Name: הדמית מבוססת תמונה אוטומטית של מלכודות נויטרופילים באמצעות NETQUANT (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: למד כיצד לכמת מלכודות נויטרופילים (NETs) בתמונות פלואורסצנציה באמצעות תוכנת NETQUANT האוטומטית. השיטה מאפשרת ניתוח עקבי וללא הטיה של נתונים בודדים ורב-תמוניים במחקרים אימונולוגיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

העבודה ממומנת על ידי קרן Crafoord (TM ו-PN), מענק שוודי מחקר המענק (PN, TM), המועצה למחקר שוודי (PN) ו Groschinsky קרן (TM, PN).

ועדת האתיקה של אוניברסיטת לונד אישרה את אוסף דם הורידים ממתנדבים בריאים בהתאם להכרזת הלסינקי (2013/728). כל המתנדבים סיפקו את הסכמת הידע שלהם בכתב.
1. בידוד דם היקפיים נויטרופילים באמצעות צפיפות-הדרגתי צנטריפוגה
<ol><li>לאסוף דם הורידים האנושיים בצינורות המכילים הפארין ולאפשר לצינורות להגיע לטמפרטורת החדר. הערה: לפחות 16 מ ל של דם מתורם בריא נדרש להניב כדורית גדולה מספיק.</li>
	<li>מערבבים את הדם בנפח אחד של 2% תוספי ב מלוחים (0.9% הנאל) ולאפשר משקע בטמפרטורת החדר עבור 30 דקות ב שפופרת סטרילי מ50 mL של צנטריפוגה.</li>
	<li>מנושף את supernatant לתוך שפופרת סטרילי 50 mL וצנטריפוגה ב 200 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c.</li>
	<li>משלב זה ואילך נמשיך בבידוד ב -4 ° צ' או בקרח.</li>
	<li>להשעות את הגלולה ב 5 מ ל של קרח קר מלוחים ושכבה על גבי 5 מ ל של בידוד לוקיציט מעבר הצבע (9.1% נתרן diatrizoate עם 5.7% dextran, w/v) בשפופרת סטרילי 15 mL סטרילית.</li>
	<li>צנטריפוגה עבור 30 דקות ב 400 x g ב 4 ° c.</li>
	<li>. ולהשליך את הסופרנטאנט</li>
	<li>Lyse כדוריות הדם האדומות על ידי השעיית הגלולה ב 3 מ ל של מים קרים קרח עבור 30 s. מייד להוסיף 1 מ ל 3.6% הנאגל ולאחר מכן למלא עם 10 מ ל של תמיסת מלח קר הקרח.</li>
	<li>צנטריפוגה את ההשעיה התא עבור 10 דקות ב 350 x g.</li>
	<li>להסיר את הסופרנטאנט, לאסוף את הגלולה התא ולהשעות אותו מחדש 1 מ ל של תמיסת מלח. הגדר הצידה 10 μL בצינור מיקרוצנטריפוגה להערכת מספר התאים והכדאיות באמצעות טריטופה כחול בחדר בורקר.</li>
	<li>הוסף 10 μL של השעיית התא ל 90 μL של 0.4% הפתרון הכחול. קח 10 μL של השעיית התא בחדר בורקר. לספור את התאים 4 ריבועים המאוגדים על ידי 3 שורות בכל פינה של החדר. תאים המופיעים כחול כהה לקליטת הצבע הם לא קיימא, להוציא אותם ממספר התא הכולל.</li>
	<li>בטא את מספר הטלפון כתאים/mL כפי שהוגדר על-ידי המשוואה שלהלן. <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58528/58528eq1.jpg"> הערה: להלן מקדם החדר היה 10,000, מקדם דילול היה 10 ומספר הריבועים הכולל היה 4.</li>
	<li>דלל את השעיית התאים הנותרים ל-10 מ ל לשלב הכביסה הסופי.</li>
	<li>צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 200 x g.</li>
	<li>להשעות את נויטרופילים ב-RPMI-1640 עם 2 mg/mL חום-inactivated פעלה האדם סרום אלבומין (HSA) בריכוז של 5 x 105 תאים/mL.</li>
</ol>2. הכנת כיסוי וגירוי של נויטרופילים
<ol><li>מקום אחד coverslip (10 מ"מ, #1) בכל באר של 12-היטב צלחת מעיל שמיכות על ידי הוספת 200 μL של 0.01% פולי-L-ליזין פתרון ולהשאיר אותו ב 37 ° c בלילה.</li>
	<li>שטוף כיסוי עם 300 μL פוספט מאגר תמיסת מלח (PBS) פעם ולהשאיר יבש.</li>
	<li>הוסף 400 μL של 5 x 105 נויטרופילים/mL לכל טוב ומארג בטמפרטורת החדר עבור 15 דקות.</li>
	<li>להעביר את הצלחת המכילה נויטרופילים לאינקובטור ב 37 ° צ' עם 5% CO2 עבור 15 דקות.</li>
	<li>. הסר את הסופרנטאנט הוסף 400 μL של prewarmed RPMI-1640 בינוני עם 2 מ"ג/mL HSA לפקדים. הוסף 300 μL טרום מחומם RPMI עם 20 ננומטר בפורובול 12-myristate 13-אצטט (PMA) עבור גירוי.</li>
	<li>לעורר נויטרופילים עבור 150 דקות ב 37 ° צ' עם 5% CO2.</li>
</ol>3. ויזואליזציה של רשתות
<ol><li>הסר את supernatant ולשטוף את הדגימות 2x עם 200 μL של PBS.</li>
	<li>תקן דגימות על-ידי הוספת 200 μL של 4% פאראפורמלדהיד (בתחתית) ב-PBS במשך 20 דקות ב 37 ° c. שימו לב: הכדורגלן רעיל ויש לטפל בו בזהירות.</li>
	<li>שטוף דגימות 3x עם 200 μL של PBS.</li>
	<li>החדירות הדגימות על ידי הוספת 50 μL של 0.5% טריטון X-100 עבור 30 s.</li>
	<li>שטוף את דגימות 3x עם 200 μL של PBS.</li>
	<li>חסום את הדגימות באמצעות סרום עז בגובה 5% ב-PBS בשעה 37 ° c.</li>
	<li>הוסף 300 μL של הארנב הראשי אנטי האדם נויטרופילים elastase בפתרון חסימת בדילול של 1:500 עבור 90 דקות ב 37 ° c.</li>
	<li>שטוף את דגימות 3x עם 300 μL של PBS.</li>
	<li>הוסף 300 μL של עז משנית אנטי ארנבת נוגדן פלורסנט בדילול של 1:1000 עבור 90 דקות ב 37 ° c.</li>
	<li>לשטוף את שמיכות 3x עם 300 μL של PBS.</li>
	<li>הסר את שמיכות מן הבארות ולטעון את coverslips עם 10 μL הרכבה בינונית המכילה DAPI. אחסן לילה בטמפרטורת החדר בחשכה כדי לייבש את הדגימות. הערה: הצביעת של ה-DNA עם DAPI הוא בהחלט צעד קריטי בשיטה. המשתמשים יכולים גם לפתור בעיות על ידי הוספת פתרון DAPI האקסוסוגני בטווח ריכוז סופי של 0.1 \ u 20120.5 μg/mL עבור 2 \ u20123 min, ואחריו 3 שטיפת שלבים עם 300 μL PBS.</li>
	<li>לרכוש תמונות עם מיקרוסקופ לשדה רחב מאוד באמצעות המטרה 20X.</li>
</ol>4. ניתוח וקוונפיקציה של רשתות באמצעות NETQUANT
הערה: ניתן להוריד את NETQUANT על ידי לחיצה על קובץ ההתקנה שנמצא על הארכיון של Zenodo Github או באתר המעבדה נורדנחש (<a href="https://nordlab.med.lu.se/?page_id=34" target="_blank">https://nordlab.med.lu.se/?page_id=34</a>).
<ol><li>ייבוא ערכות נתונים לניתוח, שמות ערוצים והמרת תמונות
	<ol>
<li>פתח את לשונית ההתקנה ב-NETQUANT.</li>
		<li>בחרו בתיקיית המקור לניתוח בלחיצה על האפשרות ' קבל נתיב ' בתפריט המקור ובחרו בתיקייה המכילה את רצפי התמונות לניתוח.</li>
		<li>לחצו על האפשרות ' קבל נתיב ' בתפריט היעד ובחרו בתיקייה לשמירת הנתונים שאחרי ניתוח התמונה.</li>
		<li>שם הערוצים כך "ערוץ ה-DNA" מתאים עם כתמים DNA (g, DNA או dapi) ו-"NET-channel" מתארת את מכתים החלבון המאוגד (למשל, net, נויטרופילים elastase) בתמונות. עבור התפקוד החלק של התוכנה, (מומלץ) שם התיקיה המכילה את קבצי תמונת הבקרה "שליטה". הערה: ערוץ NET מתייחס לסמן החלבון המאוגד לרשת בלבד.</li>
		<li>האכילו את המטא-נתונים של התמונה בתוכנה על-ידי לחיצה על לחצן ' טען נתוני תמונה ' בתפריט המשנה של מידע התמונה .</li>
		<li>בחר את סדר הערוץ הנכון הכלול בתמונות בתפריט המשנה של הזמנת הערוץ . אפשרות זו נכללה במצב של כשל כדי למנוע אי התאמות בשוגג.</li>
		<li>לרכוש מאפייני תמונה ראשית מהנתונים הגולמיים ולהמיר את התמונות על-ידי לחיצה על לחצן הכן נתונים. התמונות שהומרו מופיעות בתפריט המשנה סוג לדוגמה . לחץ על תפריט סוג לדוגמה להצגה ובחירה של כל ערכות הנתונים הנרכשים לניתוח.</li>
		<li>בחרו תמונה מתפריט המשנה ' סוג דגימה ' ולחצו על הלחצן ' הצג נתוני תמונה ' כדי להציג את התמונות שפוצלו לתוך הערוץ ה-DNA ו-NET בהתאמה.</li>
	</ol></li>
	<li>פילוח של תאים בערוץ ה-DNA ובערוץ NET
	<ol>
<li>בחר את שיטת הפילוח על-ידי לחיצה על תפריט המשנה של השיטה הן בערוץ ה-DNA והן בערוץ NET. הערה: שיטת ברירת המחדל של פילוח מוגדרת כאדפטיבית והיא ההגדרה המומלצת. אפשרויות אחרות זמינות גם כולל כללי, קצה ו-Chan-Vese. אפשרות לפרשת-החוצה כלולה גם כדי להבדיל בין תאים או רשתות ממוקמות באופן הדוק.</li>
		<li>הזן את הכרטיסייה פילוח כדי להתאים את תאי הבקרה תחילה בשני הערוצים על-ידי לחיצה על האפשרות דגימות פקד קטע .</li>
		<li>בחרו PMA מתפריט המשנה לדוגמה ולחצו על אפשרות האצווה (מומלץ) להתחלת פילוח של כל התמונות הכלולות בערכת הנתונים. בחר את התמונות בתפריט סוג לדוגמה ולחץ על כפתור נתוני התמונה כדי להמחיש ולאמת את מסיכות התמונה הבינאריות (מסיכת DNA ו-NET mask) שנוצרו לאחר פילוח.</li>
	</ol></li>
	<li>ניתוח תא בודד של מאפיינים הניתנים לזיהוי
	<ol>
<li>היכנס ללשונית הניתוח ונתח את דגימות הבקרה על-ידי לחיצה על לחצן קביעת הסף .</li>
		<li>שנה את סוג המדגם ל-PMA ולחץ על הלחצן ' קבל מאפייני תא ' כדי להשלים את הניתוח של דגימות מוסטימולציה.</li>
		<li>בחרו תמונה מתפריט המשנה ' סוג דגימה ' ולחצו על הלחצן ' הצג נתוני תמונה ' כדי להציג את כיסוי השכבה ואת מספר התאים והתאים היוצרים את NET בתמונה.</li>
	</ol></li>
	<li>השוואה בין מאפייני תא לזיהוי תאים היוצרים את הרשת
	<ol>
<li>בחרו דגימה מתפריט המשנה ' סוג דגימה ' ולחצו על הלחצן ' נתח רשתות ' כדי להשלים את הניתוח. תמונות בודדות ניתן לבחור מסוג לדוגמה תת תפריט לניתוח או את כל האצווה של תמונות ניתן לנתח על ידי בחירת אפשרות אצווה (מומלץ).</li>
		<li>התאם את קריטריוני NET באופן ידני כדי להניב תוצאות אופטימליות עבור דוגמה נתונה. השוו רשתות מזוהות עם התמונות המקוריות כדי להעריך את איכות הזיהוי. הערה: לאחר מכן ניתן להשתמש בקריטריוני NET בכל התמונות בערכת הנתונים. שינויים בקריטריוני האינטרנט יוחלו בו בכל דגימות הבקרה. פעולה זו מגבילה את האפשרות של כל הבדלים פוטנציאליים שעלולים לנבוע עקב התאמה מרבית של פרמטרי NET. ההגדרות בקריטריוני NET יכולות להיות מותאמות בהתאם לדרישות המשתמש. היחסים בין שיעורי גילוי שווא ו-NETQUANT כבר נחקרו בעבר13. טווחים טיפוסיים לגידול באזור הם 2 \ u20124, מעגליות להיות 0.7 \ u 20120.9 ו-DNA/היחס נטו להיות 0.6 – 2.0.</li>
		<li>בדוק את סיכום הנתונים בתפריט המשנה של נתוני התא שבו מוצגים מספר התמונות, ספירת תאים לכל תמונה ואחוז של רשתות לכל תמונה. הערה: האחוז הכולל של הרשתות בערכת הנתונים כולה מוצג על-ידי "מד הרשת". ספירת התמונות הכוללת, ספירת התאים, אחוז הרשתות במדגם (רשתות%) והרשתות% במדגם הפקדים מוצגות בטבלת סטטיסטיקת התקציר מתחת למד הרשת. אנו ממליצים שנתוני הבקרה ידווחו לצד הנתונים שהתקבלו מדגימות מוסטימולציה.</li>
	</ol></li>
	<li>תפוקות תוצאות
	<ol>
<li>הזן את כרטיסיית הפלט כדי לבחור ולהציג פלטי תוצאות.</li>
		<li>לחקור ולהשוות את פלטי נתונים שונים שנוצרו ניתוח של השליטה PMA על ידי בחירת הטופס של הפלט ולחיצה על לחצן תוצאות פלט . הערה: כל הנתונים שהופקו לאחר ניתוח עבור הפקדים והאיסופים נשמרים בתיקיית הניתוח כפי שנבחרה בתפריט המשנה של היעד. נתונים נשמרים בתבניות. csv או. pdf.</li>
		<li>הפעל את קובץ השיטה כדי לקבל את הגירסה של התוכנה והקריטריונים הנטו המשמשים לניתוח (להיכלל בסעיף שיטות למטרות פרסום).</li>
		<li>לחץ על טבלת נתוני התוצאות כדי להמחיש את נקודות הנתונים הבודדות במדגם נתון.</li>
		<li>דמיינו את התפלגות השטח נטו ו-DNA: יחס נטו בדגימות. הקו האדום מציין את ערך הסף בגרפים.</li>
		<li>קבע את אזור NET לעומת צורת ה-DNA על ידי לחיצה על קובץ ההפצה Bivariate .</li>
	</ol></li>
	<li>טעינת הניתוח הקודם והאצווה כל השלבים
	<ol>
<li>טען הגדרות ניתוח שהצליחו בעבר ב-NETQUANT באמצעות לחצן ' טען ניתוח קודם '.</li>
		<li>השתמש בלחצן האצווה כל השלבים הכלולים בתפריט ההתקנה כדי להפעיל את שלבים 5 \ u201212 (איור 1, איור 2, איור 3, איור 4, איור 5) ישירות לקבלת הפלט הסופי.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Nauseef, W. M., Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+at+work%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophils at work.</a> Nature Immunology. 15 (7), 602-611 (2014).</li>
<li>Borregaard, N., Cowland, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granules+of+the+human+neutrophilic+polymorphonuclear+leukocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte.</a> Blood. 89 (10), 3503-3521 (1997).</li>
<li>Nordenfelt, P., Tapper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagosome+dynamics+during+phagocytosis+by+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Phagosome dynamics during phagocytosis by neutrophils.</a> Journal of Leukocyte Biology. 90 (2), 271-284 (2011).</li>
<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li>
<li>Sorensen, O. E., Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+-+the+dark+side+of+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps - the dark side of neutrophils.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1612-1620 (2016).</li>
<li>Yipp, B. G., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NETosis%3A+how+vital+is+it%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">NETosis: how vital is it?</a> Blood. 122 (16), 2784-2794 (2013).</li>
<li>Jorch, S. K., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+emerging+role+for+neutrophil+extracellular+traps+in+noninfectious+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease.</a> Nature Medicine. 23 (3), 279-287 (2017).</li>
<li>Fuchs, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+cell+death+program+leads+to+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps.</a> J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).</li>
<li>Mohanty, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+mechanism+for+NETosis+provides+antimicrobial+defense+at+the+oral+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A novel mechanism for NETosis provides antimicrobial defense at the oral mucosa.</a> Blood. 126 (18), 2128-2137 (2015).</li>
<li>Hakkim, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+Raf-MEK-ERK+pathway+is+required+for+neutrophil+extracellular+trap+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Activation of the Raf-MEK-ERK pathway is required for neutrophil extracellular trap formation.</a> Nature Chemical Biology. 7 (2), 75-77 (2011).</li>
<li>Brinkmann, V., Goosmann, C., Kuhn, L. I., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+quantification+of+in+vitro+NET+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Automatic quantification of in vitro NET formation.</a> Frontiers in Immunology. 3, 413(2012).</li>
<li>Coelho, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+determination+of+NET+%28neutrophil+extracellular+traps%29+coverage+in+fluorescent+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Automatic determination of NET (neutrophil extracellular traps) coverage in fluorescent microscopy images.</a> Bioinformatics. 31 (14), 2364-2370 (2015).</li>
<li>Mohanty, T., Sorensen, O. E., Nordenfelt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NETQUANT%3A+Automated+Quantification+of+Neutrophil+Extracellular+Traps%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">NETQUANT: Automated Quantification of Neutrophil Extracellular Traps.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1999(2017).</li>
<li>Kaplan, M. J., Radic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps%3A+double-edged+swords+of+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps: double-edged swords of innate immunity.</a> Journal of Immunology. 189 (6), 2689-2695 (2012).</li>
<li>Cedervall, J., Olsson, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunity+Gone+Astray+-+NETs+in+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cancer%22%5BJournal%5D)">Immunity Gone Astray - NETs in Cancer.</a> Trends in Cancer. 2 (11), 633-634 (2016).</li>
<li>Ginley, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+detection+and+quantification+of+human+and+mouse+neutrophil+extracellular+traps+in+flow+cytometry+and+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Computational detection and quantification of human and mouse neutrophil extracellular traps in flow cytometry and confocal microscopy.</a> Scientific Reports. 7 (1), 17755(2017).</li>
</ol>

TM ו-PN יש פטנט בהמתנה הקשורים לאלגוריתמים המשמשים NETQUANT.

היווצרות נטו הוא התוספת העדכנית יחסית של נויטרופילים מגוונת הארמנטריום4 והיה גל מורגש של עניין ללמוד את המשמעות של רשתות במגוון רחב של תחומי מחקר5,7,14,15. הקניית תמונות בעזרת מיקרוסקופ Immunofluorescence והשימוש העוקב אחר תמונה הוא שיטה נפוצה לכמת רשתות. גישה זו יש את היתרון של היכולת לזהות תאים היוצרים רשתות ברמה תא אחד ולכן יכול להפחית את אות הרקע. שיטות ידניות לכימות...

נויטרופילים הם מתווכים חיוניים של תגובות ההגנה המולדת מארח נגד מגוון רחב של פתוגנים מיקרוביאלית1. הם מבצע פונקציות מיקרוביאלית שלהם על ידי שחרור גרגירים שלהם המכיל מגוון רחב של חלבונים מיקרוביאלית2, לייצר מינים חמצן תגובתי (ROS) ו רדמה1, ודרך phagocyציטוזה3. בנוסף, בריקמן ואח '. 4 תיאור נויטרופילים מסחטות מלכודות (רשתות) כמו מנגנון הרומן שבו המלכודת נויטרופילים לחסל פתוגנים הפולשים. מאז התגלית שלהם לפני קצת יותר מעשור, הרשתותהיו מעורבים במגוון רחב של זיהומיות5,6 ולא זיהומיות7 morbidities. היווצרות נטו הוא תהליך פעיל ותוצאות שחול של דנ א כרומטין מצופה עם granule-נגזר מיקרוביאלית חלבונים8. חלק מהשינויים המרכזיים במבנה הסלולר והגרעין הקשורים למערך הרשת כוללים את אובדן המבנה הגרעיני, הגיוס של חלבונים מציטופלסמה לגרעין וגידול בקוטר הגרעיני והסלולר8,9.
רשתות כמו האינטרנט, אשר עשויים להופיע כמבנים לפזר מעט יותר גדול מתא או כמו מבנים מספר פעמים גדול יותר מאשר נויטרופילים בודד נחשבים אינדיקטורים שלnetosis 5,10. באמצעות מיקרוסקופ ניאון, רשתות ניתן לזהות על ידי בודק דנ א עם בדיקה פלורסנט כגון 4 ', 6-diamidino-2-פניינילידול (DAPI) ועל ידי immunofluorescence כתמים נגד חלבונים נטו מאוגד כגון נויטרופילים elastase. הכמת של אזורים חופפים של כתמים עבור החלבונים ו-DNA נטו מאוגד קובע את השטח הכולל תחת רשתות בתמונה11.
מספר אפשרויות ניתוח תמונה זמינות כדי לבצע כימות קרינה פלואורסצנטית המבוססת על רשתות11,12. אך אפשרויות תוכנה אלה מציגות מגבלות שאינן ידידותיות למשתמש ו/או אוטומטיות לחלוטין. במאמר זה, אנו מדגימים את הפעולה של NETQUANT13, יישום זמין באופן חופשי שיכול לבצע משוחדת לחלוטין אוטומטית immunofluorescence מיקרוסקופ תמונה מבוססת נטו המבוסס. האפליקציה יש ממשק גרפי ידידותי למשתמש (GUI) והוא יכול לבצע ניתוח תא בודד. התוכנה לכמת את NETosis בתמונה על ידי זיהוי שינויים מורפולוגיים באזור של DNA-NET-מאוגד סמן, כרומטין הקשורות דפורמציה של הגרעין ולהגדיל את ה-DNA: היחס הנקי חלבון. ביחד, הקריטריונים של NET definition מרובים מאפשרים לכמת את הנטו המחמירים על פני מספר ערכות נתונים בצורה לא משוחדת.

<table><tbody><tr><td>BD Vacutainer צינורות פלסטיק Heparinized</td><td>BD Biosciences</td><td>367885</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Axis-Shield</td><td>114547</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 עם L-גלוטמין</td><td>Gibco</td><td>11835-030</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל צלוחיות חרוטיות</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.004</td><td></td></tr><tr><td>צלוחיות חרוטיות 15 מ"ל</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.002</td><td></td></tr><tr><td>רקמה 12 בארות לוחות תרבות</td><td>פלקון</td><td>10626491</td><td></td></tr><tr><td>#1 כיסויים 10 מ"מ</td><td>מנזל גלייזר</td><td>CS10100</td><td></td></tr><tr><td>זכוכית שקופיות</td><td>מנזל גלייזר</td><td>631-0098</td><td></td></tr><tr><td>אלסטאז ראשוני אנטי אנושי</td><td>DAKO</td><td>DAKO ארנב 1373, חיסון</td><td></td>חוזה</tr><tr><td>פלואורופור מצומד עז נגד ארנב משני</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>A-11072, A-11070</td><td></td></tr><tr><td>מגיב אנטי-דהייה PROLONG-Gold עם טכנולוגיות DAPI</td><td>Life</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>סרום עיזים</td> בינוני <td>הרכבה Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>79346</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Ti-E מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי</td><td>מצלמת CCD ניקון</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>אנדור זילה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תוכנית אפוכרומט 20x, יעדים פי 40</td><td>ניקון</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Windows 10</td><td>מערכת הפעלה</td><td>מיקרוסופט</td><td></td></tr><tr><td>macOS Sierra 10.12</td><td>מערכת הפעלה</td><td>אפל</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

הדמית מבוססת תמונה אוטומטית של מלכודות נויטרופילים באמצעות netquant

Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT

מלכודות נויטרופילים מסחטות (רשתות) הם מבנים מיקרוביאלית כמו האינטרנט המורכב של DNA ו גרגר עושה נגזר חלבונים מיקרוביאלית. מיקרוסקופ immunofluorescence ומבוססי תמונה שיטות הקוונפיקציה להישאר כלים חשובים כדי ככמת היווצרות נויטרופילים המלכודת המבנה. עם זאת, קיימות מגבלות מפתח לשיטות המבוססות על מודלואונציה הזמינות כעת לכימות רשתות. שיטות ידניות של התמונה מבוסס הקוונפיקציה נטו הם לעתים קרובות סובייקטיבי, נוטה שגיאה מייגע עבור משתמשים, במיוחד שאינם מנוסים משתמשים. כמו כן, כיום אפשרויות תוכנה זמינות עבור כימות הן למחצה או אוטומטי או דורשים הכשרה לפני המבצע. כאן, אנו מדגימים את היישום של שיטת כימות החיסונית אוטומטית המבוססת על הטיפול כדי להעריך את היווצרות נטו בשם NETQUANT. התוכנה קלה לשימוש ויש לה ממשק משתמש גרפי ידידותי למשתמש (GUI). הוא מחשיב פרמטרים רלוונטיים ביולוגית כגון גידול בשטח פני השטח DNA: היחס החלבון סמן נטו, ואת דפורמציה גרעינית כדי להגדיר היווצרות נטו. יתר על כן, כלי זה בנוי כיישום זמין באופן חופשי, ומאפשר לכמת זיהוי תא בודד וניתוח.

5 x 105 נויטרופילים/mL הושמו על כיסוי ממוקם בצלחת 12-באר ומגורה עם 20 ננומטר או או שמאל לא מגורה עבור 150 דקות. הדגימות היו לאחר מכן מוכתם באמצעות הארנב הראשי אנטי האדם נוגדנים נויטרופילים elastase, עז משנית נגד הארנב fluorophore מצופף נוגדנים DAPI-צבע מתויג פלואורוסקופים כי כתמי DNA (לראות את הטבלה של חומרים לפרטים). לפחות 5 תמונות נרכשו אז באמצעות מיקרוסקופ אפידלנטית ו 20X (NA = 0.75) המטרה. ניתן להוריד נתונים לדוגמה המשמשים לניתוח הבדיקה בכתב היד על-ידי ביצו...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להפקת נויטרופילים מלכודות (רשתות) ו-NETQUANT הפעלה, תוכנה אוטומטית לחלוטין לכמת של רשתות בתמונות immunofluorescence.

הדמית מבוססת תמונה אוטומטית של מלכודות נויטרופילים באמצעות NETQUANT

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. ...

כאן אנו מציגים NETQUANT, גישה אוטומטית לחלוטין לכימות נטס ותמונות immunofluorescence. זה יעזור לחוקרים לבצע ניתוח תמונה דומה מנתונים שנוצרו על ידי משתמשים מרובים ותנאים. היתרונות של טכניקה זו הם קלות השימוש, ניתוח נתונים חד-תאי, קריטריונים מרובים להערכת היווצרות NET וניתוח לא משוחד של תמונות מרובות.התקן ופתח את תוכנת הניתוח. גרסה עדכנית ניתן למצוא בארכיון Zenodo GitHub, או באתר האינטרנט של מעבדת נורדונפלט. בכרטיסיה הגדרה, בחר תיקיית מקור לניתוח על-ידי לחיצה על האפשרות קבל נתיב בתפריט המקור.בחר את התיקיה המכילה את רצפי התמונות שיש לנתח. שוב, לחץ על האפשרות לקבל נתיב בתפריט היעד, ובחר את תיקיית היעד לשמירת הנתונים הבאים ניתוח תמונה. לאחר מכן, בעת שימוש בתמונות ערוץ נפרדות, תן שם לתיקיות הערוץ כך שערוץ הדנ"א יתאים לכתם הדנ"א הגרעיני, וערוץ NET מתאר את כתם האלסטאז של נויטרופילים בתמונות.כמו כן, תן שם לתיקיה המכילה את קבצי תמונת הפקד כפקד. לאחר מכן, לחצו על לחצן 'טען פרטי תמונה' וטענו את המטה-נתונים של התמונה לתוכנה. לאחר מכן, בתפריט המשנה 'סדר ערוצים', בחרו בסדר הערוץ הנכון הכלול בתמונות.פעולה זו מסייעת במניעת אי-התאמות מקריות. עכשיו לחץ על כפתור הכנת נתונים כדי להשיג מאפייני תמונה ראשוניים מהנתונים הגולמיים ולהמיר את התמונות. התמונות שהומרו יופיעו לאחר מכן בתפריט המשנה סוגים לדוגמה.לחץ על תפריט סוג המדגם, בחר תמונה מתפריט המשנה ולחץ על נתוני תמונת התצוגה כדי להציג את התמונות לפצל לתוך ה-DNA ו נויטרופילים מלכודת Extracellular, או ערוץ NET, בהתאמה. כדי למקטע את התאים לערוצים המתאימים להם, בחר בכרטיסיה שיטת פילוח ובחר שיטה בתפריט המשנה של פעולת השירות הן עבור ה- DNA והן עבור ערוצי NET. שיטת ברירת המחדל של פילוח מוגדרת להתאמה והיא ההגדרה המומלצת.אפשרויות אחרות זמינות בתוכנה כולל קצה גלובלי chanverse. אפשרות קו פרשת המים נכללה גם כדי לסייע להבחין בין תאים הממוקמים היטב או NETs. גם בכרטיסיה פילוח, לחץ על האפשרות דוגמאות פקד פלח שוק.לאחר מכן בחרו PMA מתפריט המשנה לדוגמה ולחצו על אפשרות האצווה כדי להתחיל בפילוח של כל התמונות הכלולות בערכת הנתונים. לאחר מכן, בחרו בתמונות בתפריט סוג הדגימה ולחצו על לחצן נתוני תמונת התצוגה כדי להציג ולאמת את מסיכות התמונה הבינארית הן למסיכות הדנ"א והן למסיכות NET שנוצרו לאחר הפילוח. עכשיו, בכרטיסיה ניתוח, לחץ על כפתור הסף לקבוע לנתח את דוגמאות הפקד.לאחר מכן, בצד ימין, לשנות את סוג המדגם PMA ולחץ על כפתור לקבל מאפייני תא כדי להשלים את הניתוח של דגימות מגורה. לאחר מכן, בחרו תמונה מתפריט המשנה של סוג הדגימה ולחצו על לחצן נתוני תמונת התצוגה כדי להציג את שכבת-המשנה ואת מספר התאים ותאי ה-NET המתגבשים בתמונה. התחל בבחירת הדוגמה מתפריט המשנה של הסוג לדוגמה.ניתן לבחור תמונות בודדות מתפריט המשנה לדוגמה של סוג לניתוח או שניתן לנתח את כל אצוות התמונות על-ידי בחירה באפשרות האצווה. לאחר שנבחר, לחץ על כפתור לנתח NETs כדי להשלים את הניתוח. התאם את קריטריוני NET באופן ידני כדי להניב תוצאות מיטביות עבור מדגם נתון.השווה NETs מזוהים עם התמונות המקוריות כדי להעריך את איכות הזיהוי. לאחר השלמת שלב זה, ניתן להחיל את קריטריוני NET על-פני כל התמונות בערכת הנתונים. כל השינויים שבוצעו בקריטריוני NET מוחלים בו-זמנית גם על כל דוגמאות הבקרה.בדוק את סיכום הנתונים בתפריט המשנה של נתוני התא, שבו מוצגים מספר התמונות, ספירת התאים לתמונה ואחוז ה- NETs לתמונה. הזן את כרטיסיית הפלט כדי לבחור ולהציג את פלטי התוצאות. גלה והשווה את פלטי הנתונים השונים שנוצרו מניתוח דגימות בקרה ודגימות שטופלו ב- PMA על-ידי בחירת צורת הפלט ולחיצה על לחצן תוצאות הפלט.לאחר מכן, הפעל את קובץ CSV של טבלת הנתונים של התוצאות כדי לחקור נתונים של תא יחיד ולחץ על קבצי PDF של תוצאות כדי להמחיש את התפלגות אזור NET ויחס DNA ל- NET בדגימות. הקו האדום מציין את ערך הסף בתרשים. לבסוף, לחץ על קובץ ההפצה bivariate תוצאות כדי לקבוע את אזור NET לעומת צורה של DNA.כאן, 15 תמונות של נויטרופילים שליטה ו -15 תמונות של נויטרופילים מגורה PMA נותחו בפחות מעשר דקות. המספר הכולל של תאים נספרו ואחוז התאים עם מלכודות חוץ תאיות נויטרופילים נקבע באמצעות שיטת הכימות האוטומטית המתוארת במאמר זה. תוצאות אלה מראות כי נויטרופילים מגורה PMA יש שטח גדול יותר, עלייה דפורמציה גרעינית, ויחס DNA ל- NET גבוה יותר מאשר דגימות בקרה.בשילוב לגרף תלת-ממדי, הדגימות הממריצות PMA נוטות להראות אזורים של הידוק קיבועים מאשר דגימות הבקרה. בעת ניסיון ההליך, חשוב לזכור שלמרות שזרימת העבודה נבדקה באמצעות תורמים מרובים, מומלץ שהמשתמש יחליט על פרמטרי התוכנה בהתאם על סמך ערכת הנתונים הבודדת.

automated-image-based-quantification-neutrophil-extracellular-traps

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

סרטון זה מדגים את ההשראות וההדמיה של מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות או NETs בנויטרופילים מסומנים מראש באמצעות נסיוב מטופלים המכיל נוגדנים ציטופלזמיים אנטי-נויטרופילים. יתר על כן, שימוש בצבע DNA בלתי חדיר ומיקרוסקופ פלואורסצנטי מאפשר הדמיה של NETs.

אינדוקציה והדמיה של מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים בנויטרופילים שסומנו מראש

אנו מתארים שיטות כדי לבודד את הכלבים נויטרופילים של דם מלא, להמחיש את NET-צורה נויטרופילים בשידור חי באמצעות מיקרוסקופ זריחה. גם המתוארים הם פרוטוקולים לכמת היווצרות נטו, citrullinated היסטון H3 (citH3) ביטוי באמצעות מיקרוסקופ immunofluorescence.

במבחנה מבנה הכלבי נויטרופילים מלכודת חוץ-תאית: דינמי וניתוח כמותי על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ

פרוטוקול זה מתאר assay מלכודת חוץ-תאית נויטרופילים (נטו) של תפוקה רגיש מאוד, גבוהה עבור כימות חצי אוטומטיות של ex-vivo נטו היווצרות מאת immunofluorescence קונפוקלית תלת מימדי. פרוטוקול זה ניתן להשתמש כדי להעריך את היווצרות נטו והשפלה אחרי גירויים שונים והוא יכול לשמש כדי ללמוד טיפולים פוטנציאליים, ממוקדות נטו.

תפוקה גבוהה הנועד להעריך ולכמת את היווצרות נויטרופילים מלכודת חוץ-תאית

מלכודות מוכילות (רשתות) הן מבנים תלת-מימדיים שנוצרו על-ידי ממריצים נויטרופילים גרנולוציטים. זה הפך ברור בשנים האחרונות כי רשתות מעורבות במגוון רחב של מחלות. זיהוי רשתות ברקמות עשויות להיות בעלת רלוונטיות אבחונית, ולכן נדרשות פרוטוקולים מתוקננת לתיוג רכיבי NET.

Immunofluorescence התוויות של האדם ומורין נויטרופילים מלכודות ממומנת ב-פרפין רקמה מוטבעת

מוצג כאן פרוטוקול לאינדוקציה וניתוח של מלכודות חוץ-תאיות נויטרופיליות במבחנה (NETs). כימות של דנ"א, קתליצידין (LL37) ופעילות אנזים הניב נתונים המראים את השונות בהרכב ובמורפולוגיה של NETs המושרים על ידי גירויים מיקרוביאליים וכימיים בתנאים מבוקרים דומים.

ניתוח מורפולוגי וקומפוזיציוני של מלכודות נויטרופיליות חוץ-תאיות המושרות על ידי גירויים מיקרוביאליים וכימיים

מלכודות חוץ-תאיות נויטרופילים (NETs) קשורות למחלות שונות, ואימונופלואורסנציה משמשת לעתים קרובות להדמיה שלהן. עם זאת, ישנם פרוטוקולי צביעה שונים, ובמקרים רבים, רק סוג אחד של רקמה נבדק. כאן, אנו קובעים פרוטוקול ישים באופן כללי להכתמת רשתות בעכבר וברקמות אנושיות.

הדמיה אימונופלואורסצנטית של מלכודות חוץ-תאיות נויטרופילים ברקמות אדם ועכבר

אנו מציגים שיטה אוטומטית בעלת תפוקה גבוהה לכימות מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות (NETs) באמצעות מערכת ניתוח תאים חיים, יחד עם גישת צבע כפול תלוית חדירות ממברנה.

טכניקת תפוקה גבוהה בזמן אמת לכימות היווצרות מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים בנויטרופילים אנושיים

פרוטוקול מוגדר זה מתאר גישת מיקרוסקופיה בתפוקה גבוהה בזמן אמת כדי להמחיש ולכמת שחרור מלכודת נויטרופילים חוץ-תאית אנושית (NET) במבחנה. השיטה הניתנת לשחזור מאפשרת לחקור את המאפיינים והקינטיקה של שחרור NET בעת גירוי עם משפרי NETosis מובהקים ומאפשרת הערכה של הפרמקולוגיה של אנטגוניסטים של NETosis.

כימות מיקרוסקופי בזמן אמת בתפוקה גבוהה של שחרור מלכודת נויטרופילים חוץ-תאית אנושית והערכת הפרמקולוגיה של אנטגוניסטים

מלכודות תאי נויטרופילים (NETS) הן מנגנון חשוב החיסון המולדת להילחם חיידקים פתוגניים, פטריות וטפילים. כאן אנו מתארים שיטות לבודד גרנולוציטים נויטרופילים מהדם האנושי כדי להפעיל אותם בצורה הרשתות. אנו מציגים טכניקות הכנה לדמיין הרשתות מיקרוסקופ אור אלקטרונים.

מלכודות תאי נויטרופילים: כיצד ליצור מדמיינים אותם

מוצג פרוטוקול לכימות והשוואה בו-זמנית של שלושה רכיבים תאיים וחוץ-תאיים בתוך ביופילמים. המתודולוגיה כוללת שימוש במיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי, תוכנת ניתוח והדמיה מבנית של ביופילם ותוכנת ניתוח סטטיסטי.

כימות בו-זמני של רכיבים תאיים וחוץ-תאיים של ביופילמים

למד כיצד לכמת מלכודות נויטרופילים (NETs) בתמונות פלואורסצנציה באמצעות תוכנת NETQUANT האוטומטית. השיטה מאפשרת ניתוח עקבי וללא הטיה של נתונים בודדים ורב-תמוניים במחקרים אימונולוגיים.

הדמית מבוססת תמונה אוטומטית של מלכודות נויטרופילים באמצעות NETQUANT

גלה סרטונים נוספים