Name: Cryosectioning בו זמנית של המוח מכרסמים מרובים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: למדו שיטת קריוסקשן בו-זמנית למוחות מכרסמים מרובים להפחתת שונות בתהליכי אימונוהיסטוכימיה. פרוטוקול זה משפר עקביות בדיגום רקמות ומייעל הכנת דגימות למחקר נוירולוגי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

PCH המשימה תמיכה קרנות תמיכה המחקר דיווח בכתב היד. המחברים רוצה להודות דניאל גריפיתס לקחת את התמונות בשימוש הדמויות.

הטכניקה Megabrain מוטבה באמצעות המוח כולו, hemisected זכר בוגר C57Bl6 עכברים5, חולדות ספראג-Dawley לנוער, למבוגרים חולדות ספראג-Dawley שהיו transcardially perfused עם 1 x buffered פוספט תמיסת מלח (PBS) עקב 4% paraformaldehyde6. ניתן להשיג תוצאות דומות של זנים אחרים של עכבר, חולדה, משני המינים, בגילאים שונים. המחקר כדי להפיק נתונים עבור כתב יד זה משמש חולדות ספראג-Dawley לנוער, אושרה על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים אוניברסיטת אריזונה ועל שימוש הוועדה, חיות ניסוי היו מטופלים לפי את המדריך עבור טיפול של ואת השימוש של מעבדה בעלי חיים7.
1. Cryoprotection של המוח Perfused
<ol><li>זלוף הבאים מוצלח transcardial6, לאסוף את המוח מלא6,8 מחיות ותקן פוסט על-ידי הצבת לתוך בקבוקון 25 מ של paraformaldehyde 4% ב- PBS במשך 24 שעות ביממה. זהירות: Paraformaldehyde היא מקבע רקמות רעילים; . לטפל. העברת paraformaldehyde לתוך מיכל פסולת במיוחד שכותרתו שמזהה את ריכוז ונפח בתוך ברדס fume כימי, בחנות פסולת כימית בארון עד מסולק על ידי כימיקלים או כראוי אימן את כוח האדם.</li>
	<li>לאחר 24 שעות חלף, בשכונה fume, הסר את המוח paraformaldehyde 4% בעזרת מרית. להעביר את המוח לתוך בקבוקון של 20 מ של 15% סוכרוז פתרון 1 x באגירה טריס מלוחים (TBS) עד המוח שוקע לתחתית המבחנה (כ- 24 שעות).</li>
	<li>בעקבות זאת, להעביר את המוח בקבוקון של 20 מ של 30% סוכרוז פתרון 1 x TBS, עד המוח שוקע לתחתית המבחנה (כ 24-48 שעות).</li>
</ol>2. המוח לקפוא
<ol><li>במקום גביע זכוכית 500 מ"ל על מצע קרח יבש ב דלי קרח. שופכים 300 – 400 מ של איזופנטאן (2 מתיל-בוטאן) לתוך כוס זכוכית.</li>
	<li>לאפשר את הטמפרטורה של איזופנטאן להגיע בין-45 ° C ל-50 מעלות צלזיוס. מקרוב לפקח ולשמור על טווח טמפרטורות הזה עם מד חום, נשאר קבוע לאורך כל ההליך. ודא כי הטמפרטורה נלקחים מהאמצע של הפתרון, לא תוך נגיעה לתחתית או לצד של כשהספל.</li>
	<li>-Benchtop, למלא חד פעמי הטבעה עובש (ראה רשימה) כ- 1/2 מלא של האופטימלית חיתוך טמפרטורה (אוקטובר; ראה טבלה של חומרים) מורכבים. ודא כי ישנם אין בועות אוויר ב- OCT. אם יש בועות אוויר להסיר אותם עם מרית או מחט.</li>
	<li>
הסר את המוח הראשון הבקבוקון של 30% סוכרוז עם מרית. בשלב זה, או להקפיא את המוח כולו או hemisect, בהתאם לעיצוב המחקר.
	<ol>
<li>Hemisected מוח, להשתמש סכין גילוח חדש לעשות חתך נקי דרך רקמות כדי להפריד את ההמיספרות. אם לא נדרש לצורך המחקר, הסר את המוח ואת הריח נורות בשלב זה. אם המוח הקטן נחוצה לצורך המחקר, הוא הציע לחתוך אזור שטוח בקצה האחורי של המוח, כדי לסייע המוח עומד ישר על העובש. אם המחקר דורש רק רקמה מאזור המותאמות לשפות אחרות, מטריצה מכרסמים המוח יכול לשמש כדי לחסום את המוח על סמך הציון הידועה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>תן את המוח כערך מספרי שמות המערכת. צייר דיאגרמה כמוצג באיור1. לכתוב את המספר של המוח הראשון שהוצב כייר Megabrain בעמדה 2, עוזב את עמדה 1 כרווח כדי לסייע בזיהוי מהיר של הכיוון שבו המוח היו קפואים.</li>
	<li>בעזרת מלקחיים בוטה או פינצטה, לאסוף את המוח כדי להציב בעמדה 1. אוריינט המוח עם הצד לחתוך את הראשון כלפי מעלה. . תוריד את המוח לתוך OCT מיקום המתאים, באמצעות את הפינצטה כדי לכוונן את המיקום שלה עד שהוא מייצג באופן עצמאי.</li>
	<li>חזור על שלבים 2.3-2.5 עבור המוח/ההמיספרות הנותרים יוקפא בעמדות 3 – 10. להימנע מיקום המוח/ההמיספרות בפריסה אוסטרית.</li>
	<li>סקור כל המוח 9 ב כייר Megabrain. ברגע השכל עומדים באופן עצמאי, זקוף, מכוון כהלכה ב- OCT (כפי שמוצג באיור 2B), להוסיף עוד OCT העובש (עד מכוסים העליון של המוח). . שוב, להבטיח כי אין בועות אוויר גלוי ב- OCT.</li>
	<li>השתמש המלקחיים להחזיק את הפינה של העובש, הבטחת שהמלקחיים לא להיות חלקית שקוע ב- OCT (איור 3 א). נזהר לשמור על רמת עובש, להוריד את התבנית לתוך איזופנטאן (-45 ° C ל-50 ° C) כך התחתון השלישי של העובש שקוע. . תעצרו כאן כדי לאפשר בועות ב- OCT כדי לעלות אל פני השטח מן הרקמה (איור 3B)</li>
	<li>לאחר 30 s, התחתון התבנית כולה לתוך איזופנטאן ואת שחרור המלקחיים, עוזב את Megabrain מתחת למים למשך לפחות 3 דקות (איור 3C). להבטיח שעובש נשמרת רמה, אז המוח תישאר זקוף, קו מקביל (דמות תלת-ממד).</li>
	<li>אחרי 3 דק ', שימוש המלקחיים כדי להסיר את התבנית המכילה את הקפוא, OCT מוטבע המוח (איור 3E) מ איזופנטאן.</li>
	<li>. מיד, לעטוף את התבנית והתוכן שלה בנייר אלומיניום עם מדבקה עם מספרים בעלי חיים או זיהוי Megabrain. מגע של Megabrain קפוא בצמצום ככל האפשר כדי להימנע מפשיר את הרקמה.</li>
	<li>Megabrain זה יכול להיות עכשיו הועבר מקפיא-20 ° C, מאוחסנים למשך תקופה מינימלית של 24 שעות. הערה: פרוטוקול אפשר לעצור כאן, Megabrain ניתן לאחסן קפוא עד cryosectioning מתקיים.</li>
</ol>3. הכנת Megabrain את חלוקתה על Cryostat
<ol><li>הגדר את הטמפרטורה הקבינט של cryostat-19 מעלות צלזיוס. ודא שאת החום הגיע לפני שתמשיך. ברחבי חלוקתה, להבטיח כי הטמפרטורה ארון נשאר בין-18 ° C ו-20 ° C.</li>
	<li>. קח את Megabrain מהמקפיא-20 ° C ולמקם אותו לתוך cryostat. כמו כן, למקם של צ'אק של הממדים בגודל המתאים, ואת שני מכחולים משופעת דק cryostat. השאירו cryostat למשך 15 דקות לפחות לבוא עד הטמפרטורה של cryostat גם את Megabrain וגם את הצ'אק.</li>
	<li>בהתאם תווית שקופיות עם מספר מזהה של Megabrain, מספר השקופית. שכב שקופיות אלה על שקופית חמים (35 – 45 ° C).</li>
	<li>לפתוח את Megabrain של האלומיניום. השימוש סכין גילוח לחתוך פינות התבנית כדי לאפשר הסרה קלה של גוש של OCT מתוך העובש (איור 4A) אנכית.</li>
	<li>לוותר על שכבה דקה (בערך בעובי 3 מ מ) של OCT על גבי הצ'אק.</li>
	<li>מהר, עם קשר מינימלי בין האצבעות OCT, מניחים את Megabrain על הצ'אק, בכיוון הרצוי. מלקחיים גדול יכול לשמש גם עבור שלב זה כדי למזער את מפשיר. לפני הפעלת סעיף, לעזוב את Megabrain רכוב צ'אק ב cryostat למשך 15-20 דקות לאפשר ב- OCT כדי להקפיא לחלוטין.</li>
	<li>כאשר שכבת הבסיס של OCT קפוא, למרוח שכבה בעובי 2 מ מ OCT בצדדים של Megabrain ולאפשר זה לדרוס הצדדים על גבי הצ'אק. פעולה זו מסייעת להבטיח את Megabrain לצ'אק... שוב, לפני שתמשיך, להשאיר את צ'אק Megabrain רכוב ב cryostat למשך 15-20 דקות לאפשר ב- OCT כדי להקפיא.</li>
	<li>השתמש סכין גילוח כדי להסיר OCT עודף מכל הצדדים או בתחתית הצ'אק (איור 4B).</li>
</ol>4. Cryosectioning Megabrain
<ol><li>לפני שתתחיל, ודא גביע המכיל לפחות 20 מ ל 1 x PBS נגישה.</li>
	<li>מקם את הצ'אק, רכוב עם Megabrain, אל ראשו של צ'אק-cryostat (איור 4B).</li>
	<li>הגדר את cryostat לחתוך על העובי הרצוי. המתודולוגיה הנוכחי כבר מותאם ל- 10 מיקרומטר 50 מיקרומטר למקטעים.</li>
	<li>לקצץ OCT ורקמות לפי הצורך כדי להגיע אל האזור במוח הרצוי עבור אוסף רקמה (איור 4C).</li>
	<li>כאשר אתה מוכן לאסוף את רקמות, הורידו את הצלחת גליל נגד עד שתוצב על הבמה ולהפוך את ידית cryostat לקחת קטע בודד. הרם לאט מהצלחת אנטי-רול, להיות זהיר כי Megabrain משרטוטי לא מחובר לצלחת אנטי-רול, לא ליפול על הבמה דמות 4D).</li>
	<li>השתמש בעדינות את מכחולים כדי לבטל את הסיכום המקטע Megabrain עד הוא שוכב שטוח על הבמה cryostat (איור 5A). (אם יש צורך, להחזיק את ה-OCT שטוח באמצעות מכחולים כדי למנוע גלגול).</li>
	<li>הסר שקופיות משקופית החמים ותציב את השקופית, לצד תווית למטה, מעל המקטע Megabrain על הבמה ומאפשר את המקטע לדבוק השקופית.</li>
	<li>להחיל טיפה של PBS 1 x על כל סעיף הרקמה בשקופית ובמהירות אל תאפשר אלה להתייבש. עד שהם יש כבר מוברש שטוח (ראה שלב 4.9).</li>
	<li>השתמש בסדר משופעת במכחול טבול 1 x PBS לצחצח את בועות בתוך הרקמה, נפרשים הרקמה אז הוא שוכב שטוח על השקופית (איור 5B). לטפל לא כדי לשנות את המיקום של הסעיפים המוח, ובכך לאבד את המיקום היחסי על המקטעים רקמות אחרות. לתפעל את הרקמות בזהירות כדי להימנע דמעות. לשמור חלקים במוח הרחק לקצוות השקופית, כמו שטח היקפי נדרש עבור coverslip ו- PAP היישום עט בפרוטוקולים מסוימים מוכתמים.</li>
	<li>מקם את השקופית חזרה אל השקופית חם ויבש במשך 45 דקות הכיסוי לפי הצורך כדי למנוע אבק ליישב על הרקמה. לאחר יבש, אחסן את השקופיות ב-80 מעלות צלזיוס עד שימוש נוסף.</li>
</ol>

<ol><li>Lyck, L., Dalmau, I., Chemnitz, J., Finsen, B., Schroder, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+markers+for+quantitative+studies+of+neurons+and+glia+in+human+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical markers for quantitative studies of neurons and glia in human neocortex.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (3), 201-221 (2008).</li>
<li>Fritz, P., Wu, X., Tuczek, H., Multhaupt, H., Schwarzmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+in+immunohistochemistry.+A+research+method+or+a+diagnostic+tool+in+surgical+pathology%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Pathologica%22%5BJournal%5D)">Quantitation in immunohistochemistry. A research method or a diagnostic tool in surgical pathology?</a> Pathologica. 87 (3), 300-309 (1995).</li>
<li>Walker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+immunohistochemistry--issues+concerning+methods%2C+utility+and+semiquantitative+assessment+I%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment I.</a> Histopathology. 49 (4), 406-410 (2006).</li>
<li>Evilsizor, M. N., Ray-Jones, H. F., Lifshitz, J., Ziebell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer+for+immunohistochemistry+on+cryosectioned+rat+brain+tissue%3A+example+staining+for+microglia+and+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Primer for immunohistochemistry on cryosectioned rat brain tissue: example staining for microglia and neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (99), (2015).</li>
<li>Harrison, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolvins+AT-D1+and+E1+differentially+impact+functional+outcome%2C+post-traumatic+sleep%2C+and+microglial+activation+following+diffuse+brain+injury+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%2C+Behavior%2C+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Resolvins AT-D1 and E1 differentially impact functional outcome, post-traumatic sleep, and microglial activation following diffuse brain injury in the mouse.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 47, 131-140 (2015).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).</li>
<li>Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+bioscience+research+reporting%3A+the+ARRIVE+guidelines+for+reporting+animal+research%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research.</a> PLoS Biology. 8 (6), e1000412(2010).</li>
<li>Kennedy, H. S., Puth, F., Van Hoy, M., Le Pichon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+removing+the+brain+and+spinal+cord+as+one+unit+from+adult+mice+and+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Animal+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">A method for removing the brain and spinal cord as one unit from adult mice and rats.</a> Lab Animal (NY). 40 (2), 53-57 (2011).</li>
<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematoxylin+and+eosin+staining+of+tissue+and+cell+sections%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protocols%22%5BJournal%5D)">Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections.</a> CSH Protocols. 2008, pdb prot4986 (2008).</li>
<li>Ji, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Impact+of+Repeated+Freeze-Thaw+Cycles+on+the+Quality+of+Biomolecules+in+Four+Different+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biopreservation+and+Biobanking%22%5BJournal%5D)">The Impact of Repeated Freeze-Thaw Cycles on the Quality of Biomolecules in Four Different Tissues.</a> Biopreservation and Biobanking. 15 (5), 475-483 (2017).</li>
<li>Pegg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+history+and+principles+of+cryopreservation%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Reproductive+Medicine%22%5BJournal%5D)">The history and principles of cryopreservation.</a> Seminars in Reproductive Medicine. 20 (1), 5-13 (2002).</li>
</ol>

המחברים יש אין גילויים.

זה יש לקחת בחשבון במהלך הליך זה כי הטמפרטורה של Megabrain וסביבתו חייב להיות פיקוח מתמיד כדי למנוע מפשיר, הקפאה מחדש של הרקמה. המוח ניתן להסיר מהמקפיא-20 ° C עד כדי 3 פעמים כמו בכל פעם. אל תיגע, ב cryostat, עם תנודות טמפרטורה חמה יותר, הרקמה מפשירה על ימין ועל שמאל refreezes, גורם ריבה כמו מרקם של רקמה נורמלית שלמות10. לכן אופטימלית לחתוך את Megabrain בבת אחת.
קיבוע הרקמה cryoprotection חלקים מרכזיים של פרוטוקול זה כדי למזער את היווצרות גביש קרח, להקטין צמיחת חיידקים חי...

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול שיטה, אשר נקרא Megabrain, פותח על מנת cryosection מכרסם מרובים המוח במקביל להליכי immunohistochemical במורד הזרם. Megabrain מאפשר הייצור של שקופיות יחיד המכיל רקמות מחיות מרובים. טכניקה זו מוטבה לחתוך קטעים הילתית ההמיספרות עכברים בוגרים 9, או 5 מבוגרים. המוח מלא, בו זמנית. לכן, הטכניקה ישימה ביותר ללימודי immunohistochemical גדולים או ניתוחים אחרים שנעשה על רקמת המוח רכוב שקופיות מתוך קבוצה גדולה של בעלי חיים.
אימונוהיסטוכימיה כרוכה בשימוש של נוגדנים ספציפיים נגד חלבונים לעניין להבין ולאפיין שלהם ביטוי ושינויים סלולר רקמות ספציפיות1,2,3. השימוש אימונוהיסטוכימיה נפוצה במחקר מדעי המוח, בין דיסציפלינות מדעיות אחרים, מסייע בהבנה תאית ומולקולרית של המוח4. מחקרים רחבי היקף שכללו חיות רבות ומקטעים המוח יכול להיות אינטנסיבי בזמן והן משאבים. ככזה, יש תירוץ רבת מאחורי התפתחות Megabrain: כדי לצמצם את זמן בילה cryosectioning, הרכבה, צביעת רקמות, תוך שימוש כתוצאה מכך ריאגנטים פחות. יתר על כן, היכולת לייעל את התהליך כתם המוח מרובים באותו סיבוב מסייע להקל על חלק של השונות בין מכתים אצוות, מגבלה של אימונוהיסטוכימיה3. בנוסף, חלוקתה של Megabrain היא אלטרנטיבה חיסכון בזמן חלוקתה בודדים המוח מכרסמים קפוא ומאפשר השוואה מהירה של רקמות בין חיות או אפילו קבוצות הטיפול על ידי טכניקות במיקרוסקופ.

<table><tbody><tr><td>Andwin Scientific Tissue-tek CRYO-OCT compound (מקרה של 12)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-373-65</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Shandon Peel-A-Way תבניות הטבעה חד פעמיות</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-41</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand דיוק גבוה ישר רחב נקודה חזקה פינצטה/מלקחיים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-000-128</td><td></td></tr><tr><td>פישרברנד 20 מ"ל HDPE בקבוקוני נצנוץ עם כובע פוליפרופילן</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>03-337-23</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז, בקבוק פולי 2.5 ק"ג</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>S2-212</td><td>יש להשלים ריכוזי סוכרוז של 15% ו-30%.</td></tr><tr><td>2-מתילבוטן (מוסמך), פישר כימיקל</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>O3551-4</td><td></td></tr><tr><td>PYREX כוסות בעלות צורה גבוהה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>02-546E</td><td></td></tr><tr><td>פישרברנד מדחום טבילה חלקית נוזל בזכוכית לשימוש כללי (-50 עד +50 &deg; ג)</td> <td>פישר סיינטיפיק</td><td>13-201-642</td><td></td></tr><tr><td>פישרברנד&nbsp; Scoopula Spatula</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-357Q</td><td></td></tr><tr><td>STANLEY סכין גילוח</td><td>Grainger</td><td>4A807</td><td></td></tr><tr><td>להבי מיקרוטום Edge-Rite</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>14-070-60</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ (1 אינץ' כפור) - לבן</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>22-034-979</td><td></td></tr><tr><td>Gibco&nbsp; PBS (Phosphate Buffered Saline) 10x, pH 7.2</td><td>Fisher Scientific</td><td>70-013-032</td><td>לדלל ל-1X&nbsp; לפני השימוש</td></tr><tr><td>15 חתיכות מברשות צבע עדינות</td><td>Amazon</td><td>B079J12ZRV</td><td></td></tr><tr><td>PAP pen</td><td>abcam</td><td>ab2601</td><td></td></tr><tr><td>צ'אק המוצג באיור 4 יוצר בהתאמה אישית על ידי טכנאי מעבדה, אולם גדלים דומים זמינים להזמנה מחברות אחרות באופן מסחרי.</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>EMS065</td><td></td></tr></tbody></table>

cryosectioning בו זמנית של המוח מכרסמים מרובים

Simultaneous Cryosectioning of Multiple Rodent Brains

היסטולוגיה אימונוהיסטוכימיה שיטות שגרתיות של ניתוח כדי להמחיש אנטומיה מיקרוסקופיים, בתרגום חלבונים בתוך רקמה ביולוגית בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. מדעי המוח, כמו גם למגוון רחב של תחומים מדעיים אחרים, טכניקות אלו משמשים. אימונוהיסטוכימיה יכול להיעשות על שקופית רכוב רקמות או מקטעים לתרשים. הכנת דוגמאות רכוב שקופיות הוא תהליך אינטנסיבי זמן. פרוטוקול הבאים עבור טכניקה, קרא את Megabrain, מופחת לוקחים את הזמן כדי cryosection ו הר רקמת המוח על ידי 90% על-ידי שילוב המוחות מרובים לתוך בלוק קפוא יחיד. יתר על כן, טכניקה זו הקטינה השתנות ראיתי בין מכתים סיבובים, במחקר פתולוגיה גדולים. הטכניקה הנוכחי הותאם לשימוש רקמת המוח מכרסמים בניתוחים immunohistochemical במורד הזרם; עם זאת, ניתן להחיל אותה על תחומים מדעיים שונים, להשתמש cryosectioning.

תוצאה חיובית סיום הליך זה הוא רקמה שנמצאת על השקופית, ללא בועות או דמעות, הכיוון שבו הם קפאו. מקטעי רקמת רווח אחיד בנפרד, קל לזיהוי בשל מיקום טוב של המוח ב- OCT ואת בסימון טוב כפי שהוכח באיור1. בהנחה רקמת המוח נאסף מבעלי חיים בגיל דומה, וכי הרקמה היה מיושר כראוי ב- OCT, סעיפים שנאספו בשקופית אמור לייצג מטוס הילתית דומה, המאפשר השוואה של אזורים במוח בין בעלי חיים. ובלבד הרקמה קפוא, עם החפץ ההקפאה מינימלי, צביעת המטוקסילין -אאוזין יכול להתבצע כדי להעריך את איכו...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול הקפאה של סעיף רקמת מוח מחיות מרובים כחלופה ייעול עיבוד המוח יחיד. זה מפחית את השתנות מכתימים במהלך אימונוהיסטוכימיה, מפחית את הזמן cryosectioning והדמיה.

Cryosectioning בו זמנית של המוח מכרסמים מרובים

Histology and immunohistochemistry are routine methods of analysis to visualize microscopic anatomy and localize proteins within biological tissue. In ...

שיטה זו חוסכת זמן מפחיתה את השונות בין סבבים של הליכים אימונוהיסטוכימיים במחקרים במדעי המוח כדי לייעל את ההדמיה של אנטומיה וחלבונים ורקמות מקומיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מפחיתה את הזמן שנלקח להקפאה ולהוות רקמת מוח על ידי שילוב מוחות מרובים לבלוק קפוא אחד. בעוד טכניקה זו מותאמת עבור חלקים coronal של מוח מכרסמים, זה יכול להיות מותאם קטעים קשתית או רוחבית או סוגים שונים של רקמות כגון שריר או כבד.לאחר זלוח טרנסקרדיאלי מוצלח, לאחר תיקון המוחות מבעלי החיים בבקבוקון של 25 מיליליטר של 4% paraformaldehyde ב- PBS במשך 24 שעות. לאחר מכן, השתמש במקלות קהות כדי להסיר את המוח מן paraformaldehyde. מעבירים את המוח לבקבוקון עם כ-20 מיליליטר של תווי סוכרוז 30% ב-TBS.שמור על המוח והפתרון עד שהם שוקעים לתחתית הבקבוקון. לאחר מכן, מניחים זכוכית 500 מיליליטר על מצע של קרח יבש בדלי קרח. ואז לשפוך 300 עד 400 מיליליטר של isopentane לתוך המק.לשמור על האיזופנטאן בין שלילי 45 ו שלילי 50 מעלות צלזיוס. על הספסל העליון, למלא תבנית הטבעה חד פעמית בערך באמצע הדרך מלאה עם טמפרטורת חיתוך אופטימלית או תרכובת OCT. השתמש במחט כדי להסיר את כל בועות האוויר מן התבנית.השתמש במקלות עם קצה קהה כדי להסיר את המוח הראשון מתסמת סוכרוז. לאחר מכן השתמש בסכין גילוח חדש כדי להסיר את המוח הקטן ואת נורות הריח לפני הפרדת ההמיספרות. לאחר מכן, תן למוח מערכת שמות מספרית.השתמש מטס קהה, להרים את המוח להיות ממוקם בעמדה 2, ולכוון אותו עם הצד להיחתך הראשון פונה כלפי מעלה. מנמיכים את המוח לתוך OCT ולהשתמש פינצטה כדי להתאים את מיקומו עד שהוא עומד באופן עצמאי. שינוי מפתח בטכניקה זו הוא השטח הריק במיקום הראשון.מרחב זה נועד לאפשר זיהוי קל של כיוון המגה-ברין ולכן לזהות את החיה הקשורה לכל מוח. לאחר שכל המוחות היו ממוקמים בתבנית, להוסיף מספיק OCT כדי לכסות את החלק העליון של המוח, ולאחר מכן להשתמש במחט כדי להסיר את כל בועות האוויר. החזק את הפינה של התבנית עם מדפים להבטיח המדפים לא להיות שקוע חלקית OCT.לאחר מכן, להוריד את התבנית לתוך isopentane כך השלישי התחתון של התבנית שקוע. לאחר 30 שניות, להוריד את התבנית כולה לתוך isopentane ולשחרר אותו מן המדפים. לאחר שלוש דקות, השתמש במדפים כדי להסיר את התבנית מן isopentane.מיד לעטוף את התבנית ואת התוכן שלה בנייר אלומיניום ולתייג אותו כראוי. מעבירים את המגה-ברין למקפיא שלילי של 20 מעלות למשך 24 שעות לפחות. ראשית, להגדיר את הטמפרטורה של ארון קריוסטט שלילי 19 מעלות צלזיוס.מוציאים את המגה-ברין מהמקפיא ומ מניחים אותו בהקפאה. לאחר מכן מניחים צ'אק ושני מברשות צבע דקות בהקפאה. לאחר מכן, תייג את השקופיות עם מספר הזיהוי של מגה-רין ומספר השקופית והשכב את השקופיות על השקופית חמה יותר.לאחר מכן, יש לבטל את הבעירה ולהשתמש בסכין גילוח כדי לחתוך את פינות התבנית. לוותר על שכבה דקה של OCT על צ'אק. ואז במהירות למקם את המגה-ברין על הצ'אק.לאחר OCT הוא קפוא לחלוטין, להחיל שכבה שני מילימטר של OCT סביב הצדדים של megabrain ולאפשר לו לרוץ במורד הצדדים על צ'אק. השתמש בסכין גילוח כדי להסיר כל עודף OCT מהצדדים והתחתית של צ'אק. ראשית, מקם את הצ'אק רכוב עם המגה-ביין על ראש הצ'אק של הקריוסטאט.לאחר מכן הגדר את ההקפאה לעובי הרצוי. חתוך את OCT ואת הרקמה לפי הצורך כדי להגיע לאזור המוח הרצוי לאיסוף רקמות. לאחר מכן הורידו את צלחת האנטי-רול עד שהיא מונחת על הבמה וסובבו את ידית ההקפאה כדי לקחת קטע אחד.לאט להרים את צלחת נגד רול, להיות זהיר כי סעיף הרקמה לא נגע. השתמש בעדינות במברשות הצבע כדי לפרוק את קטע הרקמה עד שהוא שוכב שטוח. במידת הצורך, החזק את הדירה OCT בשימוש במברשות הצבע כדי למנוע גלגול.לאחר מכן הסר את השקופית ממחמם השקופיות ורחף עם צד תווית השקופית כלפי מטה מעל המקטע מגה-רין ואפשר לה להיצמד לשקופית. החל במהירות טיפה של PBS על סעיף הרקמה. באמצעות מברשת צבע עם קצה דק טבול PBS, לצחצח את כל הבועות בסעיף הרקמה ולפרוש את הרקמה כך שהוא שוכב שטוח על השקופית.לבסוף, מניחים את השקופית על השקופית חם יותר להתייבש במשך 45 דקות ולאחסן את השקופית ב שלילי 80 מעלות צלזיוס. בפרוטוקול זה, רקמת מוח מתשעה בעלי חיים הוכנו והוקפאו בו זמנית. לאחר קריוסקציה, כתמי H&E יכולים להתבצע כדי להעריך את איכות cryoprotection.תוצאות מייצגות של מולקולת מתאם מחייב סידן מיויננית אחת או כתמי Iba1 של microglia מראים כתמים עקביים בין כל מוח מחקר על מגה-בריין יחיד. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור כל הזמן לפקח על הטמפרטורה תוך הקפאת megabrain כדי למנוע פיצוח או הפשרה ולאחר מכן הקפאת הרקמה אשר מוביל שלמות רקמות חריגה. לא מומלץ להפריד קבוצות טיפול שונות במגה-בריינים נפרדים כיוון שזה יכול ליצור שונות בין קבוצות במהלך הכתמות ולהפחית הטיה וסובייקטיביות במהלך הדמיה וניתוח.אל תשכח כי עבודה עם paraformaldehyde יכול להיות מסוכן מאוד אמצעי זהירות כגון לבישת PBE ועובד ברדס תמיד צריך להילקח בעת ביצוע הליך זה.

simultaneous-cryosectioning-of-multiple-rodent-brains

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

פרופיל ביטוי של RNA מאזורים מובחנים במוח של עכבר דורש אסטרטגיה מדויקת וחזרתית לאיסוף רקמות. כאן מתואר פרוטוקול המשתמש הן בחיתוך קורונלי של המוח והן במיקרודיסקציה בעזרת מחלל רקמות (tissue corer). התנובה והאיכות של ה-RNA הכולל שהתקבל מהדגימות שהופקו מאשרות את יעילותו של המהלך המתואר.

Non-לייזר מיקרוסקופית לכידת גישה עבור Microdissection של אזורים במוח דיסקרטית עכבר עבור בידוד RNA סך סידור Downstream הדור הבא והביטוי פרופיל גנטי

אנו מתארים הליכי הכנה הקלטה אלקטרו מן פרוסות המוח השומרים על הציר הגבי-הגחוני של הקורטקס המדיאלי entorhinal (MEC). בגלל קידוד עצבי של מיקום כדלקמן הארגון הגב, הגחון בתוך MEC, נהלים אלה להקל על החקירה של מנגנונים תאיים חשובים לניווט וזיכרון.

הכנת פרוסות Parasagittal לחקירת ארגון הגבי-הגחוני של הקורטקס המדיאלי מכרסמים entorhinal

סרטון זה מדגים פרוטוקול מפורט שלב אחר שלב להכנת מקטעי רקמת מוח של עכברים קפואים לניתוחים במורד הזרם.

עיבוד מוח של עכבר לניתוח במורד הזרם

פרוטוקול זה מתאר צעדים פרוצדורליים בסיסיים לביצוע הקלטות תיקון- clamp כל תא. טכניקה זו מאפשרת חקר ההתנהגות החשמלית של נוירונים, וכאשר ביצע פרוסות המוח, מאפשר הערכה של פונקציות עצביים שונים מתא עצב שעדיין משולבים מעגלים במוח השתמרות טוב יחסית.

הקלטות תיקון מהדק כל תא פרוסות המוח

קריו-סעיפים רצופים נאספים כדי לאפשר יישומים היסטולוגית והעשרה של RNA למדידות ביטוי גנים באמצעות אזורים סמוכים מתוך שרירי שלד יחיד עכבר. RNA באיכות גבוהה מתקבל מ 20 - 30 מ"ג של cryosections ומדידות ונקווה מושווים ישירות בין יישומים.

Cryosectioning של רציף אזורים של שרירי שלד עכבר אחת על ביטוי גנים ועל ניתוח היסטולוגית

כאן, אנו מספקים שיטה נמוכים ואמין כדי ליצור electroporated המוח organotypic פרוסה תרבויות מעוברים עכבר מתאים מיקרוסקופיה קונפוקלית טכניקות הדמיה לחיות.

. פשוט תאכל לשעבר אלקטרופורציה ותרבויות פרוסה Organotypic מוח עובריים בעכבר עבור Live-הדמיה של העברת Interneurons GABAergic

הליך זה מתאר את אוסף אזורי המוח קפוא בנפרד כדי להשיג חלבון באיכות גבוהה ו-RNA באמצעות כלים זולים וזמינים בדרך כלל.

אוסף של אזורים קפואים המוח מכרסם עבור ניתוח במורד הזרם

אנו מציגים פרוטוקול מהיר, שלב אחר שלב, להסרת מוח עכבר ודיסקציה של אזורים בדידים מרקמת מוח טרייה. השגת אזורי מוח לניתוח מולקולרי הפכה לדבר שבשגרה במעבדות רבות למדעי המוח. אזורי מוח אלה מוקפאים באופן מיידי כדי לקבל נתוני תעתיק באיכות גבוהה לניתוח ברמת המערכת.

מיקרו-דיסקציה של מוח העכבר לאזורים שונים מבחינה תפקודית ואנטומית

הפרוטוקול הנוכחי מתאר כריתה סטנדרטית של גידולי מוח במכרסמים באמצעות גישה זעיר פולשנית עם מערכת שימור רקמות משולבת. לטכניקה זו יש השלכות על שיקוף מדויק של סטנדרט הטיפול במכרסמים ובמודלים אחרים של בעלי חיים.

יישום כריתה זעיר פולשנית של גידולי מוח במכרסמים לאיסוף רקמות בעלות כדאיות גבוהה

הפרוטוקול הנוכחי מתאר אסטרטגיה מעשית לזרז את שלב האימות של קואורדינטות הזרקה סטריאוטקסיות לפני ביצוע מעקב נגיפי באמצעות צבעים ומקטעים קפואים.

אימות ראשוני של קואורדינטות הזרקה סטריאוטקסיות באמצעות קריוסקציה

מדעי המוח המודרניים צריכים לחקור הבדלים בין מינים רבים, כולל מכרסמים במעבדה ובני אדם. עם זאת, קשיים טכניים מתעוררים כאשר מעורבים יונקים בעלי מוח גדול. גישה זו מתייחסת לשונות בין-מינים באוכלוסיות נוירונים ביונקים שונים מאוד, ומניבה תוצאות דומות למיפוי לחשיפת דפוסי אבולוציה.

גישה השוואתית למחקרי ספירת תאים כמותיים במוחות יונקים שונים מאוד

למדו שיטת קריוסקשן בו-זמנית למוחות מכרסמים מרובים להפחתת שונות בתהליכי אימונוהיסטוכימיה. פרוטוקול זה משפר עקביות בדיגום רקמות ומייעל הכנת דגימות למחקר נוירולוגי.

Cryosectioning בו זמנית של המוח מכרסמים מרובים

גלה סרטונים נוספים