מחקר בו זמנית של הגיוס של מונוציט Subpopulations תחת זרימה במבחנה

עבור שיטה זו יכול לעזור לענות על שאלת מפתח בתחום של דלקת ואימונולוגיה. לדוגמה, מהו המנגנון המולקולרי של הידבקות לויוציט והגירה טרנס-אנדותל. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת אפליה ללא הגבלה בין טרנסמיגנציה ותוספת חזקה של מונוציטים למונולייה אנדותל.

למרות ששיטה זו מספקת מידע על גיוס מונוציטים על הזרימה, ניתן להתאים אותה גם לתאים אחרים של המערכות ההמוטופייטיות כגון תאי T, תאי B או נגזרות של תת-תפוקה שלהם. לאחר הכביסה, סמן את תאי האנדותל של וריד הטבור האנושי או HUVEC עם 30 מיקרוליטרים של 37 מעלות צלזיוס M199 בינוני בתוספת CMFDA מיקרומולרי אחד במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. בסוף הדגירה, לשטוף את התאים עם 150 microliters של מדיום M199 להשלים דגירה התרבות ב 150 microliters של מדיום M199 שלם טרי במשך 30 דקות נוספות.

לאחר מכן החלף את העל-טבעי ב-150 מיקרוליטרים של מדיום M199 שלם המכיל את תוספי הניסוי המתאימים והחזר את תרבות תא השקופיות לאנקובטור למשך שש שעות. עבור בידוד מונוציטים PAN אנושי, לדלל דגימת דם שנאספה טרי PBS בתוספת EDTA מילימולר אחד ביחס אחד לאחד בזהירות שכבה 20 מ"ל של פתרון הדם על 20 מ"ל של בינוני שיפוע צפיפות עבור הפרדה הדרגתית צפיפות על ידי צנטריפוגה. לאסוף את שכבת טסיות הדם המונונוקלארית של הדם ההיקפי באמצע לתוך צינור חדש 50 מ"ל המכיל 40 מ"ל של PBS בתוספת 1 מילימולאר EDTA ולהביא את הנפח הסופי ל 50 מ"ל עם PBS-EDTA נוסף לאחר הספירה, לבודד את המונוציטים עם ערכת בידוד מונוציטים PAN על פי הוראת היצרן.

ולשטוף את התאים שלוש פעמים M199 בינוני בתוספת 0.5% בסרום Bovine אלבומין, או BSA, כדי לחסל את כל עקבות של EDTA. איכות בידוד המונוציטים חיונית להבטחת תוצאות חזקות של גילום והיתוך. לכן חשוב להקפיד על המלצת היצרן לבידוד.

לחץ מחדש על גלולה ב 6 פעמים 10 כדי 6 מונוציטים לכל ריכוז מיליליטר טרי M199 בינוני בתוספת 0.5% BSA ולחלק את התאים אחד 200 microliter aliquot לכל צינור מיקרוצנטריפוגה לכל בדיקה גיוס. ואז למקם את התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות לפני הזריקה שלהם לתוך תא הזרימה. כדי להכין את המערכת הנוזלית לניתוח, הכנס תחילה מחבר לואר זכר לקצה אחד של חתיכת צינור סיליקון בעובי 8 ס"מ באורך 3 מ"מ וחבר את הקצה השני לסט הזרקת לואר מוטבע.

לאחר מכן חבר את המחבר luer לקצה אחד של 40 ס"מ ארוך 3 מ"מ עבה חתיכת צינורות סיליקון. לאחר מכן, המזרק 20 מ"מ לקצה אחד של 1 מ 'ארוך 3mm עבה חתיכת צינורות סיליקון ולהכניס מחבר luer זכר לקצה השני. לאחר מכן הכניסו את שני מחברי הלואר הזכרים למוביסטר מנעול לואר נקבה והכניסו את הקצה החופשי של צינורות הסיליקון למאגר של 37 מעלות צלזיוס M199 בינוני בתוספת 0.5%BSA.

הנסיגה את הבוכנה כדי למלא את הצינור עם חיץ זרימה ולאבטח את המזרק על משאבת המזרק. לאחר מכן הגדר את המשאבה למצב משיכה וציין את קצב הזרימה. כדי לחבר את תא השקופיות, מהדקים את צינורות הסיליקון סביב מצמד המנעולים הנקבי ומנתקים את שני זכרי המחבר המהודרים מהמצמד כדי לאפשר להם להיות מחוברים למאגר השקופית.

בועות אוויר לא רק להפריע לאיכות התמונה, אלא גם לגרום ללחץ נימי תדיר לתאים, המוביל למוות של תאים. כדי למנוע בועות אוויר, לאשר את ההידוק הנכון של צינורות לפני החדרת luer לתוך המאגר. לאחר מכן הסר את המהדקים כדי לאשר שהחיבור אינו דולף והצב את השקופית מתחת למיקרוסקופ.

להדמיה של גיוס המונוציטים תחת זרימה, הוסיפו 5 מיקרוליטרים של נוגדן נגד CD16 משותף של קמח וצבע גרעיני מתאים לכל מונוציטים עליזים עבור דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר ואספו את התאים בצנטריפוגה קצרה. תן שוב את גלולה ב 250 microliters של חיץ זרימה ולהתחיל את משאבת המזרק. הוסף 30 מיקרוליטרים של מתלה מונוציטים אחד לתא אחד של השקופית ובחר את המטרה 40X במיקרוסקופ הקונפוקל.

הפעל את לייזרים פלואורסצנטי המתאים ולהשתמש בתא עם מונוציטים שכותרתו כדי להגדיר את הפרמטרים הרכישה של מיקרוסקופ confocal הבא, לבחור שלושה שדות מבט ברדיוס של חצי סנטימטר עבור הדמיה confocal מרובה מיקום, ולהגדיר מחסנית Z לטווח 10 עד 12 מיקרומטר ואת רכישת לשגות זמן לרוץ כל דקה אחת. לאחר שלוש דקות של הדמיה, להזריק 200 microliters של מונוציטים דרך יציאת הזרקת לולר מוטבע ולהתחיל הדמיה האינטראקציה התאית. לאחר 30 דקות לפחות, עצרו את ההדמיה ואת הזרימה והדקו את הצינור כדי לאפשר את ניתוקו מהמגלשה.

כדי לקבוע את קצב ההתגלות של התאים באמצעות HUVECs מגורה, לפתוח תמונה J ולספר את המספר הכולל של מונוציטים חסידים בכל שדה כדי לקבוע את ספירת התאים למילימטר מרובע. לאחר מכן לספור את מספר מונוציטים transmigrated הקיימים במישור הבסיסי מתחת לתאי אנדותל כפי שזוהה על ידי נוכחות של אזור חור שחור סביב הגרעין. דרך פשוטה לבדוק את מצב ההפעלה של HUVECs לאחר גירוי היא לדמיין את התארכותם תחת לחץ דלקתי.

דימות קונפוקלי לשגות זמן מאפשר הדמיה של מונוציטים במישור apical שבו פנוטיפ שלהם ניתן להעריך. תאים נודדים העוברים שינוי עוברים לצומת התא-לתא הבין-תאי לפני שהם נעלמים מהמישור האפור ומופיעים שוב במישור הבסיסי. כימות גיוס המונוציטים לאורך זמן מאשר כי הידבקות במונוציטים מלווה גלגול.

קצב ההתגלות של מונוציטים חיוביים CD16 נמוך כאשר תא אנדותל מגורה עם אלפא TNF בלבד, אבל עולה כאשר התאים אנדותל מגורים עם אלפא TNF וגורם הגדילה אנדותל כלי הדם או VEGFA. גירוי HUVEC עם אלפא TNF ו TNF אלפא בתוספת VEGFA גורם לעלייה בדבקות בתאי T, B ו- NK שליליים CD14, להשוות CD14 מונוציטים חיוביים. בנוסף, גירוי HUVEC גורם להתהוות של אוכלוסיית המונוציטים בלבד, שכן תאי T, B ו- NK אינם משתנים תחת אלפא TNF או אלפא TNF בתוספת תנאי גירוי VEGFA.

כדי לבצע בדיקה מיטבית של גיוס מונוציטים, חשוב שתתכנן את הניסוי שלך מראש ותעשה אותו באותו יום. וכאשר אתה מטהר את התאים, ודא כי המיקרוסקופ שלך הוא ב 37 מעלות, כך שאתה לא להעביר את התאים לטמפרטורה שונה במהלך הניסוי. כדי ללמוד הליך זה, ניתן לבצע את כל השיטות כמו פרופיל של ציטוקינים HUVEC וביטוי כימוקין, כמו גם מחקרי chemotaxis ניתן לבצע כדי לענות על שאלה נוספת על המנגנון המולקולרי לקיים את ההיתוך וההיתוך של אוכלוסיית מונוציטים ספציפית.