אינדוקציה והערכה של נישואי קרובים צלבים באמצעות הנמלים, Vollenhovia Emeryi

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בביולוגיה המולקולרית ובתחומים הגנטיים של Hymenoptera, כגון מערכות קביעת מין. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאנחנו יכולים בקלות לגרום קווי הכלאה מעל הנמלה Vollenhovia אמרי, אשר חיוניים עבור מיפוי גנטי ואת המצב המולקולרי. לכן, משימה זו יכולה לספק תובנה על מערכת קביעת המין של נמלה ספציפית והיא עשויה להיות מיושמת גם על נמלים אחרות ומינים אחרים של Hymenoptera, כגון צרעות.

כדי להתחיל את הפרוטוקול, לאסוף מושבות V.Emeryi במהלך תחילת הקיץ. מעבירים את דגימות הנמלים מהענפים שנאספו לקן טיח מלאכותי עם כיסוי זכוכית, באמצעות שאפתן. שמור על המושבות בקן המלאכותי ב 25 מעלות צלזיוס, תחת מחזור 16 עד שמונה שעות בהיר כהה.

לספק מי ברז עם בקבוק לשטוף כדי לשמור על הטיח לח כל יומיים באותו זמן. לאחר מכן, הוסיפו כ-100 מיקרוגרם של אבקת קריקט יבשה עטופה בנייר אלומיניום וקצות מלאי סוכר חומים למושבה, תוך שימוש בקצה של 20 מיקרוליטר מדי יומיים עד שיצוצו נמלי רבייה חדשות. חשוב לאסוף מושבות מיקרו מהשדות ולספק להם מספיק מזון כדי להשיג מלכות וזכרים חדשים.

ראשית, למנוע מאנשים לנוע על ידי הצבת מושבות בחדר עם סביבה מבוקרת להגדיר בארבע מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. הסר את הרגליים האמצעיות של 30 נמלים עובדים באמצעות מלקעות תחת סטריאוסקופ כדי להבדיל את דור ה-F-zero מהעובדים המיוצרים בצלבים הכלאה הבאים. ואז להעביר את הנמלים לתוך קן גבס קטן חדש עבור צלבים הכלאה.

לאחר מכן, להוסיף שלושה עד ארבעה זחלים או ערווה לתוך קן גבס המכיל עובדים. מעבירים מלכה ארוכה מכונפת וזכר לקן גבס שהוכן בעבר להלבנה של צלבים. עבור צעד זה, חשוב לשמור על מושבת חצייה ניסיונית באותו מצב כמו זה של מושבה נורמלית.

קשה לגרום להתרבות רק על ידי הצבת זכרים ונקבות יחד. שמור על המושבות ב 25 מעלות צלזיוס תחת 16 עד שמונה שעות אור, מחזור כהה עם מזון ומים מסופקים עד המלכה מאבדת את כנפיה ומטיל ביצים. בדוק את המושבה הניסיונית כל יום תחת מיקרוסקופ סטריאו.

לאחר הגדרת הצלבות הכלאה בין צאצאי F-One, ניתן לצפות בביצים תחת סטריאוסקופ. לאחר שמלכת ה-F-One מתחילה להטיל ביצים, מוציאים את זכרי ה-F-1 והזחלים או הערווה מהקן כדי למנוע מדור ה-F-1 ומדור ה-F-2 לערבב. שמור על המושבות באותם תנאים עד צאצאי F-2 להגיח.

הסר רגל אחת של מלכת F-אפס באמצעות מלקעות. מעבירים את הרגל לצינור מיקרו 1.5 מיליליטר המכיל 100 מיקרוליטר של חומר צמרמורת. תחת סטריאוסקופ לנתח בטן נקבה בצלחת זכוכית מלא 300 microliters של מים טהורים במיוחד באמצעות מדפים.

לנטרל את הזרע המכיל את הזרע של זכרים מום. לקלף את הרקמה של spermatica ולבודד את הזרע מן הרקמה של הנקבה באמצעות סיכות חרקים. באמצעות כרית מיקרו פאי, להעביר את הזרע לתוך צינור מיקרו 1.5 מיליליטר המכיל 100 microliters של סוכן צמרמורת.

דגירה הדגימות ממלכת F-אפס וזרע ב 95 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. פלאש סנטרו להתיך את צינור מיקרו ולאחסן את הדגימות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר אישור ייצור הביצה על ידי מלכת F-One siv-mated, לחלץ את ה-DNA של המלכה באמצעות כנפי לשפוך או רגל אחת באמצע וגנוטיפ.

לאחר מכן, לחלץ את ה-DNA של זכר F-אחד על ידי genotyping רגל אחת. כדי להעריך את הפוריות של הנמלים הזכריות מהצלבים הרבייה, לנתח איברי רבייה פנימיים בצלחת זכוכית עם 400 microliters של פתרון PBS באמצעות מדפים. לאחר מכן להסיר את PBS ולהחליף אותו עם ארבעה אחוז paraformaldihyde באמצעות כרית עוגה מיקרו.

לתקן את הרקמה על ידי דגירה הדגימות PFA במשך ארבעים דקות בטמפרטורת החדר. לאחר קיבעון, לשטוף את הרקמות חמש פעמים עם 400 microliters של PBS באמצעות כרית עוגה מיקרו. לדלל פתרון DAPI למיליגרם אחד למיליליטר ב- PBS.

הסר את PBS ולהוסיף כ 300 microliters של פתרון כתמים DAPI מדולל לרקמה. דגירה הרקמה במשך 15 דקות בתנאים כהים טמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, לשטוף את הרקמה חמש פעמים עם 400 microliters של PBS ולהעביר את הרקמה למרכז מגלשת זכוכית באמצעות מטליות.

ואז לעלות על הרקמה על מדיום הרכבה המכיל TRITC tetramethylrhodamine. לבסוף לבחון את הדגימות עם מיקרוסקופ סריקת לייזר confocal באמצעות 20 או 60 3x עדשות אובייקטיביות. תמונות מיקרוסקופיות של אשכים של זכר הפלואיד v אמרי להראות רקמה סיבית בריאה או זרע אשר נעדרים זכר Diploid v אמרי, אשר לא הראה רקמה סיבית בריאה.

איברי הרבייה הגבריים של זכר דיפלואיד נגד אמרי לא ייצרו זרע והאבכים שלהם לא התפתחו, מה שמרמז על כך שהזכרים המיוצרים בצלבי הכלאה הם סטריליים. לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה לנו את הדרך לחקור את מיאטוני המין קבוע בוולנהוביה אמרי עבור מיני הנמלים בתזמון מהיר.