Cryosectioning בו זמנית של המוח מכרסמים מרובים

שיטה זו חוסכת זמן מפחיתה את השונות בין סבבים של הליכים אימונוהיסטוכימיים במחקרים במדעי המוח כדי לייעל את ההדמיה של אנטומיה וחלבונים ורקמות מקומיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מפחיתה את הזמן שנלקח להקפאה ולהוות רקמת מוח על ידי שילוב מוחות מרובים לבלוק קפוא אחד. בעוד טכניקה זו מותאמת עבור חלקים coronal של מוח מכרסמים, זה יכול להיות מותאם קטעים קשתית או רוחבית או סוגים שונים של רקמות כגון שריר או כבד.

לאחר זלוח טרנסקרדיאלי מוצלח, לאחר תיקון המוחות מבעלי החיים בבקבוקון של 25 מיליליטר של 4% paraformaldehyde ב- PBS במשך 24 שעות. לאחר מכן, השתמש במקלות קהות כדי להסיר את המוח מן paraformaldehyde. מעבירים את המוח לבקבוקון עם כ-20 מיליליטר של תווי סוכרוז 30% ב-TBS.

שמור על המוח והפתרון עד שהם שוקעים לתחתית הבקבוקון. לאחר מכן, מניחים זכוכית 500 מיליליטר על מצע של קרח יבש בדלי קרח. ואז לשפוך 300 עד 400 מיליליטר של isopentane לתוך המק.

לשמור על האיזופנטאן בין שלילי 45 ו שלילי 50 מעלות צלזיוס. על הספסל העליון, למלא תבנית הטבעה חד פעמית בערך באמצע הדרך מלאה עם טמפרטורת חיתוך אופטימלית או תרכובת OCT. השתמש במחט כדי להסיר את כל בועות האוויר מן התבנית.

השתמש במקלות עם קצה קהה כדי להסיר את המוח הראשון מתסמת סוכרוז. לאחר מכן השתמש בסכין גילוח חדש כדי להסיר את המוח הקטן ואת נורות הריח לפני הפרדת ההמיספרות. לאחר מכן, תן למוח מערכת שמות מספרית.

השתמש מטס קהה, להרים את המוח להיות ממוקם בעמדה 2, ולכוון אותו עם הצד להיחתך הראשון פונה כלפי מעלה. מנמיכים את המוח לתוך OCT ולהשתמש פינצטה כדי להתאים את מיקומו עד שהוא עומד באופן עצמאי. שינוי מפתח בטכניקה זו הוא השטח הריק במיקום הראשון.

מרחב זה נועד לאפשר זיהוי קל של כיוון המגה-ברין ולכן לזהות את החיה הקשורה לכל מוח. לאחר שכל המוחות היו ממוקמים בתבנית, להוסיף מספיק OCT כדי לכסות את החלק העליון של המוח, ולאחר מכן להשתמש במחט כדי להסיר את כל בועות האוויר. החזק את הפינה של התבנית עם מדפים להבטיח המדפים לא להיות שקוע חלקית OCT.

לאחר מכן, להוריד את התבנית לתוך isopentane כך השלישי התחתון של התבנית שקוע. לאחר 30 שניות, להוריד את התבנית כולה לתוך isopentane ולשחרר אותו מן המדפים. לאחר שלוש דקות, השתמש במדפים כדי להסיר את התבנית מן isopentane.

מיד לעטוף את התבנית ואת התוכן שלה בנייר אלומיניום ולתייג אותו כראוי. מעבירים את המגה-ברין למקפיא שלילי של 20 מעלות למשך 24 שעות לפחות. ראשית, להגדיר את הטמפרטורה של ארון קריוסטט שלילי 19 מעלות צלזיוס.

מוציאים את המגה-ברין מהמקפיא ומ מניחים אותו בהקפאה. לאחר מכן מניחים צ'אק ושני מברשות צבע דקות בהקפאה. לאחר מכן, תייג את השקופיות עם מספר הזיהוי של מגה-רין ומספר השקופית והשכב את השקופיות על השקופית חמה יותר.

לאחר מכן, יש לבטל את הבעירה ולהשתמש בסכין גילוח כדי לחתוך את פינות התבנית. לוותר על שכבה דקה של OCT על צ'אק. ואז במהירות למקם את המגה-ברין על הצ'אק.

לאחר OCT הוא קפוא לחלוטין, להחיל שכבה שני מילימטר של OCT סביב הצדדים של megabrain ולאפשר לו לרוץ במורד הצדדים על צ'אק. השתמש בסכין גילוח כדי להסיר כל עודף OCT מהצדדים והתחתית של צ'אק. ראשית, מקם את הצ'אק רכוב עם המגה-ביין על ראש הצ'אק של הקריוסטאט.

לאחר מכן הגדר את ההקפאה לעובי הרצוי. חתוך את OCT ואת הרקמה לפי הצורך כדי להגיע לאזור המוח הרצוי לאיסוף רקמות. לאחר מכן הורידו את צלחת האנטי-רול עד שהיא מונחת על הבמה וסובבו את ידית ההקפאה כדי לקחת קטע אחד.

לאט להרים את צלחת נגד רול, להיות זהיר כי סעיף הרקמה לא נגע. השתמש בעדינות במברשות הצבע כדי לפרוק את קטע הרקמה עד שהוא שוכב שטוח. במידת הצורך, החזק את הדירה OCT בשימוש במברשות הצבע כדי למנוע גלגול.

לאחר מכן הסר את השקופית ממחמם השקופיות ורחף עם צד תווית השקופית כלפי מטה מעל המקטע מגה-רין ואפשר לה להיצמד לשקופית. החל במהירות טיפה של PBS על סעיף הרקמה. באמצעות מברשת צבע עם קצה דק טבול PBS, לצחצח את כל הבועות בסעיף הרקמה ולפרוש את הרקמה כך שהוא שוכב שטוח על השקופית.

לבסוף, מניחים את השקופית על השקופית חם יותר להתייבש במשך 45 דקות ולאחסן את השקופית ב שלילי 80 מעלות צלזיוס. בפרוטוקול זה, רקמת מוח מתשעה בעלי חיים הוכנו והוקפאו בו זמנית. לאחר קריוסקציה, כתמי H&E יכולים להתבצע כדי להעריך את איכות cryoprotection.

תוצאות מייצגות של מולקולת מתאם מחייב סידן מיויננית אחת או כתמי Iba1 של microglia מראים כתמים עקביים בין כל מוח מחקר על מגה-בריין יחיד. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור כל הזמן לפקח על הטמפרטורה תוך הקפאת megabrain כדי למנוע פיצוח או הפשרה ולאחר מכן הקפאת הרקמה אשר מוביל שלמות רקמות חריגה. לא מומלץ להפריד קבוצות טיפול שונות במגה-בריינים נפרדים כיוון שזה יכול ליצור שונות בין קבוצות במהלך הכתמות ולהפחית הטיה וסובייקטיביות במהלך הדמיה וניתוח.

אל תשכח כי עבודה עם paraformaldehyde יכול להיות מסוכן מאוד אמצעי זהירות כגון לבישת PBE ועובד ברדס תמיד צריך להילקח בעת ביצוע הליך זה.