Name: בידוד, קיבוע, Immunofluorescence הדמיה של העכבר בלוטת יותרת הכליה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-02T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: למדו בידוד בלוטות יותרת הכליה בעכברים, קיבוע בפרפורמלדהיד 4% וצביעת immunofluorescence לחקר זיהוי תאים וזונציה שלדרנית תוך שמירה על מורפולוגיית הרקמה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים ד ר פרהיוט אבבה זובייר על ההערות המועילות שלו וסיוע טכני בהקמה של פרוטוקול זה. עבודה זו נתמכה על ידי במכון הלאומי של סוכרת, העיכול, מחלות כליה, נבחרת מוסדות של הבריאות מחקר גרנט 2R01-DK062027 (ל G.D.H).

<ol><li>Brandtzaeg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+increasing+power+of+immunohistochemistry+and+immunocytochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">The increasing power of immunohistochemistry and immunocytochemistry.</a> Journal of Immunological Methods. 216 (1-2), 49-67 (1998).</li>
<li>Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemistry+as+an+important+tool+in+biomarkers+detection+and+clinical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Biomark+Insights%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice.</a> Biomark Insights. 5, 9-20 (2010).</li>
<li>Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://journals.sagepub.com/doi/10.3181/00379727-47-13084P">Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).</li>
<li>Lerario, A. M., Finco, I., LaPensee, C., Hammer, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Mechanisms+of+Stem%2F+Progenitor+Cell+Maintenance+in+the+Adrenal+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Molecular Mechanisms of Stem/ Progenitor Cell Maintenance in the Adrenal Cortex.</a> Frontiers in Endocrinology. 8, (2017).</li>
<li>Yates, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adrenocortical+Development%2C+Maintenance%2C+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Gland+Development+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Adrenocortical Development, Maintenance, and Disease.</a> Endocrine Gland Development and Disease. 106, 239-312 (2013).</li>
<li>Jones, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+in+the+Mouse+Adrenal+Cortex+with+Special+Reference+to+the+Zona+Reticularis+and+to+Brown+Degeneration%2C+Together+with+a+Discussion+of+the+Cell+Migration+Theory%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Journal+of+Microscopical+Science%22%5BJournal%5D)">Variation in the Mouse Adrenal Cortex with Special Reference to the Zona Reticularis and to Brown Degeneration, Together with a Discussion of the Cell Migration Theory.</a> Quarterly Journal of Microscopical Science. 89 (1), 53(1948).</li>
<li>Sucheston, M. E. C., Samuel, M. <a target="_blank" href="https://pdfs.semanticscholar.org/e6f2/ef2e1761e7eb22ceeca818610ff152539fbe.pdf">The Transient-Zone in the Human and Mouse Adrenal Gland.</a> The Ohio Journal of Science. 72, n2 (March, 1972) 120-126 (1972).</li>
<li>Guasti, L., Paul, A., Laufer, E., King, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+Sonic+hedgehog+secreting+and+receiving+cells+in+the+developing+and+adult+rat+adrenal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Localization of Sonic hedgehog secreting and receiving cells in the developing and adult rat adrenal cortex.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 117-122 (2011).</li>
<li>Pihlajoki, M., Dorner, J., Cochran, R. S., Heikinheimo, M., Wilson, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adrenocortical+zonation%2C+renewal%2C+and+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Adrenocortical zonation, renewal, and remodeling.</a> Frontiers in Endocrinology. 6, 27(2015).</li>
<li>Farese, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+Droplets+Finally+Get+a+Little+R-E-S-P-E-C-T%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Lipid Droplets Finally Get a Little R-E-S-P-E-C-T.</a> Cell. 139 (5), 855-860 (2009).</li>
<li>Shen, W. J., Azhar, S., Kraemer, F. B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26639173">Lipid droplets and steroidogenic cells.</a> Experimental Cell Research. 340 (2), 209-214 (2016).</li>
<li>Finco, I., LaPensee, C. R., Krill, K. T., Hammer, G. D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25668018">Hedgehog signaling and steroidogenesis.</a> Annual Review of Physiology. 77, 105-129 (2015).</li>
<li>Paul, A., Laufer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+biotin+as+a+marker+of+adrenocortical+cells+with+steroidogenic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Endogenous biotin as a marker of adrenocortical cells with steroidogenic potential.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 133-140 (2011).</li>
<li>Lowe, J., Anderson, P. <a target="_blank" href="https://www.elsevier.com/books/stevens-and-lowes-human-histology-fourth-edition/9780723435020">Stevens & Lowe's Human Histology, 4th Edition</a>. , Elsevier/Mosby. 263-285 (2015).</li>
<li>Nagatsu, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1684650">Genes for human catecholamine-synthesizing enzymes.</a> Neuroscience Research. 12 (2), 315-345 (1991).</li>
<li>Berthon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+effects+of+Armc5+haploinsufficiency+on+adrenocortical+function%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Geneticst%22%5BJournal%5D)">Age-dependent effects of Armc5 haploinsufficiency on adrenocortical function.</a> Human Molecular Geneticst. 26 (18), 3495-3507 (2017).</li>
<li>Brown, C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9864103">Antigen retrieval methods for immunohistochemistry.</a> Toxicologic Pathology. 26 (6), 830-831 (1998).</li>
<li>Billinton, N., Knight, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+the+wood+through+the+trees%3A+a+review+of+techniques+for+distinguishing+green+fluorescent+protein+from+endogenous+autofluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Seeing the wood through the trees: a review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence.</a> Analytical Biochemistry. 291 (2), 175-197 (2001).</li>
<li>Hirsch, R. E., San George, R. C., Nagel, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+fluorometric+determination+of+the+stable+state+of+aggregation+in+hemoglobins%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Intrinsic fluorometric determination of the stable state of aggregation in hemoglobins.</a> Analytical Biochemistry. 149 (2), 415-420 (1985).</li>
<li>Whittington, N. C., Wray, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+Red+Blood+Cell+Autofluorescence+for+Immunocytochemistry+on+Fixed+Embryonic+Mouse+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Suppression of Red Blood Cell Autofluorescence for Immunocytochemistry on Fixed Embryonic Mouse Tissue.</a> Current Protocols in Neuroscience. 81, 28(2017).</li>
<li>Watson, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21391776">Suppressing autofluorescence of erythrocytes.</a> Biotechnic & Histochemistry. 86 (3), 207(2011).</li>
<li>Epp, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+CLARITY+for+Clearing+Whole-Brain+and+Other+Intact+Organs%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs.</a> eNeuro. 2 (3), (2015).</li>
<li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

פרוטוקול זה מתאר שיטה בידודו של העכבר יותרת הכליה יחד עם ההכנה, צביעה של העכבר פרפין-מוטבע משרטוטי האדרנלים.
לעומת פרוטוקולים אחרים שבדקנו, פרוטוקול immunofluorescence זה הוכיח מתאים עבור הרוב המכריע של נוגדנים בשימוש המעבדה שלנו. עם זאת, במקרים מסוימים זה עשוי לדרוש כמה התאמות כדי לשפר את התוצאות מוכתמים. משתנה אחד זה יכול בקלות להיות שונה ונבדק הוא האורך של קיבעון. במעבדה שלנו, הדגירה ב- 4% PFA יכול לנוע בין 1 h כדי 4h, ואילו במעבדות אחרות הזמן קיבוע מורחב ל 12 – 24 h16</su...

אימונוהיסטוכימיה היא טכניקה לגילוי הרקמות מרכיבים עם השימוש של נוגדנים ספציפיים מולקולות התאית, טכניקות צביעת הבאים כדי לזהות את הנוגדנים מצומדת1. הליך immunohistochemical דורש קיבוע ספציפיים, עיבוד של רקמות שנקבעות לעיתים קרובות מדעית של אנטיגן ספציפי, רקמות, נוגדן מנוצל2. קיבעון הוא חיוני כדי לשמור על המדינה "מקורי" של הרקמות, ובכך שומר על סלולרי ללא פגע, subcellular מבנים ותבניות ביטוי. בהמשך הטמעת נהלים ועיבוד נדרשים להכין את הרקמה חלוקתה פרוסות דק המשמשים עבור היסטולוגית מחקרים שכללו אימונוהיסטוכימיה.
Immunostaining יכול להתבצע עם זיהוי הדפסות כסף או פלורסנט. זיהוי הדפסות כסף מחייבת הניצול של אנזים להמיר מצע מסיסים מוצר בצבע לא מסיסים. בעוד אנזים זה יכול להיות מצומדת כדי הנוגדן לזהות אנטיגן (נוגדן ראשוני), היא מצומדת לעתים קרובות יותר כדי הנוגדן לזהות נוגדן ראשוני (קרי, הנוגדן משנית). טכניקה זו היא רגישה מאוד; המוצר בצבע הנובע התגובה אנזימטי photostable ודורש רק מיקרוסקופ brightfield עבור הדמיה. עם זאת, immunostaining הדפסות כסף מתאים בהכרח כאשר מנסה להמחיש שני חלבונים לשפה משותפת, מאז בתצהיר של צבע אחד יכול להסוות בתצהיר של האחר. במקרה של שיתוף מכתים, immunofluorescence הוכיחה להיות יותר יתרון. כניסתו של immunofluorescence מיוחס אלברט ירקו ועמיתיו, שפיתח מערכת כדי לזהות אנטיגנים רקמות עם נוגדנים מסומנים fluorescein ותנסו לדמיין את אותם ברקמות משרטוטי תחת אור אולטרה סגול3. קרינה פלואורסצנטית זיהוי מבוסס על נוגדן מצומדת עם fluorophore הפולטת אור לאחר עירור. מכיוון שישנם מספר fluorophores עם פליטת באורכי גל שונים (עם חפיפה אין או הקטנה), שיטה זו זיהוי הינו אידיאלי עבור המחקרים של מספר חלבונים.
בלוטת יותרת הכליה הוא איבר לזווג הממוקם מעל הכליה, המאופיינת על ידי שני מרכיבים נפרדים embryologically מוקף קפסולה mesenchymal. קליפת יותרת הכליה החיצוני, נגזר והמזודרם ביניים, mesonephric מפריש הורמונים סטרואידים בעוד לשד פנימית, נגזר על הרכס העצבי, מייצרת catecholamines כולל אדרנלין ונוראדרנלין, דופמין. קליפת יותרת הכליה בהיסטולוגיה והן מבחינה תפקודית מחולקת לשלושה אזורים קונצנטריים, עם כל אזור מפריש מחלקות שונות של הורמונים סטרואידים: glomerulosa zona החיצוני (zG) מייצרת mineralocorticoids המווסתים הומאוסטזיס אלקטרוליט, קרישה תוך-כלית כרך; fasciculata zona האמצעי (zF), ישירות מתחת zG, מפריש glucocorticoids המתווכות את תגובת המתח דרך הגיוס של מאגרי האנרגיה כדי להגדיל גלוקוז; וסקס reticularis zona הפנימי (zR), אשר משלב מבשרי סטרואידים (קרי, דהידרואפיאנדרוסטרון (DHEAS))4.
גיוון ב- adrenocortical zonation קיים בין המינים: לדוגמה, ס. מאסכאלאס חסרה את zR. ייחודי כמחנכת X-האזור של מסיה musculus הוא שריד של קליפת המוח העוברי מאופיין על ידי תאים קטנים השומנים עלוב עם acidophilic cytoplasms5. אזור X נעלמת בגיל ההתבגרות בעכברים זכרים, לאחר ההריון הראשון בעכברים נקבה, או בהדרגה והגויות ב הנקבות-bred לא6,7. יתר על כן, tortuosity ואת עובי המוצגים zG שסומנו וריאציה בין המינים אינה ארגון של תאי גזע וקדמון היקפיים, סמוך zG. העכברוש, בניגוד מכרסמים אחרים, יש אזור מובחן גלוי (זו) בין zG המיקלע זד אף כי פונקציות כמו אזור תא גזע ו/או אזור של ארעי הגברה אבות. אם זו היא ייחודית חולדות או פשוט יותר מאורגן בצורה בולטת אשכול של תאים הוא לא ידוע8,9.
תאים של קליפת יותרת הכליה מכילים טיפות השומנים המאחסנים אסטרים כולסטרול לשרת כמבשר הורמונים סטרואידים כל10,11.  המונח "steroidogenesis" מגדיר את תהליך הייצור של הורמונים סטרואידים מ כולסטרול דרך סדרה של תגובות אנזימטיות המערבות את הפעילות של פקטור שחלת בקר 1 (SF1), אשר הביטוי הוא סמן של פוטנציאל שחלת בקר. בלוטת יותרת הכליה, ביטוי Sf1 קיים רק בתאים של קליפת12. אדם מעניין למצוא הביטוי של ביוטין אנדוגני תאים adrenocortical עם פוטנציאל שחלת בקר13. זה אמנם יכול להיות הגורם של רקע גבוה יותר מבוססות-ביוטין/streptavidin שיטות מוכתמים, עקב הגילוי של ביוטין אנדוגני על ידי נוגדנים מצומדת עם streptavidin, מאפיין זה יכול להיות מועסק גם כדי להבדיל את שחלת בקר תאים של אוכלוסיות אחרות בתוך בלוטת יותרת הכליה, קרי, אנדותל, דרכים, ואת תאי לשד.
Innervated על ידי נוירונים preganglionic אוהדת ליבת יותרת הכליה מאופיין על ידי תאים basophilic עם ציטופלזמה פרטנית המכיל אפינפרין ונוראפינפרין. לשד תאים נקראים "chromaffin" בשל תכולה גבוהה של catecholamines בצורת פיגמנט חום לאחר חמצון14. טירוזין hydroxylase (ה) הוא האנזים מזרז את הצעד הגבלת קצב הסינתזה של catecholamines ו, ב בלוטת יותרת הכליה, מתבטאת רק לשד ה-15.
כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור הבידוד של העכבר בלוטת יותרת הכליה, עיבודם להטבעת פרפין, חלוקתה, ואת שיטה לבצע immunofluorescence מכתים במקטעי האדרנל כדי לזהות את סוגי הסלולר המהוות קליפת יותרת הכליה ואת לשד. פרוטוקול זה הוא תקן במעבדה שלנו עבור immunostaining עם מספר נוגדנים בשימוש שגרתי במחקר שלנו.

<table><tbody><tr><td>צלחת תרבית תאים 24 בארות</td><td>Nest Biotechnology Co.</td><td>0412B</td><td></td></tr><tr><td>מחטים חד פעמיות 25 גרם x 5/8 אינץ'</td> <td>אקסל אינטרנשיונל</td><td>26403</td><td></td></tr><tr><td>פרפורמלדהיד (PFA)</td><td>סיגמא-אולדריץ'&nbsp;</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast פלוס&nbsp;</td><td>McCormik Scientific</td><td>39502004</td><td>פרפין להטמעת רקמות</td></tr><tr><td>קלטות ביופסיה של שנדון II עם מכסה מחובר</td> קלטות <td>1001097 תרמו מדעיות</td><td></td><td>לעיבוד רקמות</td></tr><tr><td>להבי מיקרוטום בפרופיל גבוה</td><td>Accu-Edge</td><td>4685</td><td>להבי נירוסטה חד פעמיים</td></tr><tr><td>תבניות הטמעת רקמות פלסטיק חד פעמיות מתקלפות</td> בדרך <td>Polysciences Inc.</td><td>18986</td><td>קטום, 22 מ"מ מרובע עליון מחודד ל-12 מ"מ תחתון</td></tr><tr><td>Superfrost Plus מיקרוסקופ שקופיות</td><td>פישרברנד</td><td>12-550-15</td><td>75 מ"מ x 25 מ"מ x 1 מ"מ</td></tr><tr><td>קסילן</td><td>פישר כימיקל</td><td>X5P1GAL&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>200 הוכחה אתנול</td><td>Decon Labs, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>רפידות גזה Certi-Pad&nbsp;</td><td>בטיחות מוסמכת Mfg, Inc</td><td>231-210</td><td>3 אינץ' x 3. רפידות גזה סטריליות ללא לטקס</td></tr><tr><td>ערכת M.O.M&nbsp;</td><td>מעבדות וקטור</td><td>BMK-2202</td><td>לאיתור נוגדנים ראשוניים של עכבר על רקמת עכבר</td></tr><tr><td>KimWipes</td><td></td><td>Kimtech 34155</td><td>מגבונים 4.4 אינץ' x 8.4 אינץ'</td></tr><tr><td>Super PAP PEN</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>00-8899</td><td>עט לציור על שקופיות</td></tr><tr><td>כיסוי מיקרוסקופ זכוכית&nbsp;</td><td>Fisherbrand</td><td>12-544-D</td><td>גודל: 22 x 50 x 1.5</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542&nbsp;</td><td>(מוכן בציר של 20 מ"ג/מ"ל)</td></tr><tr><td>ProLong Gold antifade reagent</td><td>בדיקות מולקולריות</td><td>P36930</td><td>סוכן הרכבה עבור אימונופלואורסצנציה</td></tr><tr><td>X-cite סדרת 120Q</td><td>Lumen Dynamics</td><td></td><td>מקור אור</td></tr><tr><td>Coolsnap Myo</td><td>פוטומטריה</td><td></td><td>מצלמה</td></tr><tr><td>Optiphot-2&nbsp;</td><td>מיקרוטום מיקרוסקופ</td> <td>ניקון</td><td></td></tr> משקע רקמות <tr><td></td><td>אופטיות</td><td></td><td></td>אמריקאי</tr><tr><td></td><td>Leica</td><td>EG1150 H&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>מעבד רקמות&nbsp;</td><td>Leica</td><td>ASP300S</td><td></td></tr><tr><td>סרום עיזים רגיל</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>עכבר אנטי-TH</td><td>Millipore</td><td>MAB318</td><td>נוגדן ראשוני</td></tr><tr><td>ארנב אנטי-SF1</td><td>Ab קבוצת פרוטאינטק (PTGlabs)</td><td>&nbsp; בהתאמה אישית</td><td>נוגדן ראשוני</td></tr><tr><td>Alexa-488 עכבר IgG&nbsp; עז מוגדלת</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-545-003&nbsp;</td><td>נוגדן משני</td></tr><tr><td>Dylight-549 ארנב IgG עז שגדלה</td><td>ג'קסון ImmunoResearch</td><td>111-505-003</td><td>נוגדן משני</td></tr><tr><td>חומצה ציטראט נטולת מים</td><td>פישר כימיקל</td><td>A940-500</td><td></td></tr><tr><td>NIS-יסודות מחקר בסיסי&nbsp;</td><td>תוכנת Nikon</td><td></td><td>להדמיה</td></tr></tbody></table>

בידוד, קיבוע, immunofluorescence הדמיה של העכבר בלוטת יותרת הכליה

Isolation, Fixation, and Immunofluorescence Imaging of Mouse Adrenal Glands

Immunofluorescence היא טכניקה ומבוססת על גילוי של אנטיגנים ברקמות עם העבודה של נוגדנים fluorochrome מצומדת ויש קשת רחבה של יישומים. זיהוי של אנטיגנים מאפשרת אפיון וזיהוי של סוגי תאים מרובים. ממוקם מעל הכליות, כמוס על ידי שכבה של תאים mesenchymal, בלוטת יותרת הכליה הוא איבר האנדוקרינית הולחן על ידי שני ברקמות שונות עם מקורם embryological שונים, mesonephric ביניים, נגזר והמזודרם בקליפת המוח החיצונית, את עצבי קרסט-derived לשד פנימית. קליפת יותרת הכליה מפרישה סטרואידים (קרי, mineralocorticoids, glucocorticoids, הורמוני המין), ואילו ליבת יותרת הכליה מייצרת catecholamines (קרי, אדרנלין, ונוראדרנלין). בעת ביצוע מחקר בלוטת יותרת הכליה, חשוב להבדיל בין תאים ייחודיים עם פונקציות שונות. כאן אנו מספקים פרוטוקול שפותח במעבדה שלנו המתאר סדרה של שלבים רציפים הנדרש להשגת immunofluorescence מכתים לאפיין את סוגי התאים של בלוטת יותרת הכליה. אנו מתמקדים תחילה הקרע של בלוטות יותרת הכליה העכבר, הסרת שומן periadrenal ואחריו את הקיבעון, עיבוד, פרפין הטבעה של הרקמה מיקרוסקופית. לאחר מכן נתאר חלוקתה של אבני רקמה עם מיקרוטום רוטרי. לבסוף, אנו מפרטים עבור צביעת immunofluorescent של בלוטת יותרת הכליה שרכשנו כדי למזער את איגוד שאינם ספציפיים נוגדנים והן autofluorescence על מנת להשיג אות אופטימלית פרוטוקול.

איור 1 מייצג תיאור סכמטי של פרוטוקול כל המתואר לעיל. בלוטת יותרת הכליה נקצרים מן העכברים, רקמת שומן הסמוכה הסרת תחת מיקרוסקופ ויבתר ו יותרת הכליה ואז המתוקנים ב- 4% מחברים. לאחר שלב זה, האנדרנלין, המוטבעות פרפין, מעובדים למחלקה עם מיקרוטום לחתוך את האיבר פרוסות דק אשר מופקדים על שקופיות מיקרוסקופ. לאחר הייבוש של המקטעים, immunofluorescence מבוצעת, הסעיפים הם צילמו את המיקרוסקופ.
הסרת שומן סמוכים (<s...

כאן אנו מציגים שיטה כדי לבודד את בלוטת יותרת הכליה של עכברים, לתקן את הרקמות, סעיף אותם ולבצע immunofluorescence מכתים.

בידוד, קיבוע, Immunofluorescence הדמיה של העכבר בלוטת יותרת הכליה

Immunofluorescence is a well-established technique for detection of antigens in tissues with the employment of fluorochrome-conjugated antibodies and has ...

Immunofluorescence היא שיטה בסיסית שיכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בשדה יותרת הכליה על זום יותרת הכליה, זהות התא ותפקוד. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת מחקר של חלבונים מרובים תוך שמירה על המורפולוגיה של רקמת יותרת הכליה. כדי להסיר את בלוטת יותרת הכליה מורין, לחתוך סביב רקמת השומן שמסביב למקם את הבלוטה באר אחת של צלחת 24-multiwell המכיל PBS טרי על קרח.מעבירים את הבלוטה לצלחת פטרי או תמיכה בזכוכית תחת מיקרוסקופ חיטוי ולהשתמש בשתי 25 מחטי מד כדי להסיר את רקמת השומן הסמוכה. כאשר כל השומן הוסר, לתקן את הרקמה ב 4% paraformaldehyde בארבע מעלות צלזיוס עם נדנדה במשך שעתיים. בסוף הדגירה, לשטוף את הבלוטה עם שלוש 15 דקות שוטף בארבע מעלות צלזיוס באחד עד שני מיליליטר של PBS טרי לכל לשטוף.לאחר הכביסה האחרונה, לייבש את הבלוטה בשתי טבילות אתנול רציפות בארבע מעלות צלזיוס עם נדנדה במשך שעתיים לכל דגירה. כדי להכין את רקמת יותרת הכליה לעיבוד, לעטוף את הבלוטה גזה ולהקיף את יותרת הכליה בקלטת הטבעת רקמות. לאחר מכן, מניחים את הקלטת בצנצנת מלאה באתנול של 70% לאחסון של ארבע מעלות צלזיוס עד לעיבוד.כדי לעבד את הרקמה, הכנס את הקלטת למעבד הרקמות לעיבוד כפי שצוין בטבלה. בסוף התוכנית, להעביר את הקלטת לתחנת הטבעה מלא פרפין מומס 65 מעלות ולהשתמש זוג מדפים כדי לפתור את הגזה. מעבירים בעדינות את יותרת הכליה בתנוחה המתאימה במרכז בסיס התבנית המוטבעת ויוצקים את הפרפין המומס על הבלוטה.לאחר מכן, בזהירות להעביר את התבנית הטבעה למגש קירור כדי להקל על התקשות של פרפין. לפני חתך על ידי microtome סיבובי, תווית סדרה של שקופיות מיקרוסקופ ולהניח את השקופיות על 37 מעלות צלזיוס להחליק חם יותר. מחלקים כ-450 מיקרוליטרים של מים טהורים במיוחד על כל מגלשה ומגדירים את עובי החיתוך של המיקרוטום לחמישה מיקרומטרים.לטעון את הרקמה המוטבעת על בלוק החיתוך ולהוריד את בלוק הפרפין עד המדגם הוא ברמת הפנים עם קצה להב microtome. סיבוב גלגל היד עם קצב קבוע, לבצע גיזום ראשוני כדי להסיר את הפרפין ולחשוף את רקמת יותרת הכליה. לאחר מכן, לרכוש חמישה מקטעי מיקרומטר עד סוף בלוטת יותרת הכליה באמצעות מדפים להעביר כל קטע לתוך טיפת המים על אחת השקופיות שכותרתו מראש כפי שהוא נאסף.לאחר אישור נוכחות של רקמה בחלקים על ידי מיקרוסקופיה, לייבש את המגלשות על הצלחת החמה במשך כשעתיים ואופים אותם לפחות לילה על מגש שקופית ב 37 מעלות צלזיוס עד לא יותר מים גלויים. לאחר הייבוש, אחסן את השקופיות בתיבת שקופיות בטמפרטורת החדר. לאחזור אנטיגן immunofluorescence, דה-פרפיניזציה של השקופיות עם שתי חמש דקות 100% קסילן טבילה, ואחריו התייבשות בסדרת אתנול יורד טבילה במים.לאחר טבילת המים, מעבירים את המגלשות למחזיק מגלשת מתכת וממקמים את המחזיק במזנון של ציטראט טוחן 0.01 רותח על צלחת חמה במשך 10 דקות. בסוף הדגירה, להסיר את ה מהצלחת החמה ולתת לו להתקרר במשך 20 דקות, דואג כי כל קטעי יותרת הכליה עדיין מכוסים חיץ. כאשר המזווה מקורר, מעבירים את המגלשות לצנצנת קופלין לשלושה שטיפות של 10 דקות ב- PBS טרי עם נדנדה עדינה.לאחר הכביסה האחרונה, בזהירות לנגב את פני השטח של כל שקופית מבלי לפגוע בקטעי הרקמה ולהשתמש סמן הידרופובי לעשות עיגול סביב כל קטע. מניחים את השקופיות בתא לח ומוסיפים במהירות לפחות 50 מיקרוליטרים של פתרון חסימה לכל קטע עבור דגירה של שעה בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה החוסמת, לשטוף את המגלשות שלוש פעמים PBS טרי במשך חמש דקות לשטוף עם נדנדה ולהחזיר שקופיות לתא.לאחר מכן, מוסיפים את קוקטייל הנוגדנים העיקרי של עניין לכל סעיף עבור דגירה לילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר, לשטוף את הדגימות עם שלוש 15 דקות שטיפה PBS טרי לכל לשטוף ולתייג את השקופיות עם פתרון נוגדנים משני המתאים במשך שעה אחת מוגן מפני אור. בסוף הדגירה, לשטוף את הדגימות עם שלוש 15 דקות שטיפה על נדנדה מוגנת מפני אור, תיוג הגרעינים של החלקים עם DAPI במשך שבע דקות בטמפרטורת החדר מוגן מפני אור לאחר לשטוף האחרון.לאחר שלוש חמש דקות PBS שוטף עם נדנדה, להוסיף 60 microliters של חומר הרכבה מתאים immunofluorescence לאורך פני השטח של כיסוי אחת לכל מדגם בקלילות ללחוץ על כל קטע רקמת החלקה למטה על כיסוי, דואג למנוע בועות. לאחר מכן, מניחים כל שקופית שטוחה במיכל כהה לריפוי בטמפרטורת החדר לפחות 24 שעות לפני ההדמיה. במהלך תהליך הסרת השומן, זה קריטי לא לתת בלוטת יותרת הכליה להתייבש כמו התייבשות יכולה להזיק למבנה הרקמה.לאחר הסרה מוצלחת של רקמת השומן שמסביב, בלוטת יותרת הכליה צריך להיות מזוהה בקלות ללא שומן גלוי נוסף. Immunostaining של מקטעי בלוטת יותרת הכליה כפי שהודגם מגלה גורם סטרואידים גרעיניים אחד מכתים של התאים adrenocortical, טירוסין הידרוקסילאז כתמים של תאים medullary, כתם DAPI של הגרעינים של תאים שאינם סטרואידים של הקפסולה החיצונית, וכתמים במשותף עם תאים אדנוקורטיים ו Medullary. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור כי בלוטת יותרת הכליה של העכבר הם קטנים, כי עמדותיהם משתנות במקצת מה שהופך את הזיהוי שלהם קשה.לכן, חיוני לקבל תצוגה ברורה של האזור במהלך הניתוח. הליכים אלה הם טכניקות בסיסיות לחקר בלוטת יותרת הכליה ב vivo. בעקבות אלה, ניתן לבצע שיטות נוספות של כשל חיסוני כדי לענות על צרכים מדעיים ספציפיים.לאחר התפתחותו, כשל חיסוני סלל את הדרך לחוקרים בתחומי המדע הביו-רפואי לחקור את ביטוי החלבון situ, כלי שימושי בתחומים ובתחומים רבים.

isolation-fixation-immunofluorescence-imaging-mouse-adrenal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

לשד הכליה תרבות chromaffin מערכות סלולריים הם מאוד שימושי לחקר צימוד עירור הפרשת ב-בקביעת חוץ גופית. פרוטוקול זה ממחיש את שיטת לנתח את יותרת הכליה ואז לבודד את האזור מדולרי ידי הפשטת משם קליפת יותרת הכליה. מערכת העיכול של לשד לתוך אחד התאים chromaffin מודגם אז.

עכבר בידוד הכליה Chromaffin Cell

סרטון זה מדגים בדיקה לביצוע multiplex immunostaining באמצעות נוגדנים ראשוניים מאותו מין מארח. בשיטה זו, מקטע רקמת יותרת הכליה עובר תהליך חיסוני דו-שלבי. בתחילה, החלק מוכתם בנוגדנים ספציפיים לסמנים בקליפת המוח, ולאחר מכן מפשיטים את הנוגדן הכבול ושומרים עם נוגדנים ספציפיים לסמנים במדולה.

שיטת Multiplex Immunostaining באמצעות נוגדנים ראשוניים מאותו מין פונדקאי

ההדמיה intravital ברזולוציה גבוהה עם ניגודיות משופרת עד 120 מיקרומטר עומק בבלוטות הלימפה של עכברים בוגרים מושגת על ידי מרחבית ויסות דפוס העירור של מיקרוסקופ שני פוטונים רב המוקדים. ב100 עומק מיקרומטר מדדנו החלטות 487 ננומטר (לרוחב) ו551 ננומטר (צירי), ובכך לעקוף את מגבלות פיזור ועקיפות.

מיקרוסקופית Intravital הפסים תאורה נפתר מאוד של מרכזי ז&#39;רמינל

לאחר אקסוציטוזיס, קרום הפלזמה המאוחה מאוחזר בתהליך המכונה אנדוציטוזיס. מנגנון זה מתקן שלפוחיות סינפטיות חדשות לסבב השחרור הבא. אירועים אנדוציטיים בודדים נלכדים ומנותחים באמצעות הקלטות הקיבול המחוברות לתאים בתאי כרומפין יותרת הכליה של העכבר.

שיטות למדידת קיבול מצורף סלולארי בתא עכבר הכליה Chromaffin

פרוטוקול immunofluorescence העקיף המתואר במאמר זה מאפשר זיהוי והלוקליזציה של חלבונים בבלוטת החלב עכבר. שיטה שלמה ניתן להכין דגימות בלוטת החלב, לבצע אימונוהיסטוכימיה, לתמונת סעיפי רקמות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי, ולשחזר תמונות.

Immunofluorescence עקיף על סעיפים קפואים של עכבר בלוטת החלב

אנו מציגים שיטה בידוד והתרבות של צינור העכבר Wolffian (WD). אנחנו גם מדגימים נוהל מפורט immunostaining הר שלם של WDS תרבותי / טרי מבודד עם נוגדנים מתויג fluorescently. יחד, טכניקות אלו מאפשרים את חקר התפתחות WD, התפתלות, והבחנה.

תרבות איברים שלמים הר Immunofluorescence מכתים של עכבר Wolffian צינוריות

אנו מציגים פרוטוקול כדי לנתח יותרת ולהכין יותרת המוח מקטעים הילתית מלפתח עכברים.

ניתוח והכנת פרוסה הילתית בפיתוח העכבר בלוטת יותרת המוח

מספר שיטות שונות הוקמו עבור חיסוני הקולנוע באמצעות נוגדנים עיקריים מאותו מין מארח. כאן, אנו מתארים את השימוש של מיקרוגל בתיווך נוגדן בנוכחות של fluorophore-tyramide כדי לחסום נוגדנים לחצות את הנוגדן במהלך כתמים חיסוני במגה-בניין על formalin-קבוע מוטבע האדרנל העכבר סעיפים.

המיקרוגל והפלואורופפור-טירמידה לשימוש בחומרים מדומים על העכבר באמצעות נוגדנים ראשוניים מאותו מין מארח

פרוטוקול זה מתאר טכניקת הדמיה קונפוקלית לזיהוי שלושה מצבי איחוי בתאי כרומפין של יותרת הכליה בקר. מצבי היתוך אלה כוללים 1) היתוך קרוב (המכונה גם נשיקה וריצה), הכוללים פתיחה וסגירה של נקבוביות היתוך, 2) היתוך שהייה, הכולל פתיחת נקבוביות היתוך ושמירה על הנקבוביות שנפתחו, ו-3) היתוך-כיווץ, הכולל התכווצות שלפוחית מתמזגת.

מיקרוסקופיה קונפוקלית למדידת שלושה מצבים של דינמיקת נקבוביות היתוך בתאי כרומפין של יותרת הכליה

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של אבות פיברו-אדיפוגניים של שרירי השלד והלב (FAPs) מעכבר קוצני (Acomys) באמצעות דיסוציאציה אנזימטית ומיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנציה. FAPs המתקבלים מפרוטוקול זה ניתן להרחיב ביעילות ולהבדיל למיופיברובלסטים ואדיפוציטים.

בידוד, הרחבה והבחנה של אב פיברו-אדיפוגני ממודל העכבר הקוצני

פותחה גישה איתנה וניתנת לשחזור להקמת תרביות ראשוניות דו-ממדיות של תאי גלומרולוזה וזונה פאסיקולטה מועשרים לקורטקס האדרנל של העכבר. מערכת זו שומרת על תכונות מולקולריות ותפקודיות מרכזיות של כל אזור, ומאפשרת חקירה ממוקדת של מסלולי איתות, ייצור הורמונים והתנהגות תאי אדרנל קורטיקס מחוץ לחיים.

הקמת תרבויות ראשוניות מועשרות אזורים מקורטקס אדרנל העכברים

למדו בידוד בלוטות יותרת הכליה בעכברים, קיבוע בפרפורמלדהיד 4% וצביעת immunofluorescence לחקר זיהוי תאים וזונציה שלדרנית תוך שמירה על מורפולוגיית הרקמה.

בידוד, קיבוע, Immunofluorescence הדמיה של העכבר בלוטת יותרת הכליה

גלה סרטונים נוספים