שילוב של צביעת פתולוגיה וניתוח התמונה לכמת עמילן ב Primordia השחלה של דובדבן מתוק במהלך החורף תרדמה

אנו מציגים מתודולוגיה לכמת את תכולת עמילן primordia שחלה בדובדבן מתוק (שקד avium ל') במהלך החורף תרדמה באמצעות מערכת ניתוח תמונה בשילוב עם טכניקות מעבדה הומנית.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח על רדומים בצמח עצי, כגון מדוע ניצני הפרחים צריכים לצבור קר במהלך החורף לפרוח כראוי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לכמת את עמילן בדגימות קטנות מאוד של פריפורדיום פרחים. גישה זו שימושית מאוד כדי לזהות את הפעילות הפיזיולוגית של פריפורדיום הפרח במהלך המעונות והוא יכול להיות מיושם גם על מיני עצים אחרים כמו משמש או שזיף.

למרות שיטה זו יכולה לספק תובנה לתוך ניצן פרח רדום, זה יכול להיות מיושם גם על תהליכים אחרים כגון שלב הרבייה מהאבקה להתפרצות של פירות. כדי להתחיל, לאסוף חמש יריות מהשדה. ואז לשקול ולתקן 10 ניצני פרחים בצינור זכוכית 10 מיליליטר עם פתרון קיבוע לפחות 24 שעות בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, להשליך את התיקון ולהוסיף מספיק 75%אתנול כדי לכסות את הדגימות. להשיג שלושה יורה כי הם 15 עד 30 ס"מ אורך וחמישה מילימטרים קוטר עם 10 ניצני פרחים כל אחד. ואז למקם את היורה על קצף של חנות פרחים ספוגה במים בתא צמיחה.

לאחר 10 ימים בתא הצמיחה, להסיר את ניצני הפרח מן היריות ולשקול אותם. כל שבוע מתחילת הסתיו עד budburst באביב, להעריך את הצמיחה של ניצני הפרחים. הסר את קשקשי הניצנים החיצוניים מכל דגימה, ולאחר מכן מקם כל ניצן בזכוכית של השען המכילה 75%אתנול.

השתמש מטלפים מדויקים אזמל עיניים כדי לנתח את הניצנים ולקבל לפחות פרימורדיום פרח אחד מכל ניצן. להטמיע את הדגימות בנפרד שעווה פרפין כדי ליצור בלוק ולקטע אותם על microtome סיבובי. לאחר חתך את הדגימות, להחיל טיפה של יוד טרי של Lugol על קטע.

לאחר חמש דקות, להסיר כתם עודף עם נייר סופג. לאחר מכן להחיל טיפה קטנה של מדיה הרכבה סינתטית, למקם כיסוי קטן על המדגם, ולחץ חזק. לאחר שאמצעי התקשורת ההרכבה יבשים, שימו לב לקטע המוכתם תחת מיקרוסקופ שדה בהיר.

תחילה התאימו את הסרעפת של הצמצם ואת בקרת הבהירות בהתאם לפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן ודא שאין מסננים במחזיק המסנן ובחר מצב שדה בהיר במיקרוסקופ. לאחר מכן, להתאים את הגדרות המצלמה להכנה מוכתמת ללא רקמה.

תקן את הבהירות ב- 50%Next הפעל את פונקציית חשיפת יתר/חשיפת חסר והתאם את זמן החשיפה במגבלת חשיפת יתר. החל את פונקציית האיזון הלבן ואת תיקון ההצללה. למדוד את הרמה האפורה של התמונה בשחור-לבן וכתוצאה מכך של ההכנה מוכתמת ללא רקמה.

לאחר מכן להחיל מסנן 4N, לרכוש תמונה נוספת בשחור-לבן של ההכנה ולמדוד את רמת האפור. לאחר מכן להשיג תמונה של אותה הכנה ללא אור ולמדוד את הרמה האפורה של התמונה וכתוצאה מכך לכייל. לאחר מכן, לרכוש תמונת צבע של מקטע לדוגמה בפורמט TIFF עם רזולוציה של לפחות 300 dpi.

צרו תמונה בינארית המתאימה לאזור המוכתם, ולאחר מכן קבעו את שלושת ספי הצבע עד שהתמונה הבינארית משקפת במדויק את גרגירי עמילן מוכתמים. חזור על תהליך זה עם הכנות ורקמות אחרות כדי לכוונן את רמות הגילוי הסופי. באמצעות מערכת ניתוח התמונה, למדוד את סכום הצפיפות האופטית של כל פיקסל מתחת למסכה כדי לכמת את תוכן עמילן בשדה.

בפרוטוקול זה, צמיחת ניצן הפרחים ומעמד המעונות הוערכו על ידי מדידת העלייה במשקל ניצן לאחר 10 ימים בתנאים מתאימים. במהלך המעונות, לא נצפו שינויים לאחר 10 ימים בתנאים מתאימים. ברגע שהתגברו על המעונות, הניצנים התנפחו והתפוצצו בתא הצמיחה.

תוכן עמילן בפרימדוריום השחלה כומת באמצעות ניתוח תמונה בכל קטע microtomed. באופן עקבי, כמות עמילן בתחילת החורף הציג ערך צפיפות אופטית פחות מ 40, 000 ואת הסכום המרבי הגיע ערך בין 120, 000 ו 140, 000 במהלך שתי שנות המחקר. אם לוקחים בחשבון את המעונות, הכמות המקסימלית של עמילן התרחשה במקביל למימוש המצמרר בשתי השנים.

חשוב לזכור שרמות הזיהוי המשמשות את מנתח התמונות תלויות ישירות בכיול המערכת. זה כולל מצב אור, עוצמת כתם והגדלת המיקרוסקופ. יש לתקן תנאי זה עבור כל ההכנות.

השילוב של טכניקות היסטוכימיות עם ניתוח תמונה הביא מאוד שימושי לבחון את עתודה פחמימות של פריפורדיום הפרחים בשלבים שונים של רדום. זה יכול להיות מיושם גם על מינים ורקמות אחרים. הקשר בין שחרור רדום הצטברות עמילן בפרימורדיה השחלה חשפה על ידי השימוש בשיטה זו לספק בסיס קול כדי להבין את הבסיס הביולוגי של דרישות רדומים מצמרר.

מאמץ עתידי צריך להיות ממוקד בחקר אינדיקטורים ביולוגיים אמינים שיכולים בקלות להצביע על מצב המעונות של העץ. בינתיים, הדפוס של וריאציות עמילן לאורך רדום יכול לשמש כדי למסגר מחקרים פיזיולוגיים וגנטיים נוספים.