בידוד, קיבוע, Immunofluorescence הדמיה של העכבר בלוטת יותרת הכליה

Immunofluorescence היא שיטה בסיסית שיכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בשדה יותרת הכליה על זום יותרת הכליה, זהות התא ותפקוד. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת מחקר של חלבונים מרובים תוך שמירה על המורפולוגיה של רקמת יותרת הכליה. כדי להסיר את בלוטת יותרת הכליה מורין, לחתוך סביב רקמת השומן שמסביב למקם את הבלוטה באר אחת של צלחת 24-multiwell המכיל PBS טרי על קרח.

מעבירים את הבלוטה לצלחת פטרי או תמיכה בזכוכית תחת מיקרוסקופ חיטוי ולהשתמש בשתי 25 מחטי מד כדי להסיר את רקמת השומן הסמוכה. כאשר כל השומן הוסר, לתקן את הרקמה ב 4% paraformaldehyde בארבע מעלות צלזיוס עם נדנדה במשך שעתיים. בסוף הדגירה, לשטוף את הבלוטה עם שלוש 15 דקות שוטף בארבע מעלות צלזיוס באחד עד שני מיליליטר של PBS טרי לכל לשטוף.

לאחר הכביסה האחרונה, לייבש את הבלוטה בשתי טבילות אתנול רציפות בארבע מעלות צלזיוס עם נדנדה במשך שעתיים לכל דגירה. כדי להכין את רקמת יותרת הכליה לעיבוד, לעטוף את הבלוטה גזה ולהקיף את יותרת הכליה בקלטת הטבעת רקמות. לאחר מכן, מניחים את הקלטת בצנצנת מלאה באתנול של 70% לאחסון של ארבע מעלות צלזיוס עד לעיבוד.

כדי לעבד את הרקמה, הכנס את הקלטת למעבד הרקמות לעיבוד כפי שצוין בטבלה. בסוף התוכנית, להעביר את הקלטת לתחנת הטבעה מלא פרפין מומס 65 מעלות ולהשתמש זוג מדפים כדי לפתור את הגזה. מעבירים בעדינות את יותרת הכליה בתנוחה המתאימה במרכז בסיס התבנית המוטבעת ויוצקים את הפרפין המומס על הבלוטה.

לאחר מכן, בזהירות להעביר את התבנית הטבעה למגש קירור כדי להקל על התקשות של פרפין. לפני חתך על ידי microtome סיבובי, תווית סדרה של שקופיות מיקרוסקופ ולהניח את השקופיות על 37 מעלות צלזיוס להחליק חם יותר. מחלקים כ-450 מיקרוליטרים של מים טהורים במיוחד על כל מגלשה ומגדירים את עובי החיתוך של המיקרוטום לחמישה מיקרומטרים.

לטעון את הרקמה המוטבעת על בלוק החיתוך ולהוריד את בלוק הפרפין עד המדגם הוא ברמת הפנים עם קצה להב microtome. סיבוב גלגל היד עם קצב קבוע, לבצע גיזום ראשוני כדי להסיר את הפרפין ולחשוף את רקמת יותרת הכליה. לאחר מכן, לרכוש חמישה מקטעי מיקרומטר עד סוף בלוטת יותרת הכליה באמצעות מדפים להעביר כל קטע לתוך טיפת המים על אחת השקופיות שכותרתו מראש כפי שהוא נאסף.

לאחר אישור נוכחות של רקמה בחלקים על ידי מיקרוסקופיה, לייבש את המגלשות על הצלחת החמה במשך כשעתיים ואופים אותם לפחות לילה על מגש שקופית ב 37 מעלות צלזיוס עד לא יותר מים גלויים. לאחר הייבוש, אחסן את השקופיות בתיבת שקופיות בטמפרטורת החדר. לאחזור אנטיגן immunofluorescence, דה-פרפיניזציה של השקופיות עם שתי חמש דקות 100% קסילן טבילה, ואחריו התייבשות בסדרת אתנול יורד טבילה במים.

לאחר טבילת המים, מעבירים את המגלשות למחזיק מגלשת מתכת וממקמים את המחזיק במזנון של ציטראט טוחן 0.01 רותח על צלחת חמה במשך 10 דקות. בסוף הדגירה, להסיר את ה מהצלחת החמה ולתת לו להתקרר במשך 20 דקות, דואג כי כל קטעי יותרת הכליה עדיין מכוסים חיץ. כאשר המזווה מקורר, מעבירים את המגלשות לצנצנת קופלין לשלושה שטיפות של 10 דקות ב- PBS טרי עם נדנדה עדינה.

לאחר הכביסה האחרונה, בזהירות לנגב את פני השטח של כל שקופית מבלי לפגוע בקטעי הרקמה ולהשתמש סמן הידרופובי לעשות עיגול סביב כל קטע. מניחים את השקופיות בתא לח ומוסיפים במהירות לפחות 50 מיקרוליטרים של פתרון חסימה לכל קטע עבור דגירה של שעה בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה החוסמת, לשטוף את המגלשות שלוש פעמים PBS טרי במשך חמש דקות לשטוף עם נדנדה ולהחזיר שקופיות לתא.

לאחר מכן, מוסיפים את קוקטייל הנוגדנים העיקרי של עניין לכל סעיף עבור דגירה לילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר, לשטוף את הדגימות עם שלוש 15 דקות שטיפה PBS טרי לכל לשטוף ולתייג את השקופיות עם פתרון נוגדנים משני המתאים במשך שעה אחת מוגן מפני אור. בסוף הדגירה, לשטוף את הדגימות עם שלוש 15 דקות שטיפה על נדנדה מוגנת מפני אור, תיוג הגרעינים של החלקים עם DAPI במשך שבע דקות בטמפרטורת החדר מוגן מפני אור לאחר לשטוף האחרון.

לאחר שלוש חמש דקות PBS שוטף עם נדנדה, להוסיף 60 microliters של חומר הרכבה מתאים immunofluorescence לאורך פני השטח של כיסוי אחת לכל מדגם בקלילות ללחוץ על כל קטע רקמת החלקה למטה על כיסוי, דואג למנוע בועות. לאחר מכן, מניחים כל שקופית שטוחה במיכל כהה לריפוי בטמפרטורת החדר לפחות 24 שעות לפני ההדמיה. במהלך תהליך הסרת השומן, זה קריטי לא לתת בלוטת יותרת הכליה להתייבש כמו התייבשות יכולה להזיק למבנה הרקמה.

לאחר הסרה מוצלחת של רקמת השומן שמסביב, בלוטת יותרת הכליה צריך להיות מזוהה בקלות ללא שומן גלוי נוסף. Immunostaining של מקטעי בלוטת יותרת הכליה כפי שהודגם מגלה גורם סטרואידים גרעיניים אחד מכתים של התאים adrenocortical, טירוסין הידרוקסילאז כתמים של תאים medullary, כתם DAPI של הגרעינים של תאים שאינם סטרואידים של הקפסולה החיצונית, וכתמים במשותף עם תאים אדנוקורטיים ו Medullary. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור כי בלוטת יותרת הכליה של העכבר הם קטנים, כי עמדותיהם משתנות במקצת מה שהופך את הזיהוי שלהם קשה.

לכן, חיוני לקבל תצוגה ברורה של האזור במהלך הניתוח. הליכים אלה הם טכניקות בסיסיות לחקר בלוטת יותרת הכליה ב vivo. בעקבות אלה, ניתן לבצע שיטות נוספות של כשל חיסוני כדי לענות על צרכים מדעיים ספציפיים.

לאחר התפתחותו, כשל חיסוני סלל את הדרך לחוקרים בתחומי המדע הביו-רפואי לחקור את ביטוי החלבון situ, כלי שימושי בתחומים ובתחומים רבים.