זיקה טיהור של מתחמי חלבון Translocon כלורופלסט בעזרת התג ברז
1 בנובמבר 2018
אנו כאן מציגים פרוטוקול מוכחת ונבדק ולטיהור כלורופלסט מתחמי ייבוא חלבון (TOC-טיק מרוכב) בעזרת הברז-התג. פרוטוקול זיקה-בידוד בשלב אחד פוטנציאלי ניתן להחיל על כל חלבון, ניתן להשתמש כדי לזהות אינטראקציה עם שותפים חדשים באמצעות ספקטרומטר מסה.
שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום כלורופלסט, למשל, הרכב מכונות ייבוא החלבון chloroplast. זה חיוני לירוק ופוטוסינתזה ומכאן לייצור מזון על פני כדור הארץ. המכונה המולקולרית מורכבת משני מתחמים נפרדים בחבר החיצוני והפנימי של הכלורופלסט הנקרא TOC ו- TIC, אך ההרכב אינו ידוע במלואו.
היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי טיהור של Arabidopsis TOC / טיק מורכבים ניתן להשיג בשיטת טיהור צעד אחד, TAP-TOC טיהור. זוהי שיטה ספציפית ויעילה. בדרך כלל, חוקרים חדשים בשיטה זו עשויים להיאבק כי הם לא מכירים את הבידוד של שברי קרום כלורופלסט, חומר ניקוי, מנוכרות, או טיהור זיקה.
לאחר הכנת הצמחים Arabidopsis, לטחון 10 גרם של שתילים בני שלושה שבועות בחנקן נוזלי, באמצעות מרגמה קרה ועלי עם חול. מוסיפים 20 מיליליטר של חיץ שחיקה קרה לרקמות הקרקע. מערבבים היטב ולתת את התערובת להפשיר על קרח.
לאחר מכן, להשרות שתי שכבות של חומר סינון מהיר עם חיץ שחיקה. סנן את ההומוג'ונט דרך שתי השכבות של חומר הסינון לתוך צינור צנטריפוגה חרוטי 50 מיליליטר. צנטריפוגה לסינון ב 1, 500 פעמים גרם בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ולהעביר את supernatant לצינור טרי, מקורר מראש 50 מיליליטר חרוט צנטריפוגה.
חזור על הצנטריפוגה פעם נוספת באותם תנאים. מעבירים את העל-טבעי לצינור אולטרהצנטריפוג קר של 38.50 מיליליטר ומעבירים אותו ל-35 מיליליטר עם חיץ שחיקה קר. השתמש אולטרהצנטריפוגה כדי צנטריפוגה המדגם ב 100, 000 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס במשך שעה אחת.
באמצעות homogenizer טפלון זכוכית, תן שימוש חוזר את גלולה ירוקה חיץ שחיקה. צנטריפוגה ב 100, 000 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס במשך שעה אחת ולהשליך את העל טבעי. השתמש homogenizer טפלון זכוכית כדי לנצל מחדש את גלולה ירוקה ב 18.75 מיליליטר של חיץ אחד x שחיקה.
לאחר מכן הוסיפו עוד 9.375 מיליליטר של מאגר שחיקה x אחד. הוסף 9.375 מיליליטר של פתרון פיוזביליזציה x ארבע כדי להביא את הנפח הסופי ל 37.5 מיליליטר דגירה על שייקר מסתובב בארבע מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. לאחר מכן, השתמש אולטרהצנטריפוגה כדי צנטריפוגה המדגם ב 100, 000 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס במשך שעה אחת.
מעבירים את העל-טבעי המכיל את הממברנות המבודדות לצינור צנטריפוגה חרוטי טרי של 50 מיליליטר. לאחר הכנת שרף אגרוז IGG, להעביר את שרף IGG agarose שנשטף בעבר לצינור חרוט 50 מיליליטר המכיל את 37.5 מיליליטר של ממברנות מנוכרות. דגירה במשך הלילה על שייקר מסתובב בארבע מעלות צלזיוס.
למחרת, מעים IGG agarose שן ב 100 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. השתמש בפיגט כדי להסיר את העל-טבעי. האם שן האגה של IGG היה ב-37.5 מיליליטר של חיץ A ודגירה על שייקר מסתובב בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.
המשך להססן שטיפת שהף כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, להעביר את שף Agarose IGG לעמודת ספין 500 microliter עם מסנן 35 מיקרון. לשטוף את חרוזים פעמיים עם 300 microliters של מאגר אלוטיון TEV לשיווי משקל.
לאחר מכן, להוסיף 300 microliters של מאגר אלוטיון TEV מכילים 10 microliters של פרוטאז TEV. הדגירה את עמוד ספין עם חרוזים תרמומיקסר ב 16 מעלות צלזיוס ו 350 סל"ד במשך שעתיים. לאחר מכן, פתח את עמוד הסיבוב והצב אותו בצינור חדש, נקי, 1.5 מיליליטר.
לסובב את הצינור הזה ב 100 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות כדי לאסוף את eluate. במחקר זה TAP מתויג כלורופלסט מעטפת חלבון קומפלקס מצמחים מהו מהודרים A.thaliana מטוהרים. ניתוח Immunoblot מאשר כי לבודד TAP-TOC159 אינטראקציה עם TOC75 ו TOC33 של קומפלקס TOC.
קינאז הממברנה החיצוני כלורופלסט, KOC1, אשר ידוע phosphorylate TOC159 הוא גם מבודד במשותף. נוכחותו של TIC110 מגלה כי מתחם TAP-TOC159 המבודד מכיל גם את מרכיבי מתחם TIC. הנוגדן FBN1A לא זיהה את קומפלקס TAP-TOC159, מה שמצביע על היעדר זיהומים.
בשליטה השלילית, חלבון NTAP immunoprecipitated לא לבודד במשותף עם כל TOC, טיק חלבונים ומאשר את הספציפיות של הטיהור TAP-TOC159. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי ייבוא חלבון כלורופלסט, ניתן ליישם אותה על כל קומפלקס אחר במערכת בקבוקי התאליאנה Arabidopsis. בעקבות הליך זה, ניתן ליישם שיטות אחרות כגון סופג מערבי או ספקטרומטריית מסה כדי להדגים את נוכחותם של רכיבים ידועים או כדי לזהות רכיבים חדשים של מתחמי TOC ו- TIC.
טכניקה זו סללה את הדרך למחקר בתחום ייבוא החלבון כלורופלסט כדי לחקור את הפונקציה של רכיבים חדשים של מתחמי TOC ו- TIC.
סקירה
מאמר זה מציג פרוטוקול חד-שלבי של בידוד אפיניות לטיהור מתחמי ייבוא חלבון כלורופלסט (מתחם TOC-TIC) באמצעות תגית TAP. שיטה זו יכולה לזהות שותפים חדשים לאינטראקציה באמצעות ספקטרומטריית מסה והיא חיונית להבנת תפקוד הכלורופלסט.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- ביולוגיה של הכלורופלסט
- טיהור חלבון
- ספקטרומטריית מסה
רקע
- מנגנון ייבוא החלבון הכלורופלסטי חיוני לפוטוסינתזה וייצור מזון.
- מתחמי TOC ו-TIC מעורבים בייבוא חלבון אך ההרכב המלא שלהם אינו מובן היטב.
- שיטות עכשוויות לבידוד מתחמים אלו יכולות להיות מורכבות ומייגעות.
- מחקר זה נועד לפשט את תהליך הטיהור.
מטרת המחקר
- לפתח פרוטוקול פשוט לטיהור מתחם TOC-TIC.
- להקל על זיהוי רכיבים חדשים המעורבים בייבוא חלבון הכלורופלסט.
- לספק שיטה שניתן ליישמה על מתחמי חלבון אחרים ב-Arabidopsis thaliana.
שיטות בשימוש
- הכנת שתילי Arabidopsis וריסוק בחנקן נוזלי.
- צנטריפוגה רציפה לבידוד ממברנות הכלורופלסט.
- טיהור אפיניות באמצעות שרף אגרוז IGG.
- ניתוח אימונובלוט כדי לאשר את נוכחותם של חלבונים ספציפיים.
תוצאות עיקריות
- מתחם TAP-TOC159 טוהר בהצלחה והוכח שהוא מתקשר עם TOC75 ו-TOC33.
- בידוד משותף של TIC110 הצביע על נוכחותם של רכיבי TIC במתחם המטוהר.
- השיטה הדגימה ספציפיות, שכן בקרות שליליות לא הראו בידוד משותף עם חלבוני TOC ו-TIC.
- טכניקה זו מאפשרת מחקר נוסף של מנגנוני ייבוא חלבון הכלורופלסט.
מסקנות
- שיטת טיהור תגית TAP יעילה וספציפית לבידוד מתחמי חלבון הכלורופלסט.
- גישה זו יכולה לשפר את המחקר במערכת ייבוא החלבון הכלורופלסטית.
- מחקרים עתידיים יכולים לנצל שיטה זו לזיהוי רכיבים חדשים של מתחמי TOC ו-TIC.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Understanding the composition of chloroplast protein import complexes is critical for advancing plant biotechnology and improving crop yield. The TAP-TOC159 purification method enables efficient isolation of membrane protein complexes, supporting target validation and mechanistic de-risking in chloroplast-related research. This approach enhances predictive confidence in identifying novel components of the TOC and TIC complexes, with implications for synthetic biology and metabolic engineering in biopharma-relevant plant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of the chloroplast protein import machinery by isolating TOC159-containing complexes for functional analysis.
- Operational Value: Provides a specific and efficient one-step purification strategy that reduces experimental variability in complex isolation.
- Strategic Value: Supports hypothesis-driven target validation by confirming interactions with known components like TOC75, TOC33, TIC110, and KOC1.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates purified complexes suitable for downstream applications such as mass spectrometry to identify novel interactors.
- Operational Value: Produces reproducible isolations amenable to standardized workflows for complex profiling.
- Strategic Value: Facilitates assay readiness by delivering enriched complexes that improve detection sensitivity in screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains complex integrity through gentle TEV protease elution, preserving native interactions for functional follow-up.
- Operational Value: Enables continuity from discovery to validation by providing material suitable for immunoblot and mass spectrometry analysis.
- Strategic Value: Supports risk-adjusted advancement by confirming specificity through negative controls, reducing false-positive risks.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery biology phase, enabling isolation of native complexes to inform target identification and pathway elucidation before progressing to functional assays or engineering efforts.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating TOC-TIC complexes to study protein import mechanisms.
- Screening: Delivers solubilized membrane complexes that are amenable to affinity capture and downstream analytical readouts.
- Analytics: Enables quantitative and qualitative analysis via immunoblot and mass spectrometry to compare complex composition across conditions.
- Translational Research: Connects discovery to validation by providing biochemically defined complexes that reflect native chloroplast membrane environments.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable affinity purification platform applicable to other membrane-bound complexes in Arabidopsis thaliana.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by enabling specific isolation of TOC159-associated complexes.
- Operational Value: Improves reproducibility through standardized affinity purification and gentle elution conditions.
- Strategic Value: Enhances decision-making by providing reliable data on complex composition to guide target prioritization.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted investment in chloroplast-targeted traits by de-risking target identification through specific complex isolation.
Implementation Considerations
- Expertise in chloroplast membrane isolation and detergent-based solubilization is required.
- Access to ultracentrifugation equipment and affinity resins (IgG agarose) is necessary for membrane preparation and complex capture.
- Standardization of washing and elution conditions across labs is critical to ensure reproducibility of complex isolation.
- Adaptation to other model systems may require optimization of tag accessibility and complex stability.
- Practical limitations include the need for transgenic lines expressing TAP-tagged constructs and potential tag interference with native function.
