Name: שילוב של צביעת פתולוגיה וניתוח התמונה לכמת עמילן ב Primordia השחלה של דובדבן מתוק במהלך החורף תרדמה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: למד כיצד לכמת עמילן בפרימורדיה של שחלת דובדבן מתוק במהלך תרדמת החורף באמצעות צביעה פתולוגית וניתוח תמונה. שיטה זו מאפשרת לחקור פעילות פיזיולוגית בדגימות קטנות ולהבין את הבסיס הביולוגי של תרדמה ודרישות הקירור.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים בתודה מריה Herrero, Eliseo ריבאס על דיון מועיל ועצות שלהם. עבודה זו נתמכה על ידי y Ministerio דה Economía Competitividad — קרן פיתוח אזוריים אירופה, האיחוד האירופי [מספר גרנט ולבס-2010-037992 ל פ א]; y אינסטיטוטו נאסיונאל דה Investigación Tecnología Agraria y Alimentaria [גרנט מספרים RFP2015-00015-00, RTA2014-00085-00, RTA2017-00003-00]; ארמון דה שמאייש — קרן חברתית אירופה, האיחוד האירופי [Grupo Consolidado A12-17R].

1. תרדמה נחישות ואיסוף חומרים צמח
<ol><li>לטעום את ניצני פרחים בשדה. תרדמה מחקרים ניסויים ארוכי טווח, דרוש מבוגר עצים גדול מספיק כדי לאסוף את ניצנים ויורה כל החורף מבלי להתפשר על התפתחות העצים במהלך האביב הבא. בניהול הפרדס מיוחד יכול להידרש, בהתאם מערכת הדרכה; לפיכך, גיזום עשוי להיות חמור פחות מאשר למטרות ייצור פירות.<ol>
<li>בכל שבוע, מתחילת הסתיו ועד תחילת חופשת באד, לאסוף, שוקלת 10 פרוח ניצנים.</li>
		<li>לתקן את ניצני פרחים על-ידי הצבתם לתוך צינור זכוכית 10-mL עם כובע ומשרים את הדגימות בפתרון לשבועיים של חומצה אצטית/אתנול (3:1) לפחות 24 שעות-4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, למחוק את מקבע ולהוסיף 75% אתנול, בנדיבות להבטיח שזה מכסה את הדגימות. יכול להיות שמור את הדגימות בפתרון זה ב 4 ° C עד השימוש. הערה: חדירת אבק יכול לשמש כדי להסיר בועות אוויר בתוך הניצן ולמנוע מהם צף. זה מקל על החדירה של מקבע לרקמות אך עלול לגרום נזק מבנה הרקמות. תנסה להמנע מזה אם לא הכרחי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לטעום את נצרי בשטח.<ol>
<li>בכל שבוע, מתחילת הסתיו ועד תחילת חופשת באד, לקחת שלושה נצרי של 15-30 ס"מ אורך ו 5 מ מ קוטר, המכיל לפחות 10 ניצני פרחים, כל. מניחים אותם על פרחים ספוגי מים קצף בתוך תא הצמיחה ב 22 ± 1 ° C עם photoperiod אור 12 שעות.</li>
		<li>לאחר 10 ימים בבית הבליעה צמיחה, לבחור, שוקלת 10 פרוח ניצנים של נצרי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להעריך את הצמיחה ניצן, לקבוע את מצב תרדמה. תקופת הדגימה חייב להיות מותאם לתנאים של המיקום. בתנאים הפרדס (סרגוסה, ספרד, 41 ° 44'30 "N 0 ° 47'00" W ו- 220 מ' מעל פני הים), הדוגמאות של נצרי בוצע מתוך 30 נובמבר עד סוף פברואר או תחילת מרץ.<ol>
<li>מדי שבוע להעריך את התגובה של פקעי לתנאי גידול מתאימים לחדר, מתחילת הסתיו ועד budburst באביב, מהשוואת המשקל של ניצנים 10 בחרה מהשדה.</li>
		<li>אם אין הבדלים או הבדלים אלה הם פחות מ- 30%, שקול הניצנים לא מילאו אחר דרישות מצמררת שלהם והם endodormant22. אם ההבדלים הם יותר מ 30%, שקול הניצנים כבר מילאת את דרישות מצמררת שלהם והם ecodormant22.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. הצמח הכנה גשמי על כימות עמילן
<ol><li>בחר ניצנים קבוע בערך שש מן הדגימה כל תאריך (ראה שלב 1.1). תלוי הזנים, כל פרוח ניצן הדובדבן המתוקות מכיל עד חמישה פרחים primordia.<ol>
<li>להסיר את הקשקשים החיצוניים באד ומניחים את הניצן על הזכוכית של שען עם 75% אתנול כדי למנוע את זה ממנו להתייבש.</li>
		<li>לנתח את הניצן ולחלץ ראשית פרח אחד לפחות לכל ניצן עם העזרה של דיוק מלקחיים ואזמל ophthalmologic תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי. ראשית פרח יכול להיות שמור שפופרת זכוכית 10-mL עם 75% אתנול ב 4 ° C, או פנה/י מיד לשלב הבא.</li>
	</ol>
</li>
	<li>מייבשים את הדגימות בסדרה אלכוהול בוטיל שלישוני.<ol>
<li>החלף את הפתרון אתנול 75% 10 מ"ל של 75% אלכוהול בוטיל שלישוני (יפורסם בהמשך) בנדיבות לכסות את הדגימות ואת תקופת דגירה אותם של 1.5 h. פיפטה פסטר יכול להיות שימושי למחוק את הפתרון.</li>
		<li>חזור על שלב 2.2.1, הוספת תאריך יפורסם עם ריכוזים העולה (85%-95%, 100%, וי/v; ו- 3 x עם יפורסם טהור) לתוך תנור ייבוש ב 30 ° C עם אוויר החילוץ, מאז יפורסם טהור crystalizes בטמפרטורת החדר (< 20 ° C), הוא תנודתי מאוד רעילים. אם יפורסם crystalizes עם הדגימה, זה היה פוגע ברקמות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להטביע את הדגימות פרפין18.<ol>
<li>ממיסים הפרפין תציגו את הפנינים פרפין בתנור ייבוש ב 60 מעלות צלזיוס עם שאיבת אוויר ביום הקודם. הפנינים פרפין ניתן להמיס גם על גזייה, אך ודא פרפין נוזלי ב 60 מעלות צלזיוס ולא על טמפרטורה גבוהה יותר, כדי למנוע נזק לרקמות.</li>
		<li>להחליף את יפורסם עם שילוב של יפורסם ושמן פרפין (1:1), תקופת דגירה של 24 שעות בתוך תנור ייבוש ב 60 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, להחליף את התמהיל של יפורסם, שמן פראפין עם טהור ממיסים פראפין, תקופת דגירה של פחות 6 שעות בתוך תנור ייבוש ב 60 מעלות צלזיוס. לחזור על זה 2 x דגירה השינוי האחרון לפחות 4-6 יח.</li>
		<li>במקום כל דגימה על תבנית בסיס מתכת קטן מעל משטח חום, מוטבע פרפין, ועל קצב בקלטת ההטבעה. . שימו אותה על משטח קר, להסיר את החסימה לאחר השעווה פני השטח למוצק.</li>
	</ol>
</li>
	<li>סעיף, נתרענן ההכנות.<ol>
<li>הכינו דבק של האפט: להמיס 1 גר' ג'לטין נוקס רגיל ב- 100 מ של מים מזוקקים ב 30 מעלות צלזיוס; לאחר מכן, להוסיף 2 g של פנול גבישי חופשי (או56H. C) ו-15 מיליליטר גליצרול. מורחים דבק של האפט על שקופית מזכוכית עם מברשת, להוסיף טיפה של פתרון פורמלדהיד ' 1% '.</li>
		<li>סעיף פרפין כל לחסום-10 מיקרומטר ב מיקרוטום על כל ההזמנות ולמקם את הסעיפים על גבי השקופית זכוכית מכוסה דבק של האפט.</li>
		<li>מיקום בשקופיות זכוכית עם הסעיפים מעל משטח חום ב 35-40 ° C עד יבש; לאחר מכן, להעביר את השקופיות זכוכית מתלה שקופיות.</li>
		<li>הכינו את dewax ופתרונות התייבשות. במקום 200 מ של Histoclear השני שלוש מנות צביעת זכוכית, עוד אחד עם Histoclear II:ethanol (1:1, וי/v), סדרות אתנול (100%, 70%, 40%, וי/v), ואת מכונת שטיפת מים מזוקקים הסופי.</li>
		<li>Dewax הסעיפים עם שלושה שוטף, כל 5 דקות, Histoclear II, Histoclear II:ethanol (1:1, וי/v). למקם ארון התקשורת שקופיות בתוך הכלים צביעת זכוכית, המבטיח כי הפתרון מכסה לחלוטין את השקופיות,,, מעבר המתלה שקופיות של פתרון אחד לשני.</li>
		<li>נתרענן הסעיפים לפי הסדרה הבאה ממכוני 2-מין: סדרות אתנול (100%, 70%, 40%, וי/v) ו מכונת שטיפת מים מזוקקים הסופי. לבסוף, יבש בשקופיות זכוכית בטמפרטורת החדר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>כתם סעיפים18.<ol>
<li>להכין לי כתם קי2: להמיס דור 2 של אשלגן יודיד (KI) ו- 0.2 גר' יוד (אני2) ב- 100 מ של מים מזוקקים. להחיל טיפה של טרי אני2קי מעל section(s) במשך 5 דקות, ואז למחוק את העודפים של כתם ע י קליטת אותו עם נייר סופג. במהירות להמשיך לשלב הבא.</li>
		<li>החל טיפה קטנה של תקשורת הרכבה סינתטי, במקום כוסית כיסוי עליון ולאחר ללחוץ חזק. ברגע שהתקשורת הרכבה מתייבש, להתבונן במיקרוסקופ שדה בהיר עבור הערכה ראשונית של העמילן השחלה. הערה: השלב זה אינו חובה, למרות קונטרסט טוב יותר בין העמילן ואת הרקע מתקבל. אם המקטע חוזר עם כתמים אחרים לאחר עמילן כמת, הצב את מכסה הזכוכית על הירידה של כתם ולמחוק את העודפים ע י קליטת אותו עם נייר סופג (ראה 2.5.1). לאחר מכן, לאחר כימות עמילן, לשטוף החוצה את2קי כתם עם מים מזוקקים והמקום ההכנות מעל חום פני השטח ב 35-40 ° C עד יבש.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. כימות של תכולת עמילן
<ol><li>כיילו את התנאים אופטי. הערה: רמות איתור המשמשים במנתח התמונה כדי לזהות את העמילן מוכתם תלויים ישירות לתנאי תאורה ואת ההגדלה של המיקרוסקופ; לפיכך, לתקן תנאים אלה עבור כל ההכנות מוערכים. להתאים את ההתאמה הציע כאן המיקרוסקופ הזמינים ואת לתנאי תאורה.<ol>
<li>התאם את הסרעפת צמצם בקו ה-20 X ההגדלה ואת בקרת הבהירות או עוצמת אור.</li>
		<li>ודא כי ישנם אין מסננים את המחזיק מסנן ולאחר בחר תנאי שדה בהיר במיקרוסקופ. בחר הגדלה מתאימה (למשל, 40 X עבור הדובדבן המתוקות השחלה ראשית).</li>
	</ol>
</li>
	<li>בקרת תנאי רכישת התמונה. התאם את הגדרות המצלמה עם הכנה מוכתם ללא רקמה באמצעות תמונה | רכישה | נוף קדם.<ol>
<li>לתקן את הבהירות ב-50%, הרווח ב- 1.0 x ו האינדיקטורים היסטוגרמה הגאמא לערך 1.00, הניגוד-0 - 100, להתיישר עם המגבלות של ההיסטוגרמה הפצה בהירות.</li>
		<li>להפעיל את הפונקציה חשיפת יתר/מצילום ולהתאים את זמן החשיפה על גבול חשיפת יתר.</li>
		<li>להחיל את הפונקציה איזון לבן על התמונה המלאה כדי להציג את כל הרכיבים בצבע נייטרלי של התמונה ללא שום נימה צבע ותיקון הצללה על התמונה המלאה כדי ליצור תמונה מתוקנת ולא הומוגנית.</li>
	</ol>
</li>
	<li>כיילו את מערכת ניתוח התמונה כדי להשיג את ערכי בקרה של רמת האפור (0, שחור; 255, לבן) של צפיפויות אופטיים שונים (OD) שמושגות על-ידי הערכים להדמיה (T).<ol>
<li>לקבל תמונה של הכנה מוכתם בלי רקמות, נחשב שליטה לבן, וכך למדוד רמת האפור של תמונת שחור-לבן ויה מידה | אפור מידה | לכייל גריי | הפניה ערך = 0 | מדד | לכייל | טוב. זה תואם עם להדמיה 100%; לפיכך, צפיפות אופטית של 0, על-פי יתר = 2 - כניסה טי</li>
		<li>רוכשים תמונה של הכנת אותו עם מסנן 4N, אשר מפחית את כמות האור 4 x ומדד רמת האפור של תמונת שחור-לבן ויה מידה | אפור מידה | לכייל גריי | הפניה ערך = 0.6 | מדד | לכייל | טוב. זה תואם עם להדמיה 25%; לפיכך, צפיפות אופטית של 0.6, על-פי יתר = 2 - כניסה טי</li>
		<li>רוכשים תמונה של הכנת אותו בלי אור, נחשב שחור, וכך למדוד רמת האפור של תמונת שחור-לבן ויה מידה | אפור מידה | לכייל גריי | הפניה ערך = 1 | מדד | לכייל | טוב. זה תואם עם להדמיה 0%; לפיכך, צפיפות אופטית של 1, על-פי יתר = 2 - כניסה טי</li>
	</ol>
</li>
	<li>לזהות עמילן.<ol>
<li>רוכשים תמונה צבעונית של השדה כדי למדוד את הקובץ בתבנית TIFF ברזולוציה לפחות 300 נקודות לאינץ ' (dpi).</li>
		<li>ליצור תמונה בינארית המתאים לאזור צבעונית. להגדיר את גדלי סף של צבע שלוש (ערכים בין 0 - 255 עבור כל אחד) עד התמונה הבינארית משקף בדיוק את גרגרי עמילן מוכתם שנצפו, דרך תמונה | זיהוי | בחר את הסף של אדום, כחול וירוק | טוב. השוואות שוב ושוב חזותיים שונים ההכנות ואת רקמות כדי לכוונן את רמות זיהוי גמר. לאחסן ולהשתמש רמות אלה עבור כל ההכנות.</li>
		<li>לכמת את העמילן. להמיר את התמונה המקורית של צבע תמונה שחור-לבן עם מערכת ניתוח התמונה. להשתמש בתמונה בינאריים כמו מסכה-גבי על תמונת שחור-לבן ויה תמונה | בינארי ערוך. למדוד את סכום הצפיפות האופטית של כל פיקסל תחת המסכה באמצעות מידה | גריי רמת | טוב ולשקול ערך זה כתוכן עמילן בשטח נמדד.</li>
		<li>חזור על שלבים 3.4.1 - 3.4.3 בארבעה מקומות השחלה primordia כדי לקבל ערך נציג של התוכן עמילן בשחלה של פרח primordia.</li>
		<li>חזור על שלבים 3.4.1 - 3.4.3. וצעד ' ר 3.4.5 בפרחים שונים של כל תאריך איסוף</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Kurokura, T., Mimida, N., Battey, N. H., Hytönen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+seasonal+flowering+in+the+Rosaceae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">The regulation of seasonal flowering in the Rosaceae.</a> Journal of Experimental Botany. 64 (14), 4131-4141 (2013).</li>
<li>Rohde, A., Bhalerao, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+dormancy+in+the+perennial+context%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Plant dormancy in the perennial context.</a> Trends in Plant Science. 12 (5), 217-223 (2007).</li>
<li>Fadón, E., Rodrigo, J. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0098847217302794">Unveiling winter dormancy through empirical experiments.</a> Environmental and Experimental Botany. 152, 28-36 (2018).</li>
<li>Fadón, E., Rodrigo, J., Herrero, M. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s00468-018-1735-7">Is there a specific stage to rest? Morphological changes in flower primordia in relation to endodormancy in sweet cherry (Prunus avium L.).</a> Trees - Structure and Function. , In Press (2018).</li>
<li>Fadón, E., Herrero, M., Rodrigo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dormant+flower+buds+actively+accumulate+starch+over+winter+in+sweet+cherry%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Dormant flower buds actively accumulate starch over winter in sweet cherry.</a> Frontiers in Plant Science. 9 (171), (2018).</li>
<li>Loescher, W. H., Mccamant, T., Keller, J. D. <a target="_blank" href="http://hortsci.ashspublications.org/content/25/3/274.full.pdf">Carbohydrate reserves, translocation and storage in woody plant roots.</a> HortScience. 25 (3), 274-281 (1990).</li>
<li>Hedhly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Starch+turnover+and+metabolism+during+flower+and+early+embryo+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Starch turnover and metabolism during flower and early embryo development.</a> Plant Physiology. , (2016).</li>
<li>Rodrigo, J., Hormaza, J. I., Herrero, M. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1034/j.1399-3054.2000.108001035.x">Ovary starch reserves and flower development in apricot (Prunus armeniaca).</a> Physiologia Plantarum. 108 (1), 35-41 (2000).</li>
<li>Julian, C., Rodrigo, J., Herrero, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stamen+development+and+winter+dormancy+in+apricot+%28Prunus+armeniaca%29%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Stamen development and winter dormancy in apricot (Prunus armeniaca).</a> Annals of Botany. 108 (4), 617-625 (2011).</li>
<li>Alcaraz, M. L., Hormaza, J. I., Rodrigo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pistil+starch+reserves+at+anthesis+correlate+with+final+flower+fate+in+avocado+%28Persea+americana%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Pistil starch reserves at anthesis correlate with final flower fate in avocado (Persea americana).</a> PLoS One. 8 (10), e78467(2013).</li>
<li>Smith, A. M., Zeeman, S. C. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/nprot/journal/v1/n3/abs/nprot.2006.232.html">Quantification of starch in plant tissues.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1342-1345 (2006).</li>
<li>Eliceiri, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+Imaging+Software+Tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Biological Imaging Software Tools.</a> Nature Methods. 9 (7), (2013).</li>
<li>Rodrigo, J., Herrero, M. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s004970050124">Influence of intraovular reserves on ovule fate in apricot (Prunus armeniaca L.).</a> Sexual Plant Reproduction. 11, 86-93 (1998).</li>
<li>Zhou, J., Spallek, T., Faulkner, C., Robatzek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CalloseMeasurer%3A+A+novel+software+solution+to+measure+callose+deposition+and+recognise+spreading+callose+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">CalloseMeasurer: A novel software solution to measure callose deposition and recognise spreading callose patterns.</a> Plant Methods. 8 (1), (2012).</li>
<li>Faulkner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+quantitative+image+analysis+tool+for+the+identification+of+microtubule+patterns+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">An automated quantitative image analysis tool for the identification of microtubule patterns in plants.</a> Traffic. 18 (10), 683-693 (2017).</li>
<li>Kuhn, B. F. <a target="_blank" href="http://www.pubhort.org/ejhs/2006/file_338662.pdf">Determination of starch in ovules of the sour cherry cv. &#34;Stevnsbaer.&#34.</a> European Journal of Horticultural Science. 71 (3), 120-124 (2006).</li>
<li>Johansen, D. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJohansen%2C+DA+%22Plant+microtechnique%22">Plant microtechnique</a>. , McGraw-Hill. New York, NY. (1940).</li>
<li>Ruzin, S. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRuzin%2C+SE+%22Plant+microtechnique+and+microscopy%22">Plant microtechnique and microscopy</a>. , Oxford University Press. New York, NY. (1999).</li>
<li>Rodrigo, J., Rivas, E., Herrero, M. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/j.1399-3054.1997.tb03437.x">Starch determination in plant tissues using a computerized image analysis system.</a> Physiologia Plantarum. 99 (1), 105-110 (1997).</li>
<li>Alcaraz, M. L., Hormaza, J. I., Rodrigo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovary+starch+reserves+and+pistil+development+in+avocado+%28Persea+americana%29%5BTitle%5D)+AND+%22Physiologia+Plantarum%22%5BJournal%5D)">Ovary starch reserves and pistil development in avocado (Persea americana).</a> Physiologia Plantarum. 140 (4), 395-404 (2010).</li>
<li>Suarez, C., Castro, A. J., Rapoport, H. F., Rodriguez-García, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological%2C+histological+and+ultrastructural+changes+in+the+olive+pistil+during+flowering%5BTitle%5D)+AND+%22Sexual+Plant+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Morphological, histological and ultrastructural changes in the olive pistil during flowering.</a> Sexual Plant Reproduction. 25, 133-146 (2012).</li>
<li>Lang, G. A., Early, J. D., Martin, G. C., Darnell, R. L. <a target="_blank" href="https://www.scienceopen.com/document?vid=72cb57c5-ade2-4529-b2ff-f7987d4b215e">Endodormancy, paradormancy, and ecodormancy - Physiological terminology and classification for dormancy research.</a> HortScience. 22 (3), 371-377 (1987).</li>
<li>Hedhly, A., Vogler, H., Eichenberger, C., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+clearing+and+staining+of+arabidopsis+flower+organs+and+siliques%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole-mount clearing and staining of arabidopsis flower organs and siliques.</a> Journal of Visualized Experiments. 2018 (134), 1-10 (2018).</li>
<li>Kaufmann, H., Blanke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+carbohydrate+levels+and+relative+water+content+%28RWC%29+to+distinguish+dormancy+phases+in+sweet+cherry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Changes in carbohydrate levels and relative water content (RWC) to distinguish dormancy phases in sweet cherry.</a> Journal of Plant Physiology. 218 (July), 1-5 (2017).</li>
<li>Herrero, M., Dickinson, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pollen-pistil+incompatibility+in+Petunia+hybrida%3A+changes+in+the+pistil+following+compatible+and+incompatible+intraspecific+crosses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Pollen-pistil incompatibility in Petunia hybrida: changes in the pistil following compatible and incompatible intraspecific crosses.</a> Journal of Cell Science. 36, 1-18 (1979).</li>
<li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler%3A+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biology. 7 (10), R100(2006).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

תרדמה של וודי למלחמת ששת הימים מציג השלכות ברורות בייצור פירות, יערנות באקלים שינוי, למרות תהליך ביולוגי מאחורי תרדמה עדיין לא ברור. תרדמה מחקרים ניתן לצפות דרך נקודות מבט שונות, אך המחקר מחפש סמן ביולוגי החורף תרדמה החריפה בשנים האחרונות. עם זאת, רוב ניסיונות למצוא את מחוון חד-משמעית מראה מתי ניצן שבור תרדמה כבר נכשלת3. המתודולוגיה המתוארים בזאת, שילוב טכניקות פתולוגיה18 עם ניתוח התמונה, היה מאוד שימושי כדי לבדוק את היחסים בין פחמימות עתודות של רקמה מיוחדת ופעילות פיזיולוג...

צמחים רב שנתיים וודי ממוזג להסתגל העונות על ידי להתכוונן וההתפתחות שלהם. בעוד הם מפתחים במהלך האביב והקיץ, הם מפסיקים לגדול במהלך הסתיו ללכת רדום בחורף1. למרות תרדמה מאפשר להם לשרוד בטמפרטורות נמוכות בחורף, מצמרר הוא תנאי הכרחי budburst נאות אביב2. ההשלכות חשוב של תרדמה ייצור פירות ממוזג, יערנות הובילו מאמצים מגוונות כדי לקבוע ולחזות את תקופת תרדמה3. במינים עץ פרי, ניסויים אמפיריים העברת נצרי לכפות תנאים ותחזיות סטטיסטי המבוסס על נתונים של פריחה הם לגישות כדי לקבוע את התאריך של שבירת תרדמה, אשר מאפשר לחוקרים להעריך דרישות עבור כל לדבורי מצמרר. עם זאת, כיצד לקבוע את מצב תרדמה המבוססת על תהליכים ביולוגיים נשאר לא ברור3.
פורחים עצי פרי ממוזג, כגון דובדבן מתוק (שקד avium ל'), מתרחש פעם בשנה ונמשך שבועיים לערך. עם זאת, פרחים מתחיל להבדיל ולפתח כ 10 חודשים קודם לכן, במהלך הקיץ הקודם4. פרח primordia מפסיקים לגדול במהלך הסתיו להישאר רדום בתוך הניצנים בחורף. על תקופה זו, כל לדבורי צריך לצבור דרישה מצמררת במיוחד עבור פריחה נאותה4. למרות העדר phenological לשינויים הניצנים בחורף, פרח primordia פעילים מבחינה פיזיולוגית בתקופת תרדמה, ההצטברות של מצמרר טמפרטורות שויכה לאחרונה הדינמיקה של הצטברות עמילן או להקטין בתוך התאים של ראשית השחלה, מציעים גישה חדשה עבור תרדמה נחישות5. עם זאת, גודלו הקטן ואת המיקום של ראשית השחלה דורשים מתודולוגיה מיוחד.
עמילן הוא הפחמימות אחסון מרכזיים וודי צמח מינים6. לפיכך, שינויים עמילן קשורות לפעילות הפיזיולוגית של הרקמות פרח, אשר זקוקים לפחמימות לתמיכה שלהם פיתוח7,8. אירועים מרכזיים שונים במהלך תהליך הרבייה קשורים גם וריאציות בתוכן עמילן במבנים פרחים שונים, כגון מיוזה בצרכן9, הגידול של הצינורות אבקה דרך סגנון או ביצית הפריה10. טכניקות פתולוגיה לאפשר הגילוי של עמילן ברקמה מסוימת כל של primordia פרח בתקופת תרדמה. עם זאת, הקושי נשאר לכימות הזה עמילן כדי לאפשר בעקבות דפוס שלו הצטברות/ירידה לאורך זמן או השוואת העמילן תוכן בין רקמות, הזנים או שנים. זאת בשל הכמות הקטנה של רקמה זמין עבור שיטות אנליטיות11. כחלופה, ניתוח תמונות מקושר מיקרוסקופ12 מאפשר כימות של העמילן קטנה מאוד דגימות של רקמות הצמח13.
גישות שילוב מיקרוסקופ וניתוח התמונה שימשו כדי לכמת את התוכן של מרכיבים שונים ברקמות הצמח, כגון callose14, microtubes15, או עמילן16, על ידי מדידת הגודל של אזור צבוע על ידי ספציפי כתמים. עבור עמילן, זה ניתן בקלות להבחין באמצעות אשלגן יודיד-יוד (אני2קי) תגובה17. שיטה זו היא מאוד ספציפית; אני2קי intercalates בתוך המבנה למינריות של גרגרי עמילן וצורות כחול או חום-אדמדם בצבע כהה, בהתאם לתוכן עמילוז עמילן18. סעיפים מוכתמים אני2קי הכתם להציג ניגודיות הולמת בין עמילן הרקמה רקע, המאפשר זיהוי עמילן חד-משמעית של כימות עוקבות מערכת ניתוח תמונה19. למרות צבע זו אינה stoichiometric, ההצטברות של יוד הוא יחסי האורך של מולקולת עמילן, אשר יכול להשתנות מאוד17. לפיכך, גודל האזור המוכתם לבטא את מספר הפיקסלים אינן משקפות בהכרח במדויק את תכולת עמילן, מאז ההבדלים גבוהה בתוכן עמילן יכול להימצא בין שדות עם האזורים המוכתמים גודל דומה. כחלופה, תכולת עמילן יכול להיות מוערך על ידי מדידת צפיפות אופטית גרגרי מוכתם על תמונות בשחור-לבן המתקבל המיקרוסקופ, כפי שדווח ברקמות שונות משמש8,13 , 19, אבוקדו10,20וזית21.
כאן, אנו מתארים מתודולוגיה המשלבת הקביעה ניסיוני של תרדמה מצב עם כימות של עמילן בתוכן רקמת השחלה ראשית האביב, דובדבן מתוק, ומציע כלי חדש הבנה, חיזוי של תרדמה המבוסס על חקר המנגנונים הביולוגיים קשורות תרדמה.

<table><tbody><tr><td>סולם מדויק</td><td>Sartorius</td><td>CP225D</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ סטריאוסקופי</td><td>Leica Microsystems</td><td>MZ-16</td><td></td></tr><tr><td>תנור ייבוש</td><td>Memmert</td><td>U15</td><td></td></tr><tr><td>פרפין תחנת הטבעה</td><td>Leica Microsystems</td><td>EG1140H</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוטום סיבובי</td><td>Reichert-Jung</td><td>1130/Biocut</td><td></td></tr><tr><td>Microtome להב</td><td>נוצה</td><td>S35</td><td>נירוסטה</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ שדה בהיר</td><td>Leica Microsystems</td><td>DM2500</td><td></td></tr><tr><td>מצלמה דיגיטלית</td><td>Leica Microsystems</td><td>DC-300</td><td></td></tr><tr><td>מערכת ניתוח תמונה</td><td>Leica Microsystems</td><td>Quantiment Q550</td><td></td></tr></tbody></table>

שילוב של צביעת פתולוגיה וניתוח התמונה לכמת עמילן ב primordia השחלה של דובדבן מתוק במהלך החורף תרדמה

Combining Histochemical Staining and Image Analysis to Quantify Starch in the Ovary Primordia of Sweet Cherry during Winter Dormancy

שינויים עמילן במבנים קטנים הם קשורים אירועי מפתח במהלך מספר תהליכים פיתוחיים צמח, כולל השלב הרבייה של האבקה הפריה, תחילת fruiting. עם זאת, בווריאציות עמילן במהלך התמיינות פרח לא לגמרי ידועים, בעיקר בשל הקושי לכמת את תכולת עמילן המבנים קטן במיוחד של primordia הפרחים. כאן, אנו מתארים שיטה כימות של עמילן ב primordia השחלה של דובדבן מתוק (שקד avium ל') באמצעות מערכת ניתוח התמונה המצורפת המיקרוסקופ, אשר מאפשר הנוגעות לשינויים בתוכן עמילן עם השלבים השונים של תרדמה האביב. למטרה זו, המצב תרדמה של ניצני פרחים נקבעת לפי הערכת את הצמיחה ניצן של נצרי הועבר תנאים מבוקרים ברגעים שונים בזמן חורף. עבור כימות של עמילן ב primordia השחלה, ניצני פרחים ברצף שנאספו, קבוע, המוטבעות פרפין, למחלקה, מוכתם אני2Kl (אשלגן יודיד-יוד). ההכנות שנצפו תחת המיקרוסקופ, נותחו על ידי מנתח התמונה בבירור שיבדיל עמילן מהרקע. ערכי תוכן עמילן מתקבלים על ידי מדידת צפיפות אופטית של התמונה התואם העמילן מוכתם, בהתחשב סכום הצפיפות האופטית של כל פיקסל כמו אומדן של עמילן תוכן של מסגרת למד.

תרדמה מחקרים דורשות קביעת רגע מתי התקיימו הדרישות מצמררת. למרות העדר phenological שינויים במהלך החורף בתנאים שדה (איור 1 א'), עצי הדובדבן משחזר את הקיבולת של גדילה בתנאים מתאימים עד שהם עוברים תקופה מסוימת תחת בטמפרטורות נמוכות. ההעברה הרגילה של נצרי לתא תנאים מבוקרים (איור 1B) בתקופת החורף מותר הערכת מצב תרדמה פקעי. ההערכה של הגידול וניצן נעשה על ידי מדידת עליית ניצן משקל. בזמן, בתקופת תרדמה, אין שינויים יכול להיות שנצפו לאחר 10...

אנו מציגים מתודולוגיה לכמת את תכולת עמילן primordia שחלה בדובדבן מתוק (שקד avium ל') במהלך החורף תרדמה באמצעות מערכת ניתוח תמונה בשילוב עם טכניקות מעבדה הומנית.

שילוב של צביעת פתולוגיה וניתוח התמונה לכמת עמילן ב Primordia השחלה של דובדבן מתוק במהלך החורף תרדמה

Changes in starch in small structures are associated with key events during several plant developmental processes, including the reproductive phase from ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח על רדומים בצמח עצי, כגון מדוע ניצני הפרחים צריכים לצבור קר במהלך החורף לפרוח כראוי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לכמת את עמילן בדגימות קטנות מאוד של פריפורדיום פרחים. גישה זו שימושית מאוד כדי לזהות את הפעילות הפיזיולוגית של פריפורדיום הפרח במהלך המעונות והוא יכול להיות מיושם גם על מיני עצים אחרים כמו משמש או שזיף.למרות שיטה זו יכולה לספק תובנה לתוך ניצן פרח רדום, זה יכול להיות מיושם גם על תהליכים אחרים כגון שלב הרבייה מהאבקה להתפרצות של פירות. כדי להתחיל, לאסוף חמש יריות מהשדה. ואז לשקול ולתקן 10 ניצני פרחים בצינור זכוכית 10 מיליליטר עם פתרון קיבוע לפחות 24 שעות בארבע מעלות צלזיוס.לאחר מכן, להשליך את התיקון ולהוסיף מספיק 75%אתנול כדי לכסות את הדגימות. להשיג שלושה יורה כי הם 15 עד 30 ס"מ אורך וחמישה מילימטרים קוטר עם 10 ניצני פרחים כל אחד. ואז למקם את היורה על קצף של חנות פרחים ספוגה במים בתא צמיחה.לאחר 10 ימים בתא הצמיחה, להסיר את ניצני הפרח מן היריות ולשקול אותם. כל שבוע מתחילת הסתיו עד budburst באביב, להעריך את הצמיחה של ניצני הפרחים. הסר את קשקשי הניצנים החיצוניים מכל דגימה, ולאחר מכן מקם כל ניצן בזכוכית של השען המכילה 75%אתנול.השתמש מטלפים מדויקים אזמל עיניים כדי לנתח את הניצנים ולקבל לפחות פרימורדיום פרח אחד מכל ניצן. להטמיע את הדגימות בנפרד שעווה פרפין כדי ליצור בלוק ולקטע אותם על microtome סיבובי. לאחר חתך את הדגימות, להחיל טיפה של יוד טרי של Lugol על קטע.לאחר חמש דקות, להסיר כתם עודף עם נייר סופג. לאחר מכן להחיל טיפה קטנה של מדיה הרכבה סינתטית, למקם כיסוי קטן על המדגם, ולחץ חזק. לאחר שאמצעי התקשורת ההרכבה יבשים, שימו לב לקטע המוכתם תחת מיקרוסקופ שדה בהיר.תחילה התאימו את הסרעפת של הצמצם ואת בקרת הבהירות בהתאם לפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן ודא שאין מסננים במחזיק המסנן ובחר מצב שדה בהיר במיקרוסקופ. לאחר מכן, להתאים את הגדרות המצלמה להכנה מוכתמת ללא רקמה.תקן את הבהירות ב- 50%Next הפעל את פונקציית חשיפת יתר/חשיפת חסר והתאם את זמן החשיפה במגבלת חשיפת יתר. החל את פונקציית האיזון הלבן ואת תיקון ההצללה. למדוד את הרמה האפורה של התמונה בשחור-לבן וכתוצאה מכך של ההכנה מוכתמת ללא רקמה.לאחר מכן להחיל מסנן 4N, לרכוש תמונה נוספת בשחור-לבן של ההכנה ולמדוד את רמת האפור. לאחר מכן להשיג תמונה של אותה הכנה ללא אור ולמדוד את הרמה האפורה של התמונה וכתוצאה מכך לכייל. לאחר מכן, לרכוש תמונת צבע של מקטע לדוגמה בפורמט TIFF עם רזולוציה של לפחות 300 dpi.צרו תמונה בינארית המתאימה לאזור המוכתם, ולאחר מכן קבעו את שלושת ספי הצבע עד שהתמונה הבינארית משקפת במדויק את גרגירי עמילן מוכתמים. חזור על תהליך זה עם הכנות ורקמות אחרות כדי לכוונן את רמות הגילוי הסופי. באמצעות מערכת ניתוח התמונה, למדוד את סכום הצפיפות האופטית של כל פיקסל מתחת למסכה כדי לכמת את תוכן עמילן בשדה.בפרוטוקול זה, צמיחת ניצן הפרחים ומעמד המעונות הוערכו על ידי מדידת העלייה במשקל ניצן לאחר 10 ימים בתנאים מתאימים. במהלך המעונות, לא נצפו שינויים לאחר 10 ימים בתנאים מתאימים. ברגע שהתגברו על המעונות, הניצנים התנפחו והתפוצצו בתא הצמיחה.תוכן עמילן בפרימדוריום השחלה כומת באמצעות ניתוח תמונה בכל קטע microtomed. באופן עקבי, כמות עמילן בתחילת החורף הציג ערך צפיפות אופטית פחות מ 40, 000 ואת הסכום המרבי הגיע ערך בין 120, 000 ו 140, 000 במהלך שתי שנות המחקר. אם לוקחים בחשבון את המעונות, הכמות המקסימלית של עמילן התרחשה במקביל למימוש המצמרר בשתי השנים.חשוב לזכור שרמות הזיהוי המשמשות את מנתח התמונות תלויות ישירות בכיול המערכת. זה כולל מצב אור, עוצמת כתם והגדלת המיקרוסקופ. יש לתקן תנאי זה עבור כל ההכנות.השילוב של טכניקות היסטוכימיות עם ניתוח תמונה הביא מאוד שימושי לבחון את עתודה פחמימות של פריפורדיום הפרחים בשלבים שונים של רדום. זה יכול להיות מיושם גם על מינים ורקמות אחרים. הקשר בין שחרור רדום הצטברות עמילן בפרימורדיה השחלה חשפה על ידי השימוש בשיטה זו לספק בסיס קול כדי להבין את הבסיס הביולוגי של דרישות רדומים מצמרר.מאמץ עתידי צריך להיות ממוקד בחקר אינדיקטורים ביולוגיים אמינים שיכולים בקלות להצביע על מצב המעונות של העץ. בינתיים, הדפוס של וריאציות עמילן לאורך רדום יכול לשמש כדי למסגר מחקרים פיזיולוגיים וגנטיים נוספים.

combining-histochemical-staining-image-analysis-to-quantify-starch

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

הרכב דופן התא של הצמח משתנה בין סוגי הרקמות ויכול לכלול ליגנין, תאית, המיצלולוז ופקטין. טכניקות צביעה שונות פותחו כדי להמחיש הבדלים ברמת סוג התא. מאמר זה הוא אוסף של טכניקות צביעת דופן תאים נפוצות.

הכתמה histochemical של<em&gt; Thaliana ארבידופסיס</em&gt; תא המשני בוול אלמנטים

אנו מספקים כאן פרוטוקול יעיל ואמין עבור immunostaining, הקרינה הכלאה באתר, מכתים DNA ואחרי הדמיה בביציות thaliana ארבידופסיס כל הר כמותיים, ברזולוציה גבוהה. שיטה זו השתמשה בהצלחה כדי לנתח שינויי הכרומטין ואדריכלות גרעינית.

שיטה יעילה לניתוח כמותי, תא בודד של הכרומטין שינוי ואדריכלות גרעינית בהר שלם-ביציות ב<em&gt; ארבידופסיס</em

מוצג פרוטוקול של צביעה חיסונית שלמה על עוברי כנימות, בו מטופלים תנאים קריטיים להפחתת צביעת רקע והגברת חדירות הרקמות. תנאים אלה פותחו במיוחד לזיהוי יעיל של ביטוי חלבונים ברקמות העובריות של כנימות.

זיהוי של תנאים קריטיים לImmunostaining באפונה בכנימות עוברים: הגדלת רקמות חדירות והפחתת מכתים רקע

אנו מספקים פרוטוקול הדמיה רמת החומציות תאיים של שושלת היוחסין תאי אפיתל ברקמת השחלה דרוזופילה בשידור חי. אנו מתארים שיטות כדי ליצור זבובים הטרנסגניים לבטא ביוסנסור pH, mCherry::pHluorin, התמונה החיישן באמצעות הדמיה פלורסצנטיות כמותית, ליצור עקומות רגיל ו להמיר ערכי העוצמה פלורסצנטיות ערכי pH.

שיטות הדמיה תאיים pH של השושלת תאי זקיק ברקמת השחלה דרוזופילה בשידור חי

ב פרוטוקול זה, אנחנו מתארים טכניקות ניתוח ראוי תודרנית פרחים, siliques, כמה טכניקות ניקוי בסיסי, ונבחר מכתים נהלי כולה-הר תצפיות מבני הרבייה.

כולה-הר ניקוי, כתמים של תודרנית פרח איברים, Siliques

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לכמת זקיקי השחלה בתרבית של עכברים צעירים ללא חלוקתה טורי. שימוש immunofluorescence כל איבר ורקמה ניקוי, חלוקתה הפיזי מוחלף עם חלוקתה אופטי. שיטה זו של הכנת הדוגמא והדמיה שומר על תקינות האיברים ואסטמה ומקילה על כימות אוטומטיות של תאים ספציפיים.

Immunofluorescence הר שלמה, זקיק כימות של השחלות תרבותי. העכבר

טכניקה זו מאפשרת הכנה מהירה ופשוטה של סעיף שרין בגודל זרע כולו לתצפית וניתוח של תאים, גרגרי ענבן, וגופים חלבון באזורים שונים של הזרע.

שיטת מקטע יבש פשוטה לקבלת מקטע שרב בגודל זרע שלם ויישומיו

פרוטופלסטים מבודדים של תאי עיסת תפוחים היו טעונים עם ריאגנט פלואורסצנטי סידן כדי לזהות ריכוז ציטופלסמי Ca2 + .

מכתים את הציטופלסמי Ca2+ עם פלואו-4/AM בעיסת תפוחים

כאן אנו מציגים פרוטוקול מותאם להדמיית שחלות שלמות לניתוחים כמותיים ואיכותיים באמצעות שמירה חיסונית בהרכבה מלאה, מיקרוסקופיית מולטי-פוטון והדמיה וניתוח תלת-ממדיים. פרוטוקול זה מתאים לעיבוד בעל תפוקה גבוהה, אמין וניתן לחזרה, החל על טוקסיקולוגיה, אבחון קליני ובדיקות גנומיות של תפקוד השחלות.

אימונופלואורסצנציה של השחלה כולה, ניקוי ומיקרוסקופיה מרובת פוטון לניתוח תלת-ממדי כמותי של עתודת השחלות המתפתחות בעכבר

פרוטוקול זה נועד לספק נהלים מפורטים לאיסוף, תיקון ותחזוקה של דגימות צמחים מיקוהטרוטרופיים, תוך יישום טכניקות מיקרוסקופיה שונות כגון מיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת והולכה, מיקרוסקופיית אור, קונפוקלית ופלואורסצנטית כדי לחקור התיישבות פטרייתית ברקמות צמחים ובזרעים שנבטו בפטריות מיקוריזאליות.

טכניקות מיקרוסקופיה לפענוח התיישבות פטרייתית ברקמות צמחים מיקוהטרוטרופיים ונביטה סימביוטית של זרעים

מאמר זה מתאר שתי שיטות פנוטיפ ללא שימוש בקליפות אפידרמיס כדי לאפיין את הגנים השולטים בהתפתחות הסטומטלית. השיטה הראשונה מדגימה כיצד לנתח פנוטיפ סטומטלי באמצעות אפידרמיס צמחי מוכתם O כחול טולוידין. השיטה השנייה מתארת כיצד לזהות ליגנדות סטומטיות ולנטר את פעילותן הביולוגית.

זיהוי הגנים המעורבים בהתפתחות סטומאטלית באמצעות ניקוד פנוטיפ אפידרמלי

למד כיצד לכמת עמילן בפרימורדיה של שחלת דובדבן מתוק במהלך תרדמת החורף באמצעות צביעה פתולוגית וניתוח תמונה. שיטה זו מאפשרת לחקור פעילות פיזיולוגית בדגימות קטנות ולהבין את הבסיס הביולוגי של תרדמה ודרישות הקירור.

שילוב של צביעת פתולוגיה וניתוח התמונה לכמת עמילן ב Primordia השחלה של דובדבן מתוק במהלך החורף תרדמה

גלה סרטונים נוספים