אנדוטוקסמיה ומסייעת בקבלת החלטות טיפוליות לשיפור תוצאות קליניות בחולי ספסיס.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לפאולו ברגנטה ולליסה מטיטן, לצורך בחינת מתודולוגיית הפרוטוקול. דריו וינטרטון, MD סיפק עזרה ניכרת בסקירת כתב היד עבור מיומנות בשפה האנגלית.

הפרוטוקול מתנהל בהתאם להנחיות המוסדיות הנוגעות לטיפול בדגימות אנושיות ולאחר הליכי הניתוח הסטנדרטיים הנוכחיים של המעבדה הקלינית שלנו. השימוש בנתוני EA ומידע קליני של חולים נבדק עוקב אחר ההנחיות של ועדת האתיקה של המחקר האנושי של המוסד שלנו.
1. ציוד מעבדה וערכת שיטת הערכה
<ol><li>אחסן את ערכת EA ב-2 – 8 ° צ' כאשר לא בשימוש.</li>
	<li>
כל מבחן EA מורכב 5 סוגים שונים של צינורות; השתמש בכל אחד מהם עבור חלק אחר של הבדיקה (ראה סעיף 2).
	<ol>
<li>השימוש הצינור1 (הצינור "שליטה") כדי למדוד את הפעילות הבזליים של פרץ חמצוני לא ספציפיים של החולה נויטרופילים בהעדר נוגדן ספציפי.</li>
		<li>השימוש צינור2 ("לדגום" צינור) כדי למדוד את פרץ חמצוני בתגובה לקומפלקס LPS-נוגדן.</li>
		<li>השימוש צינור3 ("מקס" צינור) כדי למדוד את פרץ חמצוני מקסימלי של החולה נויטרופילים בתגובה עודף אנדוטוקסין.</li>
		<li>השתמש ב4 הצינור ("LPS") כמקור של אנסוגני אנדוטוקסין.</li>
		<li>השתמש ב5 הצינור (מצנטר) לאחסון דם. הערה: כפילויות של צינורות1,2 ו3 מסופקים עבור סך של 8 צינורות לשימוש עבור כל דגימת דם נבדק (בקבוק מגיב EA ומבחן בקרת איכות ניתן להשתמש עבור כל הבדיקות הכלולות בכיס).</li>
	</ol>
</li>
	<li>לאסוף דגימות דם החולה בצינורות סטרילי המכיל נוגד קרישה EDTA. לאחסן דגימות דם בטמפרטורת החדר לפני הפעלת בדיקת EA.</li>
	<li>לפני תחילת הבדיקה, הפעל את כימומטר ואת שייקר החממה. חמם את החממה לטמפרטורה של 37 ° c.</li>
	<li>באופן אידיאלי, להתחיל לעבד את המדגם בתוך 30 דקות מאוסף הדם.</li>
</ol>2. שיטת פעילות אנדוטוקסין
<ol><li>הכן את צינורות הבדיקה EA עבור דגימת הדם של כל חולה אתה צריך לבדוק. . שימו את הצינורות בארונות הצינורות לאחר מכן הסר את האותיות.</li>
	<li>באמצעות combipipette, פיפטה a 1 mL נפח של מגיב EA מן הבקבוק לתוך צינורות1 (שפופרת הבקרה),2 (שפופרת לדוגמה) ו3 (שפופרת Max), כל אחד בשכפול. הערה: הפיפטה במורד הצד של הצינור כדי למנוע התזת התמיסה בחזרה.</li>
	<li>מערבבים את דגימת הדם של המטופל באמצעות היפוך עדין של צינור הדם במשך 20 פעמים. אז, פיפטה 0.5 mL של דם החולה לתוך הצינור4 (שפופרת LPS max) ו5 צינור (שפופרת Aliquot). . צינור מערבולת4 ל -10 ס מ</li>
	<li>לשים את מתלה הצינורות עם כל צינורות בדיקת EA ב שייקר החממה. סגור את המכסה ואת הדגירה עבור 10 דקות בטמפרטורה של 37 ° c.</li>
	<li>פתח את המכסה ולהסיר את ארונות הצינורות מתוך השייקר החממה. צינור מערבולת5 (שפופרת מצנטר). באמצעות עצה סטרילית, פיפטה 40 μL של דם לתוך צינורות1 ו2, בשכפול.</li>
	<li>צינור מערבולת4 (שפופרת LPS). שימוש באותו קצה הצינורות, פיפטה 40 μL של דם מצינור4 לתוך צינור3 (מקסימום שפופרת), בשכפול.</li>
	<li>מערבולת ששת צינורות הבדיקה הסופיים (1,2,3, וכפילויות המתאימות), ואז למקם אותם בחזרה לארונות שלהם. הערה: ודא כי כל הצינורות מורטים באותה כמות זמן.</li>
	<li>לשים את המדפים הצינור בחזרה לתוך שייקר הדגירה ולסגור את המכסה. להגדיר את שייקר הדגירה ב 100 סל ד, ואז להתחיל את התנועה 14 דקות.</li>
	<li>הכנס את כרטיס השבבים של EA עם התווית למטר הכימי והתחל בהקשה. אחרי 14 דקות דגירה, בצע את ההוראות המוצגות על כימומטר כדי לקרוא את צינורות EA בסדר הנכון.</li>
	<li>בעדינות מערבולת כל צינור 10 s לפני הצבת אותו על מחזיק המדגם של כימומטר. פתח את המגירה לדוגמה ומניחים את הצינור1 במחזיק הדגימה. לאחר מכן, סגור את המגירה לדוגמה והמתן לקריאה של יחידת האור היחסית (RLU).</li>
	<li>חזור על שלב 2.10 עבור צינור 2 ושפופרת 3.</li>
	<li>חזור על שלב 2.10 עבור צינורות כפולים 1, 2, ו-3. הערה: נסה מערבולת כל הצינורות לאותו כמות זמן במהלך השלבים 2.10 – 2.12.</li>
	<li>לאחר כל הצינורות עובדו, שים לב כי תוצאות EA יחושב ויודפס באופן אוטומטי. רמות מבוטאים כיחידות EA ומייצגות את הממוצע של דטרמינציות כפולות מאותן דגימות.</li>
	<li>חזור על שלבים 2.2 כדי 2.13 עבור כל דגימת דם שצריך להיבדק.</li>
	<li>לאחר השלמת הבחינה, לאחסן את צינורות הבדיקה הנותרים וריאגנטים EA ב 2 – 8 ° צ' עבור עד 30 ימים.</li>
</ol>

<ol><li>Akira, S., Takeda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor signalling.</a> Nature Reviews Immunology. 4 (7), 499-511 (2004).</li>
<li>Takeda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+and+integration+of+innate+immune+recognition+systems%3A+the+Toll-like+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Endotoxin+Research%22%5BJournal%5D)">Evolution and integration of innate immune recognition systems: the Toll-like receptors.</a> Journal of Endotoxin Research. 11 (1), 51-55 (2005).</li>
<li>Ulevitch, R. J., Tobias, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+gram-negative+bacteria+and+endotoxin+by+the+innate+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Recognition of gram-negative bacteria and endotoxin by the innate immune system.</a> Current Opinion in Immunology. 11 (1), 19-22 (1999).</li>
<li>Natanson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endotoxin+and+tumor+necrosis+factor+challenges+in+dogs+simulate+the+cardiovascular+profile+of+human+septic+shock%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Endotoxin and tumor necrosis factor challenges in dogs simulate the cardiovascular profile of human septic shock.</a> The Journal of Experimental Medicine. 169 (3), 823-832 (1989).</li>
<li>Suffredini, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cardiovascular+response+of+normal+humans+to+the+administration+of+endotoxin%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">The cardiovascular response of normal humans to the administration of endotoxin.</a> The New England Journal of Medicine. 321 (5), 280-287 (1989).</li>
<li>Singer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Third+International+Consensus+Definitions+for+Sepsis+and+Septic+Shock+%28Sepsis-3%29%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%3A+The+Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">The Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3).</a> JAMA: The Journal of the American Medical Association. 315 (8), 801-810 (2016).</li>
<li>Gupta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture-Negative+Severe+Sepsis%3A+Nationwide+Trends+and+Outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">Culture-Negative Severe Sepsis: Nationwide Trends and Outcomes.</a> Chest. 150 (6), 1251-1259 (2016).</li>
<li>Ikeda, T., Ikeda, K., Suda, S., Ueno, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Usefulness+of+the+endotoxin+activity+assay+as+a+biomarker+to+assess+the+severity+of+endotoxemia+in+critically+ill+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Innate+Immunity%22%5BJournal%5D)">Usefulness of the endotoxin activity assay as a biomarker to assess the severity of endotoxemia in critically ill patients.</a> Innate Immunity. 20 (8), 881-887 (2014).</li>
<li>Dellinger, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Targeted+Polymyxin+B+Hemoperfusion+on+28-Day+Mortality+in+Patients+With+Septic+Shock+and+Elevated+Endotoxin+Level%5BTitle%5D)+AND+%22The+EUPHRATES+Randomized+Clinical+Trial.+JAMA%3A+The+Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Effect of Targeted Polymyxin B Hemoperfusion on 28-Day Mortality in Patients With Septic Shock and Elevated Endotoxin Level.</a> The EUPHRATES Randomized Clinical Trial. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 320 (14), 1455-1463 (2018).</li>
<li>Marshall, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+and+prognostic+implications+of+endotoxemia+in+critical+illness%3A+results+of+the+MEDIC+study%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Diagnostic and prognostic implications of endotoxemia in critical illness: results of the MEDIC study.</a> The Journal of Infectious Diseases. 190 (3), 527-534 (2004).</li>
<li>Levin, J., Bang, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clottable+protein+in+Limulus%3B+its+localization+and+kinetics+of+its+coagulation+by+endotoxin%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+et+Diathesis+Haemorrhagica%22%5BJournal%5D)">Clottable protein in Limulus; its localization and kinetics of its coagulation by endotoxin.</a> Thrombosis et Diathesis Haemorrhagica. 19 (1), 186-197 (1968).</li>
<li>Marshall, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+endotoxin+activity+in+critically+ill+patients+using+whole+blood+neutrophil+dependent+chemiluminescence%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Care%22%5BJournal%5D)">Measurement of endotoxin activity in critically ill patients using whole blood neutrophil dependent chemiluminescence.</a> Critical Care. 6 (4), London, England. 342-348 (2002).</li>
<li>Grimaldi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Level+of+Endotoxemia+Following+Out-of-Hospital+Cardiac+Arrest+Is+Associated+With+Severity+and+Duration+of+Postcardiac+Arrest+Shock%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">High Level of Endotoxemia Following Out-of-Hospital Cardiac Arrest Is Associated With Severity and Duration of Postcardiac Arrest Shock.</a> Critical Care Medicine. 43 (12), 2597-2604 (2015).</li>
<li>Klein, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+EUPHRATES+trial+%28Evaluating+the+Use+of+Polymyxin+B+Hemoperfusion+in+a+Randomized+controlled+trial+of+Adults+Treated+for+Endotoxemia+and+Septic+shock%29%3A+study+protocol+for+a+randomized+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Trials%22%5BJournal%5D)">The EUPHRATES trial (Evaluating the Use of Polymyxin B Hemoperfusion in a Randomized controlled trial of Adults Treated for Endotoxemia and Septic shock): study protocol for a randomized controlled trial.</a> Trials. 15, 218(2014).</li>
<li>Bottiroli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+and+clinical+significance+of+early+high+Endotoxin+Activity+in+septic+shock%3A+An+observational+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Critical+Care%22%5BJournal%5D)">Prevalence and clinical significance of early high Endotoxin Activity in septic shock: An observational study.</a> Journal of Critical Care. 41, 124-129 (2017).</li>
<li>Kaukonen, K. M., Bailey, M., Suzuki, S., Pilcher, D., Bellomo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mortality+related+to+severe+sepsis+and+septic+shock+among+critically+ill+patients+in+Australia+and+New+Zealand%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%3A+The+Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Mortality related to severe sepsis and septic shock among critically ill patients in Australia and New Zealand.</a> JAMA: The Journal of the American Medical Association. 311 (13), 1308-1316 (2014).</li>
<li>Biagioni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endotoxin+activity+levels+as+a+prediction+tool+for+risk+of+deterioration+in+patients+with+sepsis+not+admitted+to+the+intensive+care+unit%3A+a+pilot+observational+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Critical+Care%22%5BJournal%5D)">Endotoxin activity levels as a prediction tool for risk of deterioration in patients with sepsis not admitted to the intensive care unit: a pilot observational study.</a> Journal of Critical Care. 28 (5), 612-617 (2013).</li>
<li>Roth, R. I., Levin, F. C., Levin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+detection+of+bacterial+endotoxin+in+plasma+with+the+Limulus+test%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Laboratory+and+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Optimization of detection of bacterial endotoxin in plasma with the Limulus test.</a> The Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 116 (2), 153-161 (1990).</li>
<li>Yaguchi, A., Yuzawa, J., Klein, D. J., Takeda, M., Harada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+intermediate+levels+of+the+Endotoxin+Activity+Assay+%28EA%29+with+other+biomarkers+in+the+assessment+of+patients+with+sepsis%3A+results+of+an+observational+study%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Care%22%5BJournal%5D)">Combining intermediate levels of the Endotoxin Activity Assay (EA) with other biomarkers in the assessment of patients with sepsis: results of an observational study.</a> Critical Care. 16 (3), London, England. (2012).</li>
<li>Earley, Z. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burn+Injury+Alters+the+Intestinal+Microbiome+and+Increases+Gut+Permeability+and+Bacterial+Translocation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Burn Injury Alters the Intestinal Microbiome and Increases Gut Permeability and Bacterial Translocation.</a> PLoS One. 10 (7), (2015).</li>
<li>Munster, A. M., Smith-Meek, M., Dickerson, C., Translocation Winchurch, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidental+phenomenon+or+true+pathology%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Incidental phenomenon or true pathology?</a> Annals of Surgery. 218 (3), 321(1993).</li>
<li>Clementi, A., Virzì, G. M., Brocca, A., Ronco, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Endotoxin+in+the+Setting+of+Cardiorenal+Syndrome+Type+5%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiorenal+Medicine%22%5BJournal%5D)">The Role of Endotoxin in the Setting of Cardiorenal Syndrome Type 5.</a> Cardiorenal Medicine. 7 (4), 276-283 (2017).</li>
<li>Virzì, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiorenal+Syndrome+Type+5+in+Sepsis%3A+Role+of+Endotoxin%5BTitle%5D)+AND+%22in+Cell+Death+Pathways+and+Inflammation.+Kidney+and+Blood+Pressure+Research%22%5BJournal%5D)">Cardiorenal Syndrome Type 5 in Sepsis: Role of Endotoxin.</a> in Cell Death Pathways and Inflammation. Kidney and Blood Pressure Research. 41 (6), 1008-1015 (2016).</li>
<li>Mignon, F., Piagnerelli, M., Van Nuffelen, M., Vincent, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+empiric+antibiotic+treatment+on+plasma+endotoxin+activity+in+septic+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Infection%22%5BJournal%5D)">Effect of empiric antibiotic treatment on plasma endotoxin activity in septic patients.</a> Infection. 42 (3), 521-528 (2014).</li>
<li>Klein, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Daily+variation+in+endotoxin+levels+is+associated+with+increased+organ+failure+in+critically+ill+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Daily variation in endotoxin levels is associated with increased organ failure in critically ill patients.</a> Shock. 28 (5), 524-529 (2007).</li>
</ol>

מלון אסטאו ספא כיסה את עלות הפרסום ודמי ההפקה של היומן. למחברים אין קונפליקטים של עניין לגלות.

הלם ספיגה עדיין משויך כיום לתמותה גבוה כמו 40%, למרות שיעור זה משתנה בהתאם לדוחות נחשב16. הצורך הרומן ובסמנים טוב יותר הוא דגלו על ידי רוב המומחים בתחומים כדי לסייע מטפלים באבחון מוקדם, ניהול טוב יותר, והתחזיות של חולים עם הלם ספיגה6.
ביצוע מבחן EA אינו דורש ידע טכני קודם או ציוד מעבדה מתוחכם, וכל ספק בריאות יכול בקלות ובמהירות ללמוד כיצד להפעיל אותו. זיהוי הבקשה של EA במחזור גבוה עשוי לעזור בסיכון של החולה שתקן, המפעיל גישה טיפולית מוקדם ואגרסיב...

ליפופוליסכריד (LPS), הידוע גם בשם אנדוטוקסין, הוא רכיב מפתח של מבנה הממברנה של חיידקים גראם שליליים (GN). זה מפצה על 10% של קיר התא, להיות חיוני עבור שלמות הקרום החיצוני הומאוסטזיס. יתר על כן, הוא activator חזק של המארח מולדת המערכת החיסונית1,2.
בחשיפה מחוץ לגופית של תאי מערכת החיסונית מולדים ל-LPS מוביל שינויים בביטוי של גנים מרובים3. המינהל של כמויות קטנות מאוד של lps במתנדבים אנושיים בריאים מפעיל את המפל של דלקת מערכתית חריפה, בעוד אלח דם והתחשמלות עלול להתעורר עם ריכוזי אנדוטוקסין גבוהה יותר4,5.
אלח דם הוא מצב מסכן חיים אשר, אם לא מזוהה מיד, יכול להוביל לכישלון רב איברים ומוות. חולים ספיגה חייב להיות מטופלים בזמן, עם החייאה אגרסיבי, טיפול אנטיביוטי נאותה, בקרת מקור אופטימלית, ואסטרטגיות הנחיה תמיכה איברים. האבחנה של האטיולוגיה של אלח דם מבוססת בעיקר על זיהוי קליני וזיהוי הפתוגן מבוסס התרבות6. עם זאת, תוצאות של תרבויות מיקרוביאלית יכול לקחת עד 48 h ולא חד-משמעית של עד 30% מהמקרים7. הזדהות מוקדמת והתערבות עלולה להוביל לתוצאות מטופלים טובות יותר. בחולים בהם מחשוד אלח דם, החלטות מתקבלות לעתים קרובות על בסיס פרמטרים פיזיולוגיים וביוכימיים, ללא סימן ברור לאנדוטוקסין.
המדידה של פעילות אנדוטוקסין (EA) ניתן להשיג באמצעות שיטת מסחרית (ראה טבלת חומרים) בדם שלם. זה יכול לשמש בסמנים של אנדוספמיה מערכתית עבור ריבוד מוקדם של חומרת המחלה, במיוחד בחולים בסיכון לפיתוח הלם ספיגה8. הטיפול שימש כדי להנחות Polymyxin B הרבה תרפיה לאחרונה שפורסמה פעמיים סמיות מבוקר אקראי ניסוי קליני בחולים עם הלם ספיגה9. בחולים חולי נפש, המחקר מדיק הראה מוגברת רמות EA להיות משויך לתפקוד איברים מרובים, יחידת טיפול נמרץ (טיפול נמרץ) אורך של שהייה, ואת התמותה10.
שונה מאוד. שיטת Limulus אמבות ליפוסט (לל א), כמו ג'ל-קריש, turbidimetric, או מבחן כרומוגניים, כבר הרבה יותר מאומץ לעתים קרובות להערכת הנסיוב האנדוטוקסין. הוא מבוסס על היכולת של אנדוטוקסין כדי לגרום קרישה של המוליש של סרטן הפרסה, לימוליוס פוליפהימוס. עם זאת, לבחינה זו יש מגבלות מסוימות במונחים של ספציפיות. בפרט, זה יכול להיות גם מופעל על ידי מוצרים מחיידקים אחרים מאשר אנדוטוקסין, כגון רכיבים של הקיר תא פטרייתי, וזה יכול להיות מעוכב על ידי חלבונים שונים פלזמה האדם11.
בעשור האחרון המדידה של EA פותחה ואומתה בתור ביואריקר של במחזור אנדוטוקסין. לעומת מבחן לל א, EA הוא מהיר וקל יותר ליישם בסביבה הקלינית. יתר על כן, זה הוכח להיות מדויק יותר מאשר בדם שלם, עם רגישות מוגברת וספציפיות, הן מבחנה ב vivo12.
למרות היישום הראשוני שלה ככלי אבחון מוקדם לזיהוי מהיר של חיידקים GN כמו סוכנים סיבתי אלח דם, רמת EA גם נחקרו בתור ביוארקר של חומרת המחלה. בהקשר זה, זה הוכח להיות שימושי במיוחד כדי להעריך את מצב זילוח בשל מחלה קריטית שוטפת, כגון הלם ספיגה או תסמונת לאחר הלב מעצר13. לאחרונה, מאז התפתחות מערכות המופיליה, תוצאת EA חיובית הוצע גם ככלי סינון כדי לזהות במדויק מועמדים פוטנציאליים עבור טיפול כזה14. ערכנו לאחרונה מחקר התצפית רטרוספקטיבי על שכיחות ומשמעות קלינית של רמות גבוהות מוקדם של EA ב 107 חולים עם הלם ספיגה. בשורה עם תוצאות אחרונות אחרות, גילינו כי EA הוא סמן מבטיח של חומרת המחלה בחולים עם הלם ספיגה15.
מטרת כתב היד הנוכחי היא לתאר את השיטה לביצוע שיטת EA, במיטה או במעבדה, ולתאר את השימוש הפוטנציאלי שלה בתרחיש מייצג של הלם זיהומי. טכניקה זו יכולה לזהות את הפעילות LPS על ידי מדידת פרץ חמצוני משופר ב נויטרופילים בעקבות הטרמה שלהם על ידי מכלולי אנטי-אנדוטוקסין נוגדן ו-LPS. פרץ הנשימה המוגבר מזוהה על ידי כימומטר וכמות האור הנפלט נחשבת פרופורציונלית לכמות האנדוטוקסין בדגימת הדם. הצורך מחייב כמה ריאגנטים, לוקח בערך 30 דקות לבצע ומשתמש מעט כמו 40 μL של דם שלם12.

<table><tbody><tr><td>ערכת EAA</td><td>ספקטרל מדיקל בע"מ</td><td>חבילת EAAST-20</td><td>עם 20 בדיקות + 1 בקרת איכות</td></tr><tr><td>Smart Line TL</td><td>Berthold</td><td>EAASL</td><td>שייקר אינקובטור לומינומטר</td></tr><tr><td></td><td>GRANT</td><td>ES-20</td><td>שייקר מיני אינקובטור</td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>VWR</td><td>444-2790</td><td>מכשיר מערבולת</td></tr></tbody></table>

שיטת פעילות אנדוטוקסין לאיתור דם כולו אנדוטוקמיה בחולים חולי אנוש

Endotoxin Activity Assay for the Detection of Whole Blood Endotoxemia in Critically Ill Patients

ליפופוליסכריד, הידוע גם בשם אנדוטוקסין, הוא מרכיב בסיסי של חיידקים גראם שליליים וממלא תפקיד מכריע בפיתוח אלח דם והתחשמלות. הזיהוי המוקדם של תהליך מידבק המתפתח במהירות למחלה קריטית עשוי לבקש טיפול מהיר ואינטנסיבי יותר, ובכך עלול להוביל לתוצאות מטופלים טובים יותר. פעילות אנדוטוקסין (EA) ניתן להשתמש במיטה כסמן אמין של אנדוטוקסין מערכתית. הזיהוי של רמות פעילות אנדוטוקסין מוגבר הוכח שוב ושוב להיות משויך חומרת מחלה מוגברת אצל חולים עם אלח דם והתחשמלות. התהליך מהיר וקל לביצוע. בקצרה, לאחר הדגימה, מעורב של דם שלם מעורבב עם נוגדן אנטי אנדוטוקסין ועם LPS הוסיף. הפעילות האנדוטוקסין נמדדת כפרץ חמצוני יחסי של בינויטרופילים כפי שזוהה על ידי chemioluminescence. תפוקת הספק מתבטאת בקנה מידה מ -0 (נעדר) ל-1 (מקסימלי) ומסווגים כ-"נמוך" (< 0.4 יחידות), "ביניים" (0.4 – 0.59 יחידות), או "גבוהה" (≥ 0.6 יחידות). המתודולוגיה והרציונל המפורטים למימוש שיטת EA מדווחים בכתב יד זה.

גבר בן 72 הוסמך למחלקה לשעת חירום (ED) של בית חולים עירוני אקדמי. כמה ימים קודם לכן הוא הציג לרופא המטפל העיקרי שלו מתלונן על שריפת שתן. טיפול קצר במסלול עם פוספומצין אוראלי היה מומלץ. ההיסטוריה הרפואית שלו כללה יתר לחץ דם, סוכרת סוג 2 מסובכת היפרפלזיה שפיר של הערמונית. התרופות שלו כללו enalapril, atorvastatin, טאמסוולוסין ומטפורמין.
בשנת ED, הוא היה אדיש, מבולבל כאשר התעורר. הטמפרטורה שלו הייתה 39.1 ° c, שיעור הלב היה 125 פעימו...

בזאת אנו מציגים פרוטוקול למדוד במיטה את פעילות האנדוטוקסין של דגימות הדם האנושיות. הבדיקה של פעילות אנדוטוקסין היא מבחן פשוט לבצע והוא עשוי להיות ביוארקר שימושי בחולים באורח אנוש חולה עם אלח דם.

Lipopolysaccharide, also known as endotoxin, is a fundamental component of gram-negative bacteria and plays a crucial role in the development of sepsis ...

אלח דם יכול להוביל לכשל רב איברים ומוות. אנדוטוקסין הוא מרכיב בסיסי של חיידקים גרם שלילי. רמות גבוהות במחזור של אנדוטוקסין עשוי לזהות חולה בסיכון גבוה יותר לפתח מחלה חמורה יותר.אנדוטוקסין פעילות Assay יכול לשמש סמן ביולוגי פשוט, מהיר ואמין של אנדוטוקסמיה מערכתית. הגילוי המוקדם של רעלן זה עשוי לעזור לרופאים בטיפול בחולים עם הלם ספיגה. בחולה עם הלם ספיגה, הזיהוי המוקדם של מצב המתפתח במהירות עשוי לגרום לטיפול מהיר ואינטנסיבי יותר בתמיכה בחיים, מה שעלול להוביל לתוצאות טובות יותר.הפגנת הליך זה תהיה ליסה מתיאסן, ביולוגית מולקולרית שמשתפת פעולה עם קבוצת המחקר שלנו. כדי להתחיל בהליך זה, הגדר ערכת בדיקה של EA ופרק את חמשת הסוגים השונים של צינורות. השתמש צינור מספר אחד, צינור הבקרה, כדי למדוד את הפעילות הבסיסית של פרץ חמצוני לא ספציפי של נויטרופילים של המטופל בהיעדר נוגדן מסוים.השתמש צינור מספר שתיים, צינור מדגם, כדי למדוד את פרץ חמצוני בתגובה לתסביך LPS-נוגדנים. השתמש צינור מספר שלוש, צינור מקס, כדי למדוד את פרץ חמצוני מקסימלי של נויטרופילים של המטופל בתגובה עודף של אנדוטוקסין. השתמש צינור מספר ארבע, צינור LPS, כמקור של אנדוטוקסין אקסוגני.ולהשתמש בצינור מספר חמש, צינור Aliquot, לאחסון דם. לאסוף דגימות דם החולה צינורות סטריליים המכילים נוגד קרישה EDTA, ולאחסן אותם בטמפרטורת החדר לפני הפעלת הבדיקה EA. לפני תחילת הבדיקה, להפעיל את chemiluminometer ואת שייקר אינקובטור לחמם את החממה ל 37 מעלות צלזיוס.ראשית, מניחים את צינורות EA לשימוש במדפים צינור, ולהסיר את הכובעים. השתמש combipipette להעביר מיליליטר אחד של ריאגנט EA מהבקבוק לצינורות מספר אחד, מספר שתיים, ומספר שלוש על ידי צינורות בצד של הצינורות. בעדינות להפוך את צינור איסוף הדם 20 פעמים כדי לערבב את דגימת הדם של המטופל.ואז, פיפטה 0.5 מיליליטר של דם מטופל לצינור מספר ארבע וצינור מספר חמש. צינור וורטקס מספר ארבע במשך 10 שניות. מניחים את מתלי הצינור עם כל מבחנות EA לתוך שייקר החממה.סוגרים את המכסה, ודגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. לאחר מכן, לפתוח את מכסה החממה ולהסיר את מתלי הצינור מן השייקר. צינור וורטקס מספר חמש.באמצעות קצה סטרילי, פיפטה 40 microliters של דם לתוך צינורות מספר אחד ומספר שתיים, בשכפול. צינור וורטקס מספר ארבע. באמצעות אותו קצה פיפטה, להעביר 40 microliters של דם מצינור מספר ארבע לצינור מספר שלוש, בשכפול.וורטקס שש המבחנות האחרונות אחת אחרי השניה. מניחים את מתלי הצינור בחזרה לתוך שייקר הדגירה, ולסגור את המכסה. הגדר את השייקר ל 100 סל"ד, ולהתחיל את התנועה במשך 14 דקות.הכנס את כרטיס השבב המסווים של EA לתוך הכימותרפיה והקש Start. לאחר הדגירה של 14 דקות, בצע את ההוראות המוצגות על כימלומינומטר. בעדינות מערבולת כל צינור במשך 10 שניות לפני הנחת אותו על מחזיק המדגם של chemiluminometer.פתח את המגירה לדוגמה, והצב צינור מספר אחד לתוך מחזיק הדגימה. לאחר מכן, סגור את מגירה לדוגמה והמתן לקריאת יחידת האור היחסית. חזור על תהליך קריאה זה עבור צינורות 2 ו- 3 וכל הכפילויות, כמתואר בפרוטוקול הטקסט.לאחר שכל הצינורות עובדו, תוצאות EA יחושבו וידפסו באופן אוטומטי. חזור על כל תהליך הבדיקה עבור כל דגימת דם שיש לבדוק. אחסן את ערכת EA Assay ואת מרכיביה בחבילה האטומה המקורית בטמפרטורה שבין שתיים ל -25 מעלות צלזיוס.במחקר זה, אנדוטוקסין פעילות Assay מבוצעת כדי לזהות אנדוטוקסמיה דם שלם בחולים אנושים. ערך EA של פחות מ 0.40 יחידות EA מציין רמת פעילות אנדוטוקסין נמוכה, שווה ריכוז LPS במחזור נמוך, המייצג סיכון נמוך להתקדמות למצב מחלה חמורה. תוצאה בין 0.40 ל 0.59 יחידות EA מצביעה על רמת פעילות אנדוטוקסין ביניים, המהווה סיכון ביניים להתפתחות אלח דם חמור והלם ספיגה.תוצאות שוות או גדולות מ- 0.60 יחידות EA מצביעות על רמת פעילות אנדוטוקסין גבוהה, המייצגת סיכון גבוה להלם ספיגה ולתוצאות גרועות של המטופל. דם מצינורות מספר ארבע וחמש חייב להיות מעורבב עם המבחנה הנכונה. יש לנקוט בזהירות נוספת כדי לבצע את הסדר הנכון המצוין בפרוטוקול.כל צינור מנוהל בכפילויות, מה שעלול להוביל לטעויות בשלב זה. לאחר הצגתו, EA Assay הוצע כסמן ביולוגי עבור ריבוד הסיכון של המטופל עם hypoperfusion מערכתית. כמו כן, הוא נחקר כמבחן סינון כדי לבחור חולים עבור אסטרטגיות טיפול hemopurification מתקדם.

endotoxin-activity-assay-for-detection-whole-blood-endotoxemia

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

אנו מתארים immunoassay פשוט למדוד את הייצור של ציטוקינים דלקתיים הפרו, כגון ייצור IL-1 בטא, בחולים עם הצגת פנוטיפים autoinflammatory. על ידי הפעלת התאים בתרביות דם שלם עם הפתוגן הקשורים דפוסי מולקולרית, במיוחד עם lipopolysaccharide, הפרשת ציטוקינים ניתן להעריך בנוחות supernatants הדם כולו.

מדידה מדויקת ופשוטה 1β-IL Pro-ציטוקין דלקתי באמצעות גירוי Assay Whole Blood

סרטון זה מדגים בדיקה ביולוגית מהירה לחקירת פעילות אנדוטוקסין בדגימת דם שלמה באמצעות שיטה מבוססת כימילומינסנציה. בדיקה זו היא בדיקת סמן ביולוגי מהירה ורגישה לאבחון בשלב מוקדם של אלח דם בתיווך אנדוטוקסין.

בדיקת פעילות אנדוטוקסין: בדיקה ביולוגית מבוססת כימילומינסנציה לחקר פעילות אנדוטוקסין בדגימת דם

סרטון וידאו זה מתאר את הפורמט הטורבידימטרי של בדיקת Limulus amoebocyte lysate, או LAL, כדי להעריך זיהום אנדוטוקסין בננו-פורמולציות דוקסורוביצין ליפוזומליות PEGylated. העכירות של התמיסה בעקבות התגובה של האנדוטוקסין עם מגיב LAL מסייעת להעריך את האנדוטוקסין בדגימה.

Turbidimetric Limulus Amoebocyte Lysate Assay: טכניקה לזיהוי וכימות זיהום אנדוטוקסין בתרופות ננו

סרטון זה מתאר בדיקת קריש ג'ל כדי לקבוע את נוכחותם של אנדוטוקסינים חיידקיים בננו-פורמולציות באמצעות Limulus Amoebocyte Lysate שמקורו בתאי הדם של סרטני פרסה. הבדיקה מסייעת לבדוק זיהום אנדוטוקסין של מוצרים פרמצבטיים, כולל פורמולציות מבוססות ננו.

בדיקת ג'ל-קריש לימולוס אמבוציטים ליזט: שיטה לזיהוי אנדוטוקסין חיידקי בפורמולציות ננו-חלקיקים

סרטון זה מדגים בדיקה לבחינת הפעילות התלויה בקולטן דמוי אגרה (TLR) של גורמי השעתוק גורם גרעיני-קאפה-B (NF-κB) וחלבון מפעיל -1 (AP-1) במקרופאגים. ה-TLRs מפעילים מפל איתות פרו-דלקתי בעת זיהוי דפוסים מולקולריים הקשורים לנזק (DAMPs), ומפעילים NF-κB ו-AP-1. המקרופאגים המהונדסים מייצרים אנזים אלקליין פוספטאז עוברי מופרש (SEAP) בהפעלת NF-κB ו-AP-1, אשר מזוהה באמצעות תגובה כרומוגנית.

בדיקה עבור NF-&kcy--תלוי TLR;B/AP-1 איתות גורם שעתוק במקרופאגים

שני ניתוחים משלימים של חלקיקים ביולוגיים אטמוספריים ממסננים שנדגמו באוויר מתוארים כאן: מיצוי וזיהוי של אנדוטוקסין ושל DNA.

Air-שנדגמו ניתוח סינון עבור אנדוטוקסינים ותוכן DNA

מתן תוך ורידי של אנדוטוקסין מעורר באופן מהימן שינויים פיזיולוגיים ואימונולוגיים תלויי מינון התואמים למספר מצבים פתולוגיים. גישה רדוקציוניסטית זו מאפשרת חקירה, מידול ושינוי ניסיוני של דלקת מערכתית והשפעותיה במורד הזרם באדם.

תוך ורידי אנדוטוקסינים אתגר בריא לבני אדם: פלטפורמה ניסויית לחקור ולווסת דלקת מערכתית

זיהוי של endotoxins של ננו-חומרים מהונדסים מייצג אחד האתגרים הגדול ביותר בתחום של ננו-רפואה. כאן, אנו מציגים חקר מקרה המתארת את המסגרת המורכבת LAL שלושה פורמטים שונים כדי להעריך את פוטנציאל זיהום אנדוטוקסין בחלקיקים.

זיהוי של אנדוטוקסין ניסוחים-Nano באמצעות מבחני Lysate (LAL) Amoebocyte Limulus

כאן אנו מציגים מודל אנדוטוקסין מוכוון יחידת טיפול נמרץ בחולדות.

מודל אנדוטוקסין מוכוון יחידת טיפול נמרץ הניתנת לשחזור בחולדות

כאן אנו מתארים בדיקת פעילות רקמת שלפוחית חוץ-תאית בבית. בדיקות מבוססות פעילות ובדיקות מבוססות אנטיגן שימשו למדידת גורם רקמה בשלפוחיות חוץ-תאיות מדגימות פלזמה אנושיות. לבדיקות מבוססות פעילות יש רגישות וספציפיות גבוהות יותר מאשר בדיקות מבוססות אנטיגן.

בדיקת פעילות גורם רקמת שלפוחית חוץ-תאית

למדו את פרוטוקול מדידת פעילות אנדוטוקסין בדם כולל של חולים במצב קריטי. שיטה זו מאפשרת זיהוי מוקדם של אנדוטוקסמיה ומסייעת בקבלת החלטות טיפוליות לשיפור תוצאות קליניות בחולי ספסיס.

שיטת פעילות אנדוטוקסין לאיתור דם כולו אנדוטוקמיה בחולים חולי אנוש

גלה סרטונים נוספים