Name: שיטת In Vivo ללמוד העכבר דם Testis מכשול שלמות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 48 s
Description: למדו שיטת in vivo להערכת שלמות מחסום הדם-אשכים בעכברים באמצעות הזרקת inulin-FITC. פרוטוקול זה מאפשר לחקור השפעות של גורמים גנטיים וסביבתיים על פוריות זכרית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמך על ידי ה-R המפתח הלאומית & D התוכנית של סין (2016YFA0500902), את נבחרת מדעי הטבע קרן של סין (31471228, 31771653), קרן המדע ג'יאנגסו עבור חוקרים צעירים מכובד (BK20150047), מדעי הטבע קרן של מחוז ג'יאנגסו (BK20140897, 14KJA180005), התוכנית יזמיים וחדשניים של מחוז ג'יאנגסו אל K.Z.

כל הניסויים שבוצעו אושרו על ידי ועדת נאנג'ינג הרפואי האוניברסיטאי. זכר C57BL/6 הוחזקו בתנאים מבוקרים photoperiod ועכברים סופקו עם מים ואוכל.
1. תכשירים
<ol><li>
נימים microinjection
	<ol>
<li>השתמש microinjection נימים עם הקוטר החיצוני, dimeter הפנימית, אורך של 1.0 מ מ, מ מ 0.8 ס מ 10.0, בהתאמה.</li>
		<li>משוך נימים זכוכית עם פולר נימי (איור 1 א'). לבדוק ולהתאים את ההגדרות בהתאם המכונה פולר קפילרי נמצא בשימוש.</li>
		<li>לשבור את הטיפים פיפטה עם מלקחיים להשתמש כדי להשיג נימים של קוטר 50-מיקרומטר בקצה. הערה: הטיפים עשוי להיות ארוך מדי לחדור בזרמה.</li>
		<li>לחדד את הטיפ בזווית של 30 מעלות על-ידי שימוש של beveler micropipette (איור 1C).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ריאגנטים
	<ol>
<li>להכין סודיום פנטוברביטל 1%: להמיס סודיום פנטוברביטל 100 מ ג, 10 מ ל תמיסת באגירה פוספט (PBS) (שלב 2.3.3).</li>
		<li>הכינו 10 מ"ג/מ"ל אינולין-FITC: להמיס אינולין-FITC 1 מ ג, 100 μL ל- PBS (שלב 2.1.6).</li>
		<li>להכין 4% paraformaldehyde: להמיס paraformaldehyde (PFA) 4 g ב- 100 מ של PBS (שלב 2.3.3).</li>
		<li>הכנת 30% סוכרוז: להמיס סוכרוז 3g ב 10 מ"ל ל- PBS (שלב 2.3.4).</li>
		<li>הכנת 0.1% כלוריד קדמיום: להמיס קדמיום כלוריד 10 מ ג של 10 מ"ל ל- PBS (שלב 2.1.1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. שיטות
<ol><li>
הכנה מטופל והרדמה
	<ol>
<li>שוקל 8 בת C57BL/6 עכברים זכרים ולחשב את המינון הנדרש של CdCl2. מתייחסים קבוצה של עכברים (n = 3) עם CdCl2 (5 מ"ג/ק"ג b.w., i.p.) עבור 3 d לפני הניתוח. להתייחס לקבוצה אחרת של עכברים זכר בן שבוע 8 C57BL/6 (n = 3) עם PBS הפקד.</li>
		<li>לבצע ניתוח בתנאים aseptic באמצעות מזרק סטרילי, מחט, מספריים, מלקחיים.</li>
		<li>להכין את הפתרון עובד הרדמה טרי. המינון הנדרש של הרדמה הוא 70 מ ג של סודיום פנטוברביטל/kg של משקל גוף. בממוצע, העכבר C57BL/6 מבוגרים בגיל 8 שבועות שוקל ~ 25 גרם, המתאים μL 175 של 1% סודיום פנטוברביטל (1.75 מ ג לכל העכבר). הערה: סודיום פנטוברביטל הוא מומס סטרילי באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS). הפתרון סוננו לפי 0.22 יחידת מסנן לפני השימוש בו.</li>
		<li>לנקות את האזור. למטרת ניתוח עם 75% אתנול ולכסות את האזור עם מגבת נקייה רקמות.</li>
		<li>את החימום תרמוסטטי ולהתאים את הטמפרטורה ל- 37 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>להכין את הפתרון עובד אינולין-FITC (10 mg/mL) ביום של הניתוח.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הליך כירורגי
	<ol>
<li>שוקל 8 בת C57BL/6 עכברים זכרים ולחשב את המינון הנדרש של הרדמה.</li>
		<li>לבצע זריקה בקרום הבטן של סודיום פנטוברביטל באמצעות המזרק עקר 1-mL. שמור את העכבר בתוך כלוב נקי.</li>
		<li>לבחון את תגובת רפלקס העין ואת דפוס הנשימה של העכבר כדי לוודא שזהו אכן בהרדמה מלאה. הערה: בדרך כלל, 10-15 דקות נדרשים עד העכבר עמוקות מרדימים, עם חוסר מוחלט של הבוהן קמצוץ התגובה ותחזוקה של לנשום לאט, יציב.</li>
		<li>להזיז את העכבר אל אזור הפעולה ולכסות אזור העין שלו עם נייר טישו לח למנוע יובש במהלך הרדמה (איור 2 א).</li>
		<li>לגלח את השיער בבטן שלה עם גילוח ולחטא באזור הניתוח עם 75% אתנול.</li>
		<li>עם מספריים חדות, עושים חתך בעור 1 ס"מ מעל בלוטות preputial לחשוף את דופן הבטן. הרם את דופן הבטן עם מלקחיים קטנים, עושים חתך 0.5 ס מ כדי לחשוף את חלל הצפק (איור 2B).</li>
		<li>להשתמש מלקחיים כדי לחפש עבור רפידות שומן סביב יותרת האשך testis. משוך בזהירות את רפידות השמן לחשוף בזרמה המצורפת בבירור (איור 2C ו- 2D). בדרך כלל, פועל על testis אחד בכל פעם. הערה: להימנע מלגעת את רפידות השמן ואת testis עם הידיים.</li>
		<li>מניחים נייר (9 ס מ קוטר) מתחת רפידות השמן ואת testis (איור 2C).</li>
		<li>להזריק אינולין-FITC לתוך פיפטה microinjection וחבר אותו ליחידה micromanipulator (איור 1D). בעדינות להוסיף על פיפטה microinjection תחת albuginea tunica, טען סך של 20 μL של אינולין-FITC interstitium של בזרמה (איור 2E ו- 2F). הערה: נלחצים היטב על פיפטה microinjection כדי למנוע את העברתו.</li>
		<li>לפקח על התנועה של אינולין-FITC ב בזרמה (איור 2G).</li>
		<li>מיד לשים בזרמה בחזרה לתוך חלל הבטן לאחר הסיום של הזריקה.</li>
		<li>חזור על הפעולות על בזרמה contralateral. Testis זה מוזרק עם μL 20 ל- PBS כפקד.</li>
		<li>לסגור את העור עם תפירה, להזיז את העכבר כדי כרית חום של תנור ברים, מערכות אינסטלציה (איור 1B). לנהל מינון של 1 מ ג של שיכוך כאב (הבופרנורפין) לכל 1 ק ג של משקל הגוף באמצעות הזרקה תת עורית.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
קציר את האשכים והכנות מקטעים קפוא
	<ol>
<li>40 דקות לאחר ההזרקה המתת חסד העכבר הנמען מאת נקע בצוואר הרחם על פי טיפול בבעלי חיים ולהשתמש הנחיות.</li>
		<li>השתמש זוג מספריים חדות כדי לאסוף את האשכים. למקם את האשכים 1 מ"ל של PBS קר כקרח כדי להסיר כל זיהום בדם.</li>
		<li>לתקן האשכים ב 4% paraformaldehyde (PFA) ב 4 מעלות צלזיוס במשך 12-24 ח' להשליך את 4% PFA ושטוף הרקמה 3 x 1.5 מ של 1% PBS בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>מייבשים את הרקמה ב 30% סוכרוז למשך הלילה. לשים בזרמה במסגרת ההטבעה ולכסות את הרקמה עם טמפרטורה אופטימלית חיתוך המורכב (אוקטובר). לאחר OCT מוקפא, למלא את המסגרת ההטבעה עם OCT כך בזרמה כל יכול להיות מכוסה OCT.</li>
		<li>חותכים חתכי רוחב 5-μm-עבה, קפוא של האשכים cryostat ב-20 ° C ולתת להם לדבוק שקופיות מיקרוסקופ. הערה: Refreezing רקמות מוטבע בתוך קרח יבש עשוי להגדיל את הנוקשות לחיתוך.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
דרישת תמונה
	<ol>
<li>מקם את השקופיות בקופסה humidified. חממו את השקופיות בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.</li>
		<li>לשטוף את הסעיפים 3 x בתמיסת באגירה טריס (TBS) בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>מילה נהדרת עבור 5 דקות בחושך. . תנגב את כל TBS שיורית בנייר ללא אבק</li>
		<li>מכסים את חתכי רוחב עם 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי). מניחים את coverslip הפוכה על שקופית מיקרוסקופ.</li>
		<li>לרכוש תמונות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. סכום כולל של 20 X הגדלה מספיקה בדרך כלל לזיהוי האות פלורסנט במאור פנים.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Mruk, D. D., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sertoli-Sertoli+and+Sertoli-germ+cell+interactions+and+their+significance+in+germ+cell+movement+in+the+seminiferous+epithelium+during+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">Sertoli-Sertoli and Sertoli-germ cell interactions and their significance in germ cell movement in the seminiferous epithelium during spermatogenesis.</a> Endocrine Reviews. 25 (5), 747-806 (2004).</li>
<li>Wen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+of+germ+cells+across+the+seminiferous+epithelium+during+spermatogenesis-the+involvement+of+both+actin-+and+microtubule-based+cytoskeletons%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Barriers%22%5BJournal%5D)">Transport of germ cells across the seminiferous epithelium during spermatogenesis-the involvement of both actin- and microtubule-based cytoskeletons.</a> Tissue Barriers. 4 (4), e1265042(2016).</li>
<li>Wang, C. Q., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+seamless+trespass%3A+germ+cell+migration+across+the+seminiferous+epithelium+during+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A seamless trespass: germ cell migration across the seminiferous epithelium during spermatogenesis.</a> Journal of Cell Biology. 178 (4), 549-556 (2007).</li>
<li>Fijak, M., Meinhardt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+testis+in+immune+privilege%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The testis in immune privilege.</a> Immunological Reviews. 213, 66-81 (2006).</li>
<li>O'Bryan, M. K., Hedger, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+Networks+in+the+Control+of+Spermatogenesis+Chronic+Inflammation+in+an+Immunologically+Privileged+Tissue%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Mechanisms+In+Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">Inflammatory Networks in the Control of Spermatogenesis Chronic Inflammation in an Immunologically Privileged Tissue?</a> Molecular Mechanisms In Spermatogenesis. 636, 92-114 (2008).</li>
<li>Li, N., Wang, T., Han, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+cellular+and+molecular+aspects+of+immune+privilege+in+the+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Structural cellular and molecular aspects of immune privilege in the testis.</a> Frontiers in Immunology. 3, 152(2012).</li>
<li>Mruk, D. D., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mammalian+Blood-Testis+Barrier%3A+Its+Biology+and+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Review%22%5BJournal%5D)">The Mammalian Blood-Testis Barrier: Its Biology and Regulation.</a> Endocrine Review. 36 (5), 564-591 (2015).</li>
<li>Govero, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus+infection+damages+the+testes+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Zika virus infection damages the testes in mice.</a> Nature. 540 (7633), 438-442 (2016).</li>
<li>Jenabian, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+tolerance+properties+of+the+testicular+tissue+as+a+viral+sanctuary+site+in+ART-treated+HIV-infected+adults%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Immune tolerance properties of the testicular tissue as a viral sanctuary site in ART-treated HIV-infected adults.</a> AIDS. 30 (18), 2777-2786 (2016).</li>
<li>Holembowski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAp73+is+essential+for+germ+cell+adhesion+and+maturation+in+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">TAp73 is essential for germ cell adhesion and maturation in testis.</a> Journal Of Cell Biology. 204 (7), 1173-1190 (2014).</li>
<li>Legendre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+engineered+3D+blood-testis+barrier+model+for+the+assessment+of+reproductive+toxicity+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">An engineered 3D blood-testis barrier model for the assessment of reproductive toxicity potential.</a> Biomaterials. 31 (16), 4492-4505 (2010).</li>
<li>Setchell, B. P., Waites, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+permeability+of+the+testicular+capillaries+and+of+the+%27blood-testis+barrier%27+after+injection+of+cadmium+chloride+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Changes in the permeability of the testicular capillaries and of the 'blood-testis barrier' after injection of cadmium chloride in the rat.</a> Journal of Endocrinology. 47 (1), 81-86 (1970).</li>
<li>Griswold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+central+role+of+Sertoli+cells+in+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The central role of Sertoli cells in spermatogenesis.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 9 (4), 411-416 (1998).</li>
<li>Cheng, C. Y., Mruk, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-testis+barrier+and+its+implications+for+male+contraception%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The blood-testis barrier and its implications for male contraception.</a> Pharmacological Reviews. 64 (1), 16-64 (2012).</li>
<li>Mruk, D. D., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+system+to+study+Sertoli+cell+blood-testis+barrier+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An in vitro system to study Sertoli cell blood-testis barrier dynamics.</a> Methods Molecular Biology. 763, 237-252 (2011).</li>
<li>Orth, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+of+Sertoli+cells+in+fetal+and+postnatal+rats%3A+a+quantitative+autoradiographic+study%5BTitle%5D)+AND+%22Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Proliferation of Sertoli cells in fetal and postnatal rats: a quantitative autoradiographic study.</a> Anatomical Record. 203 (4), 485-492 (1982).</li>
<li>Lee, N. P. Y., Mruk, D., Lee, W. M., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+the+cadherin%2Fcatenin+complex+a+functional+unit+of+cell-cell+actin-based+adherens+junctions+in+the+rat+testis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Is the cadherin/catenin complex a functional unit of cell-cell actin-based adherens junctions in the rat testis?</a> Biology of Reproduction. 68 (2), 489-508 (2003).</li>
<li>Bai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Germline-Specific+Role+for+the+mTORC2+Component+Rictor+in+Maintaining+Spermatogonial+Differentiation+and+Intercellular+Adhesion+in+Mouse+Testis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">A Germline-Specific Role for the mTORC2 Component Rictor in Maintaining Spermatogonial Differentiation and Intercellular Adhesion in Mouse Testis.</a> Molecular Human Reproduction. 24 (5), 244-259 (2018).</li>
<li>Korhonen, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DICER+Regulates+the+Formation+and+Maintenance+of+Cell-Cell+Junctions+in+the+Mouse+Seminiferous+Epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">DICER Regulates the Formation and Maintenance of Cell-Cell Junctions in the Mouse Seminiferous Epithelium.</a> Biology of Reproduction. 93 (6), 139(2015).</li>
<li>Loir, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trout+Sertoli+cells+and+germ+cells+in+primary+culture%3A+I.+Morphological+and+ultrastructural+study%5BTitle%5D)+AND+%22Gamete+Research%22%5BJournal%5D)">Trout Sertoli cells and germ cells in primary culture: I. Morphological and ultrastructural study.</a> Gamete Research. 24 (2), 151-169 (1989).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+the+Integrity+of+the+Blood-Testis+Barrier+%28BTB%29%3A+An+In+Vivo+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Monitoring the Integrity of the Blood-Testis Barrier (BTB): An In Vivo Assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1748, 245-252 (2018).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

יצירת זרע לוקח מקום האפיתל וכמה, הוא תהליך מאוד מסודר ודינמי נשלטת על ידי בתאי הנבט ותאים סומטיים (למשל, התאים Sertoli)13. המבנה BTB, אשר נבנה על ידי תאי סרטולי, מחלק וכמה האפיתל של הבסיס, תא של הפסגה. הפיתוח של meiotic, הפלואידי בתאי הנבט מתרחשת בתוך התא הפסגה המהווה מכשול אימונולוגי של14.
הפונקציה BTB יכול להתפשר על ידי חשיפה לרעלים או עקב פגמים בגנים המעורבים היווצרות של צמתי תא, המוביל אל פוריות הגבר על מנת לבחון BTB שלמות, ...

בתרבית של יצירת זרע נחשב תהליך מובנה מאוד שמקיף התחדשות עצמית spermatogonial ובידול דרך spermatocytes לתוך spermatozoa הפלואידי באמצעות מיטוזה, מיוזה, spermiogenesis, שבמהלכו דרמטי שינויים ביוכימיים, מורפולוגיים להתרחש. מתפתחות בתאי הנבט מועברים בהדרגה מבסיס של צנורית וכמה לכיוון לומן. תהליך זה מוסדר על ידי תאים תאים הקשר בין בתאי הנבט סרטולי תאים1,2. התאים Sertoli הסמוכים טופס BTB הממוקמת ליד בסיס צנורית וכמה. BTB מחלק פיזית האפיתל של הבסיס, תא של adluminal. בשלבים השמיני - התשיעי של מחזור אפיתל, preleptotene/leptotene spermatocytes מן התאים הבזליים לנדוד בין BTB, להזין את התאים adluminal3. לכן, תפקוד BTB נועד לספק של microenvironment immunoprivileged להשלמת מיוזה, spermiogenesis4,5,6. בניגוד רקמות דם מכשולים אחרים (למשל, מחסום הדם - מוח) רק המורכבות צמתי צר (TJs), BTB נוצרת על ידי ארבעה צמתים שונים (TJs מתמחה רוחות, הפער צמתי, ביניים מבוסס-פילמנט desmosomes) בין סרטולי תאים1,7.
מחקרים רבים השתמשו מהונדס גנטית עכברים הידבקות בווירוסים, חשיפה לרעלים סביבתיים כדי לחקור מנגנונים של BTB שלמות7,8,9. השיבוש BTB מעוררת יצירת זרע לקוי ולא subfertility או אי פוריות. מאז היווצרות BTB ותקינות אושרו להיות מושפעות מגעים בין תאי סרטולי8, במבחנה מודל המבוסס על תרבות העיקרי של תאי סרטולי מבודד שימש למחקר BTB. עם זאת, מודל זה במדויק לא יכול לחקות BTB dynamics vivo בתוך. יתר על כן, אין תרבות משותפת כזו תאי נבט עם תאי סרטולי נוצרה כמו מסוגל המשקף את כל הרכיבים פונקציונלי מבניים הרלוונטיים של ה BTB10,11.
באופן כללי, אין ויוו מבחני יושרה BTB מבוססים בדרך כלל על מולקולות קטנות, כגון EZ-קישור Sulfo-NHS-LC-ביוטין, אינולין FITC מצומדת (אינולין-FITC). בדרך כלל, פעפוע של ביוטין או אינולין-FITC מן התא הבסיס חסומה על-ידי BTB מבנה. לכן, אנו מסוגלים להשתמש בשיטה זו כדי להעריך את היקף הנזק BTB לעומת קבוצות שליטה. בעוד BTB יכול להיות בסכנה עם סוגים מסוימים של גירויים, כגון טיפול עם קדמיום כלוריד (CdCl2)12, BTB הופך נגיש מולקולות קטנות, אשר בסופו של דבר הזן תא adluminal מחוונים.
מוקדם ויוו BTB שלמות assay המוחלשים ביוטין או אינולין-FITC לתוך ומוחלף על, אשר כרוך הניתוח, היא פולשנית, מסובך, גוזלת זמן. חוץ מזה, כל החומרים כתב מפוזרת באמצעות הגוף כולו דרך מחזור הדם, הריכוז המקומי של ביוטין או אינולין-FITC ב בקוריאנית וכמה הוא מוגבל. יתר על כן, חשיפה מערכתית עלול לגרום לתגובות החיסון. כאן, אנו מציגים פשוטה ויעילה ויוו BTB שלמות assay הפעלת הזרקה ישירה של aliquot קטן של אינולין-FITC לתוך interstitium של מבחן. שימוש של פלורסנט שיטת תיוג, התהליך מכתימים הוא נוח, כמו נוגדנים משניים אינם נדרשים. כאן, התהליך של הפלורסנט הזנת בזרמה הוא מדמיין.

<table><tbody><tr><td>חולץ נימי&nbsp;</td><td>SUTTER INSTRUMENT (USA)</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Hyclone (ארה"ב)</td><td>SH30258.01</td><td>דילול ל-1& ב-ddH2O</td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td><td>Sigma (ארה"ב)</td><td>F6057</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ הידבקות</td><td>CITOGLAS (סין)</td><td>80312-3161</td><td></td></tr><tr><td>קדמיום כלוריד</td><td>סיגמא (ארה"ב)</td><td>655198-5G</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>Zeiss (גרמניה)</td><td>LSM700</td><td></td></tr><tr><td>נייר נטול אבק</td><td>קימברלי-קלארק (ארה"ב)</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>אינולין-FITC</td><td>Sigma (ארה"ב)</td><td>F3272</td><td></td></tr><tr><td>נימי מיקרו-הזרקה</td><td>Zhengtianyi (סין)</td><td>BJ-40</td><td>1.0 מ"מ ופעמים; 0.8 מ"מ&nbsp; ופעמים; 100 מ"מ</td></tr><tr><td>מיקרופיפטה beveler</td><td>NARISHIGE (יפן)</td><td>EG-400</td><td></td></tr><tr><td>OCT</td><td>SAKURA (יפן)</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma (ארה"ב)</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital נתרן</td><td>Merck (גרמניה)</td><td>P11011</td><td></td></tr><tr><td>מכונת גילוח&nbsp;</td><td>יאשן (סין)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ סטריאו</td><td>ניקון (יפן)</td><td>SMZ1000</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז&nbsp;</td><td>Sangon Biotech (סין)</td><td>A610498</td><td></td></tr><tr><td>מכשירים כירורגיים</td><td>חזקים יותר (סין)</td><td></td><td>מספריים, מלקחיים, מחזיק מחט</td></tr><tr><td>מזרק</td><td>KDL (סין)</td><td>20163150518</td><td>0.45 מ"מ ופעמים; 0.16 מ"מ RW LB</td></tr><tr><td>תנור תרמוסטטי</td><td>KELL (נאנג'ינג, סין)</td><td>KEL-2010</td><td></td></tr><tr><td><חזק>10x TBS, pH 7.6</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 מ' Tris</td><td>Sangon Biotech (סין)</td><td>A600194</td><td></td></tr><tr><td>1.37 מ' Nacl</td><td>Sangon Biotech (סין)</td><td>A610476</td><td></td></tr></tbody></table>

שיטת in vivo ללמוד העכבר דם testis מכשול שלמות

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

יצירת זרע הוא הפיתוח של spermatogonia לתוך spermatozoa בוגרת ב בקוריאנית וכמה של בזרמה. תהליך זה נתמך על ידי צמתי תא סרטולי-מחסום דם-testis (BTB), אשר היא המכשול הכי צפופה רקמות בגוף יונקים segregates האפיתל וכמה לתוך שני תאים, על הבסיס של adluminal. BTB יוצרת microenvironment ייחודי בתאי הנבט, מיוזה אני / II ועל ההתפתחות של postmeiotic spermatids לתוך spermatozoa דרך spermiogenesis. כאן, אנו מתארים וזמינותו אמין כדי לפקח BTB שלמות של העכבר testis ויוו. BTB שלם חוסם פעפוע של FITC מצומדת אינולין מן הבסיס כדי תא הפסגה של בקוריאנית וכמה. טכניקה זו מתאימה ללמוד מועמדים הגן, וירוסים או חשיפה לרעלים סביבתיים שעשויים להשפיע על תפקוד BTB או תקינות, עם הליך קל, דרישה מינימלית של היכולות הכירורגיים לעומת שיטות אלטרנטיביות.

הסידור ניסיוני עבור ביצוע וזמינותו שלמות BTB מוצג באיור1. משוך, חידוד נימים microinjection עם נימי פולר, micropipette beveler, בהתאמה (איור 1A וג 1). ברים, מערכות אינסטלציה חימום וציוד microinjection מומחשים איור 1B ו- 1 D.
איור 2 מציג חלק מהשלבים מפתח עבור ההזרקה של אינולין-FI...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי להעריך את תקינות מחסום דם-testis על ידי הזרקת אינולין-FITC לתוך האשכים. זוהי שיטה יעילה ויוו ללמוד שלמות מחסום דם testis. זה יכול להיות בסכנה על ידי אלמנטים גנטיים וסביבתיים.

שיטת In Vivo ללמוד העכבר דם Testis מכשול שלמות

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח במחסום בדיקת הדם של תחומי הביולוגיה על מועמדים לגנים, וירוסים או רעלנים סביבתיים שעלולים להשפיע על תפקוד מחסום בדיקת הדם או על שלמותו. שלושה ימים לפני הניתוח, לטפל לפחות שמונה שבועות C57Black/6 עכברים זכרים מדי יום עם חמישה מיליגרם לכל קילוגרם משקל הגוף קדמיום כלוריד באמצעות הזרקה תוך-ניתוחית. ביום הניתוח, מניחים רקמה נקייה מעל אזור כירורגי מעוקר 75% אתנול ולהגדיר תנור תרמוסטטי ל 37 מעלות צלזיוס.מניחים עכבר הרדמה על הרקמה, ולאחר מכן לאשר חוסר תגובה לצביטת בוהן. מגלחים את שיער הבטן עם מכונת גילוח, ומחטאים את העור החשוף עם 75% אתנול. בצע חתך בעור בסנטימטר אחד מעל בלוטות הקדם-ליחה כדי לחשוף את דופן הבטן, ולהשתמש בממטרים קטנים כדי להרים את העור כדי לבצע חתך של 0.5 ס"מ בצלע.השתמש במטחנים כדי לחפש רפידות שומן סביב epididymis ו testis, בזהירות מושך את רפידות השומן החוצה כדי לחשוף אשך אחד מצורף. מניחים פיסת נייר באורך תשעה סנטימטרים מתחת לכריות השומן והאסטיס, ומעמיסים פיפטה מיקרו-ג'ינג'י עם תמיסת אינולין-FITC שהוכנה זה עכשיו. חבר את הפיפלט ליחידת מיקרומניפולטור, ולהשתמש במיקרוסקופ ניתוח כדי להכניס בעדינות את קצה פיפטה microinjection מתחת אלביניה טוניקה.סובב באיטיות את ידית ההפעלה כדי לספק 20 מיקרוליטרים של inulin-FITC לתוך האינטרסטיטיום של האשכים. אם המסירה תצליח, האשכים יהפכו צבע ירוק-צהוב בהיר. מיד להחזיר את האשכים לחלל הבטן, ולהזריק את האשכים contralateral עם 20 microliters של PBS, ולאחר מכן לסגור את העור עם תפר כירורגי.ומ מניחים את העכבר על כרית החום של תנור תרמוסטטי. 40 דקות לאחר ההזרקה, להשתמש במספריים חדים כדי לאסוף את האשכים מכל עכבר, ולשטוף את הרקמות במיליליטר אחד של PBS קר כקרח. לאחר מכן, לתקן את האשכים ב 4% paraformaldehyde בארבע מעלות צלזיוס במשך 12 עד 24 שעות ואחריו שלוש שטיפות ב 1.5 מיליליטר של 1%PBS לכל לשטוף.לאחר התייבשות סוכרוז של 30% במהלך הלילה, מעבירים את הדגימות למסגרות הטבעה בודדות, ומכסים את הרקמות בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית. הגדר את הטמפרטורה של קריוסטט שלילי 20 מעלות צלזיוס ולמקום את המסגרות קריוסטט במשך כ 10 דקות עד OCT קפוא. לאחר מכן, מלא כל מסגרת הטבעה ב- OCT טרי עד שכל האשכים יכסו בכל תבנית.כאשר השכבה השנייה של OCT קפאה, לרכוש חתך בעובי חמישה מיקרומטר של כל האשכים, לכידת קטעי הרקמה על שקופיות מיקרוסקופ זכוכית כפי שהם מתקבלים. כדי לדמיין את הדגימות, חמם תחילה את השקופיות בתיבה לחה בטמפרטורת החדר. לאחר 10 דקות, לשטוף את השקופיות שלוש פעמים מלוחים טריים לאגירה לכל לשטוף ולאפשר את החלקים להתייבש במשך חמש דקות מוגן מפני אור.השתמש בנייר ללא אבק כדי להסיר את כל שאריות תמיסת מלח, והעלה את הדגימות עם מדיום הרכבה בתוספת DAPI. לאחר מכן, לכסות כל דגימה עם להחליק כיסוי הפוך, ותמונה הדגימות תחת המטרה 20X של מיקרוסקופ confocal. שלושה ימים של טיפול קדמיום כלוריד גורם נזק למחסום בדיקת הדם המאפשר דיפוזיה inulin-FITC מן התא הבסיסי לתא apical של האפיתל חצי שנתי.לעומת זאת, דיפוזיה זו חסומה בבקרה אשכים שטופלו ב- PBS. היקף הנזק למחסום בדיקת הדם נקבע על ידי חישוב היחס בין המרחק של דיפוזיה אינולין-FITC לרדיוס של אותו צינור חצי שנתי. יתר על כן, מחסום בדיקת הדם שלם ב Rictor heterozygous floxed עכברי נוקאאוט בלוקים דיפוזיה inulin לאורך המחסום לתוך תא apical, בעוד עכברי נוקאאוט ריקטור מותנה להחזיק מחסום בדיקת דם בסכנה המאפשרת דיפוזיה inulin.בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לספק אינולין-FITC מוכן ביום הניסוי ולשמור על הרקמה מוגנת מפני אור מאז FITC היא מולקולה רגישה לאור. ההשלכות של טכניקה זו להרחיב את הטיפול של זרע לקוי כי הפונקציה של מחסום בדיקת הדם היא לספק microenvironment החיסיון החיסוני להשלמת meiosis ב spermatogenesis. לאחר התפתחותה, טכניקה זו מספקת דרך לחוקרים בתחום רפואת הרבייה לחקור תת פוריות ופוריות בעכברים.אל תשכח כי עבודה עם paraformaldehydes יכול להיות מסוכן מאוד, כי אמצעי זהירות כגון לבישת בגדים ומסכות פנים תמיד צריך להילקח בעת ביצוע הליך זה.

an-in-vivo-method-to-study-mouse-blood-testis-barrier-integrity

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

<em&gt; In vivo</em&gt; Assay לבדיקת חדירות כלי דם

מאמר זה מתאר microinjection וelectroporation של אשך עכבר in vivo כטכניקת transfection לתאי עכבר אשכים ללמוד תהליכים ייחודיים של יצירת תאי זרע. הפרוטוקול המובא כרוך בצעדים של הכנת זכוכית נימים, microinjection באמצעות צינור efferent, וtransfection ידי electroporation.

בVivo Microinjection וElectroporation של אשך העכבר

אנו מציגים פרוטוקול ללמוד אינטראקציות אנדותל-pericyte אדם העכבר באמצעות וריאציה של assay אנגיוגנזה תקע ג'ל מטריקס.

In vivo לחקר האדם האנדותל-pericyte אינטראקציה באמצעות assay Plug מטריקס ג&#39;ל עכבר

שתי שיטות מוצגים כאן כדי לקבוע פונקציה מכשול המעי. מטר אפיתל (וולט/אוהם) משמש עבור מדידות של ההתנגדות החשמלית transepithelial של epithelia בתרבית ישירות בבארות תרביות רקמה. בעכברים, שיטת gavage FITC-לתוספי משמשת כדי לקבוע את חדירות המעי ויוו.

במבחנה , גישות In Vivo כדי לקבוע חדירות תאים אפיתל המעי

כאן נציג של assay חדירות כלי דם במוח העכבר באמצעות הזרקה בקרום הבטן של המשדרים פלורסנט ואחריו זלוף הרלוונטיים מודלים חייתיים של תפקוד לקוי של מחסום הדם - מוח. חמי-המוח משמש עבור הערכת חדירות באופן כמותי, והשני עבור מעקב חזותי/immunostaining. התהליך לוקח ב' 5-6-10 עכברים.

In Vivo מחסום הדם - מוח חדירות Assay בעכברים באמצעות Fluorescently עם התווית המשדרים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול eCLIP כדי לקבוע מטרות של RNA הגדולות של מועמדים RBP בתוך בנות.

משופרת Crosslinking Immunoprecipitation (eCLIP) שיטה לזיהוי יעיל של רנ א חלבון מאוגד ב העכבר בתוך הראש

תוך ניצול של מיקרוסקופ תוך-ויטאל, השיטה המוצגת כאן מאפשרת הדמיה בזמן אמת של שפיכת תאי אפיתל במעיים בבעלי חיים חיים. לכן, רירית מעיים מוכתמת topically (acriflavine ו rhodamineB-dextran) של עכברים מרדימים הוא תמונה עד רזולוציה של תא יחיד באמצעות מיקרוסקופית confocal.

גישה תוך-ויטאלית המבוססת על מיקרוסקופיה להערכת חמלה במעיים וביצועי שפיכת תאים אפיתל

פרוטוקול זה מתאר מיקרו-דיסקציה בסיוע טרנסילומינציה של מקטעים של צינוריות עכבר בוגרות למחצה המייצגות שלבים ספציפיים של מחזור אפיתל חצי-היקפי, וסוגי תאים בו, וחיסון לאחר מכן של תכשירי סקווש ומקטעי צינור שלמים.

ניתוח בסיוע Transillumination של שלבים ספציפיים של מחזור האפיתל החצי-שנתי של העכבר לניתוחים Immunostaining במורד הזרם

מאמר זה מדווח על עיכוב in vivo של CENP-E באמצעות ניתוח בטן והזרקת GSK923295 באשכים, מודל רב ערך לחלוקה מיוטית גברית. באמצעות בדיקות אימונופלואורסצנטיות, ציטומטריית זרימה ומיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת, אנו מראים כי עיכוב CENP-E גורם לחוסר תיאום כרומוזומים וחוסר יציבות גנומית בזרעונים של עכברים.

הערכה תפקודית של קינזין-7 CENP-E בזרעונים באמצעות עיכוב Vivo , אימונופלואורסנציה וציטומטריית זרימה

בפרוטוקול הנוכחי, פונקציית מחסום האנדותל של הבלוטה התת-מנדיבולרית (SMG) הוערכה על ידי הזרקת עוקבים פלואורסצנטיים משוקללים מולקולריים שונים לוורידים הזוויתיים של מודלים של חיות ניסוי in vivo תחת מיקרוסקופ סריקת לייזר של שני פוטונים.

אין ויוו זיהוי חדירות כלי דם בבלוטה תת-מנדיבולרית של עכבר

במחקר הנוכחי, דקסטרן פלואורסצאין-איזותיוציאנט-מסומן (FITC) מנוהל לעכברים דרך הפה כדי להעריך את חדירות המעי הן in vivo והן בדגימות פלזמה וצואה. מכיוון שתפקוד מחסום המעי מושפע בתהליכי מחלה רבים, ניתן להשתמש בבדיקה ישירה וכמותית זו בתחומי מחקר מגוונים.

הערכה של שלמות מחסום המעי בעכברים באמצעות דקסטרן עם תווית פלואורסצאין-איזותיוציאנט

למדו שיטת in vivo להערכת שלמות מחסום הדם-אשכים בעכברים באמצעות הזרקת inulin-FITC. פרוטוקול זה מאפשר לחקור השפעות של גורמים גנטיים וסביבתיים על פוריות זכרית.

שיטת In Vivo ללמוד העכבר דם Testis מכשול שלמות

גלה סרטונים נוספים