הדמית מבוססת תמונה אוטומטית של מלכודות נויטרופילים באמצעות NETQUANT
27 בנובמבר 2019
כאן, אנו מציגים פרוטוקול להפקת נויטרופילים מלכודות (רשתות) ו-NETQUANT הפעלה, תוכנה אוטומטית לחלוטין לכמת של רשתות בתמונות immunofluorescence.
כאן אנו מציגים NETQUANT, גישה אוטומטית לחלוטין לכימות נטס ותמונות immunofluorescence. זה יעזור לחוקרים לבצע ניתוח תמונה דומה מנתונים שנוצרו על ידי משתמשים מרובים ותנאים. היתרונות של טכניקה זו הם קלות השימוש, ניתוח נתונים חד-תאי, קריטריונים מרובים להערכת היווצרות NET וניתוח לא משוחד של תמונות מרובות.
התקן ופתח את תוכנת הניתוח. גרסה עדכנית ניתן למצוא בארכיון Zenodo GitHub, או באתר האינטרנט של מעבדת נורדונפלט. בכרטיסיה הגדרה, בחר תיקיית מקור לניתוח על-ידי לחיצה על האפשרות קבל נתיב בתפריט המקור.
בחר את התיקיה המכילה את רצפי התמונות שיש לנתח. שוב, לחץ על האפשרות לקבל נתיב בתפריט היעד, ובחר את תיקיית היעד לשמירת הנתונים הבאים ניתוח תמונה. לאחר מכן, בעת שימוש בתמונות ערוץ נפרדות, תן שם לתיקיות הערוץ כך שערוץ הדנ"א יתאים לכתם הדנ"א הגרעיני, וערוץ NET מתאר את כתם האלסטאז של נויטרופילים בתמונות.
כמו כן, תן שם לתיקיה המכילה את קבצי תמונת הפקד כפקד. לאחר מכן, לחצו על לחצן 'טען פרטי תמונה' וטענו את המטה-נתונים של התמונה לתוכנה. לאחר מכן, בתפריט המשנה 'סדר ערוצים', בחרו בסדר הערוץ הנכון הכלול בתמונות.
פעולה זו מסייעת במניעת אי-התאמות מקריות. עכשיו לחץ על כפתור הכנת נתונים כדי להשיג מאפייני תמונה ראשוניים מהנתונים הגולמיים ולהמיר את התמונות. התמונות שהומרו יופיעו לאחר מכן בתפריט המשנה סוגים לדוגמה.
לחץ על תפריט סוג המדגם, בחר תמונה מתפריט המשנה ולחץ על נתוני תמונת התצוגה כדי להציג את התמונות לפצל לתוך ה-DNA ו נויטרופילים מלכודת Extracellular, או ערוץ NET, בהתאמה. כדי למקטע את התאים לערוצים המתאימים להם, בחר בכרטיסיה שיטת פילוח ובחר שיטה בתפריט המשנה של פעולת השירות הן עבור ה- DNA והן עבור ערוצי NET. שיטת ברירת המחדל של פילוח מוגדרת להתאמה והיא ההגדרה המומלצת.
אפשרויות אחרות זמינות בתוכנה כולל קצה גלובלי chanverse. אפשרות קו פרשת המים נכללה גם כדי לסייע להבחין בין תאים הממוקמים היטב או NETs. גם בכרטיסיה פילוח, לחץ על האפשרות דוגמאות פקד פלח שוק.
לאחר מכן בחרו PMA מתפריט המשנה לדוגמה ולחצו על אפשרות האצווה כדי להתחיל בפילוח של כל התמונות הכלולות בערכת הנתונים. לאחר מכן, בחרו בתמונות בתפריט סוג הדגימה ולחצו על לחצן נתוני תמונת התצוגה כדי להציג ולאמת את מסיכות התמונה הבינארית הן למסיכות הדנ"א והן למסיכות NET שנוצרו לאחר הפילוח. עכשיו, בכרטיסיה ניתוח, לחץ על כפתור הסף לקבוע לנתח את דוגמאות הפקד.
לאחר מכן, בצד ימין, לשנות את סוג המדגם PMA ולחץ על כפתור לקבל מאפייני תא כדי להשלים את הניתוח של דגימות מגורה. לאחר מכן, בחרו תמונה מתפריט המשנה של סוג הדגימה ולחצו על לחצן נתוני תמונת התצוגה כדי להציג את שכבת-המשנה ואת מספר התאים ותאי ה-NET המתגבשים בתמונה. התחל בבחירת הדוגמה מתפריט המשנה של הסוג לדוגמה.
ניתן לבחור תמונות בודדות מתפריט המשנה לדוגמה של סוג לניתוח או שניתן לנתח את כל אצוות התמונות על-ידי בחירה באפשרות האצווה. לאחר שנבחר, לחץ על כפתור לנתח NETs כדי להשלים את הניתוח. התאם את קריטריוני NET באופן ידני כדי להניב תוצאות מיטביות עבור מדגם נתון.
השווה NETs מזוהים עם התמונות המקוריות כדי להעריך את איכות הזיהוי. לאחר השלמת שלב זה, ניתן להחיל את קריטריוני NET על-פני כל התמונות בערכת הנתונים. כל השינויים שבוצעו בקריטריוני NET מוחלים בו-זמנית גם על כל דוגמאות הבקרה.
בדוק את סיכום הנתונים בתפריט המשנה של נתוני התא, שבו מוצגים מספר התמונות, ספירת התאים לתמונה ואחוז ה- NETs לתמונה. הזן את כרטיסיית הפלט כדי לבחור ולהציג את פלטי התוצאות. גלה והשווה את פלטי הנתונים השונים שנוצרו מניתוח דגימות בקרה ודגימות שטופלו ב- PMA על-ידי בחירת צורת הפלט ולחיצה על לחצן תוצאות הפלט.
לאחר מכן, הפעל את קובץ CSV של טבלת הנתונים של התוצאות כדי לחקור נתונים של תא יחיד ולחץ על קבצי PDF של תוצאות כדי להמחיש את התפלגות אזור NET ויחס DNA ל- NET בדגימות. הקו האדום מציין את ערך הסף בתרשים. לבסוף, לחץ על קובץ ההפצה bivariate תוצאות כדי לקבוע את אזור NET לעומת צורה של DNA.
כאן, 15 תמונות של נויטרופילים שליטה ו -15 תמונות של נויטרופילים מגורה PMA נותחו בפחות מעשר דקות. המספר הכולל של תאים נספרו ואחוז התאים עם מלכודות חוץ תאיות נויטרופילים נקבע באמצעות שיטת הכימות האוטומטית המתוארת במאמר זה. תוצאות אלה מראות כי נויטרופילים מגורה PMA יש שטח גדול יותר, עלייה דפורמציה גרעינית, ויחס DNA ל- NET גבוה יותר מאשר דגימות בקרה.
בשילוב לגרף תלת-ממדי, הדגימות הממריצות PMA נוטות להראות אזורים של הידוק קיבועים מאשר דגימות הבקרה. בעת ניסיון ההליך, חשוב לזכור שלמרות שזרימת העבודה נבדקה באמצעות תורמים מרובים, מומלץ שהמשתמש יחליט על פרמטרי התוכנה בהתאם על סמך ערכת הנתונים הבודדת.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג את NETQUANT, תוכנה אוטומטית לחלוטין שנועדה לכימות של מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים (NETs) בתמונות אימונופלואורסצנציה. כלי זה נועד להקל על ניתוח תמונות עקבי תחת תנאי מחקר שונים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- אימונולוגיה
- ניתוח תמונות
רקע
- מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים (NETs) ממלאות תפקיד מכריע בתגובה החיסונית.
- כימות של NETs חיוני להבנת תפקודם והשלכותיהם במחלות שונות.
- שיטות קיימות לכימות NETs עשויות להיות לא עקביות בין משתמשים ותנאים שונים.
- NETQUANT שואפת להפוך תהליך זה לסטנדרטי באמצעות אוטומציה.
מטרת המחקר
- להציג תוכנה ידידותית למשתמש לצורך כימות של NETs.
- לאפשר לחוקרים לבצע ניתוח לא מוטה של תמונות מרובות.
- להקל על ניתוח נתוני תא בודד והערכה של היווצרות NETs.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- התקנת תוכנת NETQUANT מארכיב ה-GitHub של Zenodo או מאתר מעבדת Nordonfelt.
- בחירת תיקיית המקור לניתוח דרך ממשק התוכנה.
- שימוש במגוון קריטריונים להערכת היווצרות NET.
- עיבוד אוטומטי של תמונות אימונופלואורסצנציה לצורך כימות.
תוצאות עיקריות
- NETQUANT מספקת גישה יעילה לכימות NET.
- התוכנה מאפשרת ניתוח עקבי בין תנאים ניסויים שונים.
- חוקרים יכולים לקבל תוצאות בלתי מוטות ממספר תמונות.
- ניתוח נתונים ברמת התא הבודד משפר את ההבנה של תהליך היווצרות ה-NET.
מסקנות
- NETQUANT הוא כלי בעל ערך עבור חוקרים הלומדים NETs.
- התוכנה משפרת את מהימנות ניתוח התמונות במחקרי אימונופלורסצנציה.
- מחקרים עתידיים יכולים להשתמש בכלי זה לצורך הערכות מדויקות יותר של תופעות הקשורות ל-NET.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך סיכום
כימות אוטומטי מבוסס-תמונה של מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים (NETs) פותר צוואר בקבוק קריטי במחקרי אימונולוגיה ודלקת, על ידי מתן אפשרות לניתוח אובייקטיבי ובעל תפוקה גבוהה של היווצרות NETs. יכולת זו תומכת בתיקוף מטרות ובצמצום סיכונים מכניסטיים בתוכניות לגילוי תרופות המתמקדות במסלולים המתווכים על ידי נויטרופילים, מחלות דלקתיות ומנגנוני הגנה של המארח. באמצעות אספקת נתונים ברזולוציה של תא בודד וקריטריונים סטנדרטיים לזיהוי NETs, מערכת NETQUANT משפרת את רמת הביטחון החזויה במודלים פרה-קליניים ומסייעת לשיתוף פעולה רב-תחומי בין צוותי אימונולוגיה, דימות ומדעי הנתונים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות הקשורות למסלולי NETosis ולתפקוד הנויטרופילים במודלים של מחלות.
- ערך תפעולי: מספק פרמטרים רלוונטיים ביולוגית, כגון עלייה בשטח הפנים, יחס בין DNA לחלבון מסמן של NET ועיוות גרעיני, להגדרת היווצרות NET ברזולוציה של תא בודד.
- ערך ניבוי: תומך בתיקוף של מטרות פונקציונליות באמצעות כימות היווצרות NET בתגובה לגירויים כגון PMA, מה שמאפשר להעריך את השפעת תרכובות על שחרור רשתות חוץ-תאיות של נויטרופילים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: מכין מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף לתהליכי עבודה המשכיים על ידי יצירת פלטים כמותיים וסטנדרטיים מתמונות אימונופלואורסצנציה.
- שחזוריות: נותן מענה למגבלות מרכזיות של שיטות ידניות וחצי-אוטומטיות על ידי אספקת ניתוח בלתי מוטה עבור משתמשים ותנאים מרובים, באמצעות קביעה אוטומטית של סף ועיבוד באצווה (batch processing).
- מדרגיות: מאפשר מוכנות לסריקה ושימוש חוזר בפלטפורמה באמצעות אפליקציה הזמינה בחינם עם ממשק משתמש (GUI) ידידותי, המעבדת רצפי תמונות בפחות מעשר דקות עבור מערכי נתונים ניסויים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: תומך בהתאמה של ביומרקרים תרגומיים על ידי כימות של יצירת NET, תהליך המעורב במחלות אוטו-אימוניות, גרורות סרטניות והפרעות תרומבוטיות.
- המשכיות פרה-קלינית: מסייע בקבלת החלטות על קידום מותאם סיכונים באמצעות אספקת מדידות כמותיות של משתנים תלויים (למשל, אחוז תאים היוצרים NET, התפלגות שטח ה-NET) המאפשרות השוואה בין דגימות ביקורת לדגימות שעברו סטימולציה.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מתמקד בערך לניבוי והפחתת סיכונים באמצעות ניתוח רב-משתני של שטח ה-NET לעומת צורת ה-DNA, ובכך מסייע בהבהרת מנגנוני פעולה בסריקת תרכובות אימונומודולטוריות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
NETQUANT משתלב ברצף הגילוי, החל משלב תיקוף המטרה המוקדם, דרך זיהוי המולקולה המובילה ועד לעבודות פרה-קליניות, ובמיוחד בתוכניות המתמקדות באימונולוגיה ובדלקת, שבהן NETosis מהווה מנגנון פתופיזיולוגי רלוונטי.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות ובבירור נתיבים על ידי אפשור כימות אוטומטי של היווצרות NET בתגובה להפרעות גנטיות או פרמקולוגיות.
- סינון: מתאר את מוכנות הבדיקה באמצעות עיבוד אוטומטי של תמונות אימונופלואורסצנציה, פלטים כמותיים ויכולות ניתוח של סדרות (batches) המבטיחות הדירות בין תנאים ניסיוניים.
- אנליטיקה: מדגיש מדידות כגון ספירת תאים לכל תמונה, אחוז NETs לכל תמונה, התפלגות שטח NET ויחס DNA ל-NET המסייעים לצוויות להשוות בין תנאים ולהעריך השפעות של תרכובות.
- מחקר תרגומי: מקשר את השיטה להמשכיות פרה-קלינית באמצעות ניתוח של היווצרות NET במערכות הרלוונטיות למחלה, דבר בעל השלכות על ספסיס, לופוס ותרומבוזה הקשורה לסרטן.
- שימוש חוזר ארגוני: מציג את השיטה כיכולת הניתנת לשימוש חוזר ולא כטכניקה לשימוש חד-פעמי, עם תוכנה הזמינה בחינם התומכת בסטנדרטיזציה בין אתרים ופרויקטים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזוי, תיקוף מטרות, והפחתת עמימות מכניסטית במסלולי NETosis.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה, הדירות ויכולת הרחבה של כימות NET מבוסס דימויים בין משתמשים ואתרים שונים.
- ערך אסטרטגי: קבלת החלטות משופרת לגבי המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go), יעילות הון, והפחתת סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים בתוכניות לפיתוח תרופות הממוקדות בדלקת.
- השפעה על הפורטפוליו: תעדוף וקבלת החלטות על קידום פרויקטים מותאמי סיכון, בהתבסס על נתונים כמותיים של היווצרות NET ממודלים פרה-קליניים.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות מדעית במיקרוסקופיה של אימונופלורסצנציה ובעקרונות ניתוח תמונות.
- דרישות לתשתיות מכשירים ואנליזה, כולל מיקרוסקופיה פלואורסצנטית ופורמטים תואמים של קבצי תמונה.
- דרישות לסטנדרטיזציה בין צוותים עבור שיום ערוצים, שיטות סגמנטציה ויישום קריטריונים ל-NET בדגימות בקרה ובדגימות שעברו סטימולציה.
- שיקולי התאמה בין מערכות מודל, כגון נויטרופילים אנושיים לעומת עכבריים ותנאי סטימולציה שונים מעבר ל-PMA.
- מגבלות מעשיות הנתמכות בחומרי המקור: על המשתמשים לקבוע את פרמטרי התוכנה באופן הולם בהתבסס על מערכי נתונים אישיים, ואימות זרימת העבודה עשוי לדרוש אופטימיזציה עבור סוגי תאים ספציפיים או פרוטוקולי צביעה.
שאלות נפוצות בביו-פרמה
Chapters in this video
0:04
Title
0:34
Analysis and Quantification of Neutrophil Extracellular Traps (NETs)
2:19
Segmentation of Cells in the DNA Channel and the NET Channel
3:41
Single-cell Analysis of Identifiable Properties
4:19
Comparison of Cell Properties to Identify NET-forming Cells
5:23
Result Outputs Demeanor
6:16
Results: Analysis of NET Formation
7:07
Conclusion
