Name: מדידת אינטראקציות של חלבונים הכדוריים, Filamentous על ידי תהודה מגנטית גרעינית ספקטרוסקופיה (NMR) Microscale Thermophoresis (MST) (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-02T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: למד איך לייצר ולטהר חלבונים מסומני איזוטופים יציבים לניתוח אינטראקציות חלבון-חלבון באמצעות ספקטרוסקופיית NMR ו-MicroScale Thermophoresis. הפרוטוקול מספק שיטה מהירה ויעילה לחקר דינמיקת חלבונים ברמת האטום.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

פרויקט זה בתמיכתם NSERC RGPIN-2018-04994, חדשנות תוכנית הקמפוס אלברטה (RCP-12-002 C), מכון מחקר פריון אלברטה / פתרונות ביו מחדשת של אלברטה (201600018), זכה להיות המפתח להפיל, הגנום קנדה, קנדה הרישמי חדשנות מענקים מרכז חדשנות מטבולומיקס ה (TMIC), NANUC.

<ol><li>Vinogradova, O., Qin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMR+as+a+unique+tool+in+assessment+and+complex+determination+of+weak+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Topics+in+Current+Chemistry%22%5BJournal%5D)">NMR as a unique tool in assessment and complex determination of weak protein-protein interactions.</a> Topics in Current Chemistry. 326, 35-45 (2012).</li>
<li>McKercher, M. A., Wuttke, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMR+Chemical+Shift+Mapping+of+SH2+Peptide+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">NMR Chemical Shift Mapping of SH2 Peptide Interactions.</a> Methods in Molecular Biology. 1555, Clifton, N.J. 269-290 (2017).</li>
<li>Al-Jassar, C., Bikker, H., Overduin, M., Chidgey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+Basis+of+Desmosome-Targeted+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanistic Basis of Desmosome-Targeted Diseases.</a> Journal of Molecular Biology. 425 (21), 4006-4022 (2013).</li>
<li>Fogl, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+intermediate+filament+recognition+by+plakin+repeat+domains+revealed+by+envoplakin+targeting+of+vimentin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Mechanism of intermediate filament recognition by plakin repeat domains revealed by envoplakin targeting of vimentin.</a> Nature Communications. 7, (2016).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22The+Protein+Protocols+Handbook%22">The Protein Protocols Handbook</a>. Walker, J. M. , 2nd ed, Humana Press. (2002).</li>
<li>Wishart, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((1H%2C+13C+and+15N+chemical+shift+referencing+in+biomolecular+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+NMR%22%5BJournal%5D)">1H, 13C and 15N chemical shift referencing in biomolecular NMR.</a> J. Biomol. NMR. 6, 135-140 (1995).</li>
<li>Casali, N. Escherichia coli Host Strains. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCasali%2C+N+%22E.+coli+Plasmid+Vectors%22">E. coli Plasmid Vectors</a>. , Humana Press. 27-48 (2003).</li>
<li>Ericsson, U. B., Hallberg, B. M., DeTitta, G. T., Dekker, N., Nordlund, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermofluor-based+high-throughput+stability+optimization+of+proteins+for+structural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies.</a> Analytical Biochemistry. 357 (2), 289-298 (2006).</li>
<li>Kozak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+protein+samples+for+NMR+using+thermal+shift+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Nmr%22%5BJournal%5D)">Optimization of protein samples for NMR using thermal shift assays.</a> Journal of Biomolecular Nmr. 64, 281-289 (2016).</li>
<li>Burgess, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brief+practical+review+of+size+exclusion+chromatography%3A+Rules+of+thumb%2C+limitations%2C+and+troubleshooting%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">A brief practical review of size exclusion chromatography: Rules of thumb, limitations, and troubleshooting.</a> Protein Expression and Purification. , In Press (2018).</li>
<li>Kunji, E. R. S., Harding, M., Butler, P. J. G., Akamine, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+molecular+mass+and+dimensions+of+membrane+proteins+by+size+exclusion+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Determination of the molecular mass and dimensions of membrane proteins by size exclusion chromatography.</a> Methods. 46 (2), 62-72 (2008).</li>
<li>Stetefeld, J., McKenna, S. A., Patel, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+light+scattering%3A+a+practical+guide+and+applications+in+biomedical+sciences%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Dynamic light scattering: a practical guide and applications in biomedical sciences.</a> Biophysical Reviews. 8 (4), 409-427 (2016).</li>
<li>Patel, T. R., Winzor, D. J., Scott, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+ultracentrifugation%3A+A+versatile+tool+for+the+characterisation+of+macromolecular+complexes+in+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analytical ultracentrifugation: A versatile tool for the characterisation of macromolecular complexes in solution.</a> Methods. 95, 55-61 (2016).</li>
<li>Pearson, J. Z., et al. Chapter One - Next-Generation AUC Adds a Spectral Dimension: Development of Multiwavelength Detectors for the Analytical Ultracentrifuge. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0076687915003936">Methods in Enzymology</a>. Cole, J. L. 562, Academic Press. 1-26 (2015).</li>
<li>Gorbet, G. E., Pearson, J. Z., Demeler, A. K., Cölfen, H., Demeler, B. Chapter Two - Next-Generation AUC: Analysis of Multiwavelength Analytical Ultracentrifugation Data. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0076687915002980">Methods in Enzymology</a>. Cole, J. L. 562, Academic Press. 27-47 (2015).</li>
<li>Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-binding+assays+in+biological+liquids+using+microscale+thermophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis.</a> Nature Communications. 1, 100(2010).</li>
<li>Jerabek-Willemsen, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022286014002750">MicroScale Thermophoresis: Interaction analysis and beyond.</a> Journal of Molecular Structure. 1077, 101-113 (2014).</li>
</ol>

המחברים לחשוף שאין ניגודי אינטרסים.

ה 2D 15הניסוי NMR נפתרה-N הוא אחד הנפוצה ביותר שיטות כדי להראות איך שתי מולקולות אינטראקציה. זוהי שיטת ביותר מידע עשיר המאפשר האותות של שני הצדדים להיות במעקב רציף לאורך כל ניסוי טיטור במצב פתרון. אמנם בדרך כלל איכותיים במקרה של מתחמים גדולים, השיטה יכול לשמש גם במקרים חיוביים כדי למדוד את הזיקות מחייב שבו ניתן לעקוב NMR אותות ב ספקטרה ברזולוציה גבוהה. איפה הקצאות בנוחות שניתן יהיה, כמו במקרה של חלבונים רבים תחת kDa 20 בגודל, האתרים מחייב יכול להיות ממופה גם. מבחני משלימים כגון MST מספקים מידע כמותי אודות אינטראקציות בתמיסה, דורשים פחות חלבון במדינות ללא תווית. השוואה של נתוני איגוד מוטציה הוא שימושי עבור מתן פקדים כדי להבטיח כי אינטראקציות שמעידים קו NMR הרחבת מקורי לא בחפצים שונים, לדוגמה, צבירת או צמיגות משתנה.
ביטוי חלבון
ייעול תהליך ביטוי מפחית את כמות ייצור החלבון אינטנסיביות העבודה. כחלק מתהליך אופטימיזציה זה כרוך זיהוי של זן המתאים של e. coli לביטוי חלבון רקומביננטי. זן ההעדפה תלויה רכיבי כולל מהות וקטור בשימוש והביע, ליתר דיוק, היציבות האולטימטיבי של הישות חלבון רקומביננטי7. הסיכון של השפלה של החלבון heterologous על ידי אנדוגני e. coli פרוטאזות יכול להיות מופחת על ידי שימוש פרוטאז לקוי e. coli כגון המתח BL21. עבור גנים המכילים codons נדירים, זן כגון RIPL BL21-CodonPlus (DE3) ייתכן המועדפת. זן זה משלב פרוטאז אופי לקוי המתח BL21 עם עותקים נוספים אנדוגני של codon נדיר tRNAs ארגינין, איזולאוצין, פרולין של לאוצין. לחלופין, ייתכן להימנע codons נדיר שעלולים לפגוע ביטוי על ידי הזמנת בונה אופטימיזציה codon ממקור מסחרי. זנים רבים של e. coli זמינים עבור ביטוי גנים רקומביננטי, אחד אופטימיזציה עבור circumvention של בעיה ספציפית במהלך ביטוי7. במקרה של מחקר זה, המתח לקוי פרוטאז סטנדרטי BL21(DE3) המיוצר נאותה כמויות חלבון מסיס טיהור עוקבות וניתוח.
חלבון טיהור
פרוטוקול טיהור עבור חלבון נתון לעתים קרובות ייחודיים במובן כי כל חלבון נשאר מסיס בתנאים שונים כגון טמפרטורה, ריכוז מלח או pH ויציבה. היעילות הכוללת של טיהור באמצעות כרומטוגרפיית זיקה רגיש גם לריכוז eluting מינים כגון imidazole על השלבים השונים בתהליך טיהור. בעבודה זו, היו התנאים מאגר קריטי עבור IMAC pH E-ההקלטה ריכוז imidazole עבור VimRod. PH של 7.5 היה נדרש להימנע משקעים של E-ההקלטה בעקבות • תנאי ראשוני מן העמודה ה-IMAC. ולטיהור IMAC VimRod, הגדלת ריכוז imidazole בין 30 ל-50 מ מ במהלך השלב שטיפת העמודה נמצאה שיש שיפור ניכר בטוהר השברים • תנאי הסופי. עבור השלב • תנאי, הגדלת הריכוז של imidazole מ- 250 עד 350 מ"מ גם נמצאה כדי לשפר את התשואה של נייר • הסופי תנאי. ניסיונות הראשונית elute חלבון באמצעות 250 מ מ imidazole הובילו לא שלם • תנאי של VimRod כפי רצועה imidazole 1 מ' סופית של העמודה (נתונים לא מוצג). הגדלת ריכוז imidazole עד 350 מ"מ עבור • תנאי היה מספיק כדי לשחזר את כל החלבון מאוגד לעמודה. S יכול לשרת מטרה כפולה, כי היא פועלת כמו צעד ליטוש לטיהור חלבון תוך כדי ביצוע בו זמנית מאגר exchange. מאגר exchange הוא שלב קריטי לניתוח איגוד עוקבות מאז שהיא מסירה את imidazole נהגה elute חלבון מתויג His6. הוא משמש גם כהזדמנות לשינוי תנאים כגון ריכוז מלח או pH, אשר עשוי להשפיע את היעילות של טכניקות במורד הזרם או מבחני מסוימים. חלבון shift תרמי (נק) יכול לשמש כדי לזהות מאגרים אופטימלית עבור מבחני במורד הזרם, במיוחד עבור אלה הזקוקים חלבון יציב עבור ממושכות של זמן בטמפרטורת החדר8,9.
מחייב ניתוח
חלבון זה הטרי הוא קריטי עבור מבחני הכריכה מדויק, למרות חלבונים קפואים יכול לשמש גם כל עוד התוצאות מושווים. Filamentous חלבונים כגון vimentin multimerize אופנה תלויים מלח ו- pH, ואת ומכאן הפתרון תנאי צריך להיות מותאם ובין המדינה oligomeric מוערך על ידי שיטה כגון שניה10,11, דינמי פיזור אור 12 או ultracentrifugation אנליטית13,14,15. NMR ספקטרוסקופיה מתאימה למדידת ליגנד אינטראקציות של חלבונים קטנים ברזולוציה אטומית. עם זאת, כאשר חלבון אינטראקציה עם מולקולה גדולה נופלת לאט מתפתח, התוצאה היא איבוד אותות, אשר יכול לאשר מחייב למרות שזה לא בהכרח מאפשר מיפוי של איגוד אתרים, אשר גם ידרוש לפחות הקצאה של עמוד השדרה מגנטיים. בתרחיש זה, ניסויים NMR אינן מאפשרות זיהוי של אתר אינטראקציה. ומכאן האתר ביים מוטגנזה מכוונת מוחל כדי לזהות את שאריות הקריטי הדרוש עבור האיגוד. מוטציות כאלה ולכן לא מציגים אובדן אות. פרוטוקול זה, טופס מוטציה עם החלפה במיקום 1914 שומרת על עוצמות שיא בנוכחות של VimRod, ולכן מאשרת שיבוש האינטראקציה של E-ההקלטה, VimRod. הקצאה של מגנטיים עמוד השדרה ואת sidechain יוסיף ערך לגישה זו, במיוחד כאשר המבנה E-ההקלטה חינם נפתרה על ידי קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן4. יישומים עתידיים של NMR כוללים אפיון של אינטראקציות מורכבות בין מולקולות גדולות יותר, יהנה אולטרה-גבוהה שדה מגנטים ושימוש של קבוצות הנצפה אחרות כגון 13התווית על-ידי C trifluoro קבוצות מתיל ככתבים.
MST יש מספר יתרונות לימוד מחייב אינטראקציות16. השותפים האיגוד הינם חינם בפתרון לא קיבוע. ניתוח של האיכות של הדגימות בנוי לתוך התוכנה עם בקרת איכות דיווח של מצבור, ספיחה נימים או תיוג פלורסנט לא מספיקות של מולקולת המטרה. כמויות קטנות של היעד משמשים בדרך כלל, הריכוז של המטרה שכותרתו היא בדרך כלל בין 20-50 ננומטר ב 10-20 μL נפח/תגובה. פרוטוקול זה משתמש אחסון קטן מאוד התגובה (10 μL) על מנת למקסם את הריכוז של ליגנד זה ניתן להשיג את titrations המאפשר אינטראקציות איגוד חלש לאפיין. זה מצריך מדויק pipetting וטיפול הננקטים על-מנת להימנע מהחדרה בועות ומתמזגים עדיין ביסודיות. ערבוב נאותה היא קריטית עבור מדידות קרינה פלואורסצנטית מדויק, עקבית לאורך סדרת דילולים טורי. כמות Tween-20 בניסויים MST צומצם מ תקן 0.05-0.015% כדי להוריד את הנטייה ליצור בועות ולשפר את ערבוב.
הצבע האדום-טריס-נ מספק דרך מהירה, קלה ונוחה fluorescently תווית כל חלבון יש את התג. תיוג יושלם ביעילות בתוך 30 דקות בלבד, והוא מאוד הדוקה כך הליך ההסרה אין צבע הוא הכרחי. אין לערוך שינויים שמתבצעים שאריות חומצה אמינית החלבון עלולה לשנות את מאפייני האיגוד ליגנד. אזהרה היא שיש רק החלבון להיות מתויגת תג His6. זה דרש את המחשוף של התג החלבון ליגנד, E-ההקלטה, הסרת התג ואת uncleaved E-ההקלטה עם שלב שני של העמודה ה-IMAC. במידת האפשר, החלבון ליגנד צריך להיות מוכן ללא שימוש שלו תג. לחלופין, חלבונים עשוי להיות covalently מסומן באמצעות fluorophore דרך amine צימוד ליזין שאריות או תיול צימוד על שאריות ציסטאין. עם זאת, יש לנקוט בעת שימוש במערכות כאלה מאז קוולנטיות החזקה של fluorophore עשוי להשפיע על אינטראקציות אלקטרוסטטית או קוטבי מחייב הסתמכות על שאריות ליזין או ציסטאין. כימות של איגוד הזיקה בין VimRod לבין E-ההקלטה מאת MST היה רגיש מהרגיל מלח בריכוז. בעיה זו הייתה חמאני בתחילה dialyzing היעד והן ליגנד אצווה באותו מאגר וזמינותו. בכל זאת, לא יכולה להיות מושגת הרוויה של העקומה איגוד MST בעת ביצוע וזמינותו MST בנוכחותו של 150 מ מ NaCl בשל מורכבות ההתנהגות של VimRod. נתונים אמין, מלאה הושג לאחר הריכוז של NaCl הונמך 10 מ"מ המאפשר חישוב מדויק של KD. לפיכך, אופטימיזציה זהירה של פתרון ותנאים השוואה עם מבחני משלימים מומלצים להשגת תוצאות חזקות. יתר על כן, MST עשוי לשמש כדי לכמת את התלות מלח לאינטראקציה נתון, לכמת את המאפיינים stoichiometric של אינטראקציות חלבון, קיפול חלבונים צג המכשיר לתוך קינטיקה של האנזים17.

אינטראקציות בין חלבונים לאפשר היווצרות של מכונות מולקולריות ליצור סדר בתוך התאים. האינטראקציות בודדים הם לעתים קרובות חלשים, אך בדרך כלל לתרום מתחמים multivalent יכול להיות שיתופיות מוסדר באופן דינמי. מבחני רגישות המספקים ברזולוציה אטומית ומידע כמותי על אינטראקציות מורכבות כאלה יש צורך להסיק מנגנונים ועיצוב התערבויות כגון סמים כמו מולקולות. NMR ספקטרוסקופיה היא שיטה יעילה להשגת מידע כזה על אינטראקציות חלבון, והוא גם משמש לסינון מהיר עבור ליגנדים כולל אלה לאגד חלש1. בין השיטות NMR ניתן לסווג אלו הם להתבונן חלבון או להתבונן ליגנד. כתב יד זה משתמש הגישה בו קשת של איזוטופ יציב הנקרא חלבון זה הוא קטן יחסית (בדרך כלל תחת 20 kDa) נרכשת, היא, טיטרציה של ליגנד ללא תווית. זה לאפשר את שאריות שכותרתו מעורב האינטראקציה למפות במקרים חיוביים. פעם אחת הצורות מורכבים, ישנם שינויים את סביבות כימיות של שאריות שמעצבת המתבטאים עצמם לשינויים כימיים המשמרת וצורה של אותות NMR שלהם. היקף שינויים כאלה עולה בקנה אחד עם מידת מעורבותם של ארגונים אלה על האינטראקציה. Shift כימי לפליטת (Csp) נמדד על ידי השוואת סדרה של ספקטרום NMR של החלבון שליקט את היעדרות ונוכחות של כמויות משתנות של ליגנד. ליגנדים גדול יותר או אינטראקציות מורכבות, ניתן למדוד בשינוי צורה שיא או עוצמת להסיק אינטראקציות.
הניסוי 2D הנפוץ ביותר המשמש לגילוי ליגנד אינטראקציות הוא ניסוי2מתאם (HSQC) קוונטית בודדת 15N-heteronuclear. פעולה זו דורשת חלבון אחד להיקרא בצורה אחידה עם 15N, אשר מושגת בדרך כלל על ידי הבעת אותם כגירסאות מתויג זיקה בתרבויות חיידקי e. coli גדלו ב 15מועשרת N מדיה. איגוד בולטת כאשר ספקטרום HSQC שנאספו במהלך טיטרציה הן נקודות המגע המוצגים, חשיפת השינויים שיא של תת-קבוצות של שאריות מעורב היווצרות מורכבות. האינטראקציה יכול להתרחש המשטר exchange מהיר בו האותות המדינה בחינם, רווי-ליגנד לקרוס לתוך אוכלוסיה אחת בממוצע שיא. לחילופין, במקרה של המרת איטי בין המדינות, שני אותות הם נצפו עם אינטגרלים המייצגים את הסכומים היחסיים. בזמן ניתוח lineshape NMR ניתן להשתמש כדי להעריך את הזיקות מחייב במקרים מסוימים, שיטות כמו MST גם הוכיחו נוח ולספק קרוס-אימות של אינטראקציות מקורית.
הדוגמה סיפק היא של שני חלבונים המצויים desmosomes. הם צמתי בין תא משטחים את שלד התא לתווך ולסיים multivalent אינטראקציות בין מכונות הדבקה תא חוטים ביניים כדי לשמור על שלמות העור, רקמות הלב, למרות של הטיית הכוחות. מחלות יכול לגרום כאשר desmosomal חלבונים כגון desmoplakin או vimentin הם בסכנה על ידי מוטציות או עצמיים, המוביל destabilization של צמתי תא-תא, ומכאן שהם של החשיבות הקריטית3. הבסיס המבני של ליגנד לכריכה על ידי חלבונים desmosomal יכול להיות מאופיין על ידי ספקטרוסקופיה NMR, בעוד ניתן לכמת את האינטראקציות מאת MST. שיטות בזאת שימשו כדי לאפיין את האינטראקציות בין קבוצות מחשבים אני חוזר plakin "(PRDs)", אשר לעתים קרובות נמצאים כערכות טנדם המציעים חריצים בסיסיים, vimentin, פילמנט ביניים המקיימת אינטראקציה דרך השטח חומצי המוצעים על ידי שלה לוליינית צרור4. מכלולים אלה נוצרות על קרום התא שבו הם עוגן עבור חוטים ביניים של שלד התא התא כדי desmosomes המחברים תאים סמוכים, ובכך יוצרים רשת של קשרים דבק קורן טישו.

<table><tbody><tr><td>Monolith NT.115, כולל תוכנת בקרה וניתוח</td><td>NanoTemper Technologies</td><td>MO-G008</td><td>מכשיר לתרמופורזה מיקרוסקאלית</td></tr><tr><td>ערכת תיוג His-Tag RED-Tris-NTA</td><td>NanoTemper Technologies</td><td>MO-L008</td><td>צבע RED-tris-NTA לנימים</td></tr><tr><td>סטנדרטיים</td> MST <td>NanoTemper Technologies</td><td>MO-K022</td><td>נימים עבור MST</td></tr><tr><td>HisTrap HP, 5 מ"ל</td><td>GE Healthcare</td><td>17524801</td><td>עמוד IMAC</td></tr><tr><td>HisPur Ni-NTA שרף, 100 מ"ל</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>88222</td><td>שרף IMAC</td></tr><tr><td>HiLoad 16/600 Superdex 75 pg</td><td>GE Healthcare</td><td>28989333</td><td>SEC עמוד TEV</td></tr><tr><td>פרוטאז</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>T4455</td><td>מחשוף של התג שלו מ-E-PRD</td></tr><tr><td>BL21(DE3) מוכשר E. coli</td><td>New England Biolabs</td><td>C2527H</td><td>תאים לביטוי חלבון</td></tr><tr><td>טבליות קוקטייל מעכב פרוטאז cOmplete</td> מעכבי פרוטאז <td>סיגמא אולדריץ'</td><td>11873580001</td> ללא EDTA <td>לטיהור חלבונים על ידי IMAC</td></tr><tr><td>TCEP, Tris(2-carboxyethyl)פוספין הידרוכלוריד</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4706</td><td>חומר מפחית לטיהור חלבונים</td></tr><tr><td>ריאגנטים (HEPES, NaCl וכו')</td> <td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>הכנת מדיה ומאגרים שונים</td></tr><tr><td>אמוניום כלוריד (15N, 99%)</td><td>מעבדות איזוטופ קיימברידג'</td><td>תיוג איזוטופים</td><td>NLM-467</td> עבור NMR</tr><tr><td>D2O, תחמוצת דאוטריום (D, 99.8%)</td><td>מעבדות איזוטופ קיימברידג'</td><td>DLM-2259</td><td>הכנת דגימת NMR DSS</td></tr><tr><td>, נתרן 2,2-דימתיל-2-סילפנטן-5-סולפונט-D6 (D,98%)</td><td>מעבדות איזוטופ קיימברידג'</td><td>DLM-8206</td><td>התייחסות עבור</td></tr><tr><td>NMR דיוק 5 מ"מ NMR צינורות, 7 אינץ' ארוך</td><td>SJM/Deuterotubes</td><td>BOROECO-5-7</td><td>NMR צינורות</td></tr><tr><td>NMR ספקטרומטר NMR (14.1 טסלה)</td><td>ברוקר</td><td></td><td>רכישת נתוני NMR</td></tr><tr><td>TCI 5 מ"מ z-PFG בדיקה קריוגנית</td><td>ברוקר</td><td></td><td>רכישת נתוני NMR</td></tr><tr><td>שם<</td><td>strong>חברה</td><td>מספר קטלוגי</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bruker TopSpin 4.0.1</td> עיבוד <td>Bruker</td><td></td><td>של נתוני NMR</td></tr><tr><td>MO. טכנולוגיות</td><td></td><td>Control NanoTemper</td><td>כלולות ב-Monlith NT.115</td></tr><tr><td>MO. ניתוח זיקה</td><td>NanoTemper טכנולוגיות כלולות</td><td></td><td>ב-Monlith NT.115</td></tr></tbody></table>

מדידת אינטראקציות של חלבונים הכדוריים, filamentous על ידי תהודה מגנטית גרעינית ספקטרוסקופיה (nmr) microscale thermophoresis (mst)

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST)

Filamentous חלבונים כגון vimentin מספקים הארגון בתוך תאים על-ידי מתן לפיגום מבניים עם אתרים אשר קושרים חלבונים המכילים plakin חוזר. כאן, עבור גילוי ומדידת אינטראקציות כגון פרוטוקול המתואר באמצעות המחשבים אני חוזר plakin הכדוריים של envoplakin והגליל הסליל של vimentin. זה מספק בסיס לקביעה אם חלבון נקשר vimentin (או חלבונים filamentous דומה), למדידת בזיקה של האינטראקציה. החלבון הכדוריים עניין עם 15N תוויות, טיטרציה עם vimentin החלבון בתמיסה. ספקטרום NMR מימדי נרכש כדי לזהות אינטראקציות על ידי התבוננות שינויים שיא צורה או משמרות כימי, להסבר תופעות של תנאים פתרון כולל רמות מלח, אשר משפיעים על מבנה רבעוני vimentin. אם החלבון עניין נקשר ליגנד את filamentous, האינטראקציה איגוד לכמת מאת MST באמצעות החלבונים מטוהרים. הגישה היא דרך פשוטה לקביעת אם חלבון עניין מאגד את הלהט, להערכת כיצד שינויים, כגון מוטציות או פתרון תנאים, משפיע על האינטראקציה.

תחום E-ההקלטה (שאריות 1822-2014 משובטים לתוך pProEX-HTC) של הגן האנושי envoplakin וקבוצת המחשבים VimRod (שאריות 99-249 משובטים לתוך pET21a) של האדם vimentin היו4 הביע בתגים His6, טהור. איור 6 ו- 7 איור להדגים את דרגות טוהר VimRod (18.8 kDa) ו E-ההקלטה (21.8 kDa) המתקבל בשיטה זו של חלבון טיהור. הסרת His6 תג מ הבונה E-ההקלטה הוא חיוני עבור הניסויים MST החלבון VimRod מסומן באמצעות צבע הכריכה תג His6, כל E-ההקלטה תמך תג His6 שלו עשויה להתחרות עבור איגוד של לצבוע. העמודה השנייה IMAC לאחר המחשוף של התג עם אס פרוטאז מסיר את פרוטאז אס, התג cleaved, כל uncleaved His6-E-ההקלטה נשארו. השלב האחרון ליטוש של הטיהור הוא גודל אי-הכללה של כרומטוגרפיה. למרות שני חלבונים בגודל דומה, VimRod elutes מן העמודה ב mL 51 ואילו הפסגה • תנאי E-ההקלטה ממורכזת-72 מ ל איפה יהיה צפוי של מונומר חלבון בסדר גודל כזה. גידול ניכר בגודל של VimRod סביר בשל מאפייניו כמו מוט ארוך filamentous בצורת חלבון כמו בצורה אנליטית ultracentrifuge הניסויים הראו כי VimRod היה monomeric4. תשואות נמוכות של חלבון מתקבלים מן התרבויות גדל M9 מאשר אלה של מרק עשיר עקב כמות נמוכה יותר של תאים שיופקו בתקשורת מינימלי. הגידול הראשוני של תרבויות starter גדול על ההכנות M9 ב TB מאפשר שיפור של התא התשואות תוך שמירה על היקף 15N תיוג הכרחי עבור הניסויים NMR.
15N -1H HSQCs נרכשו עבור פראי סוג ו R1914E מוטציה של E-ההקלטה ב נוכחות או היעדרות של VimRod (איור 8A-ד 8). הספקטרום של E-ההקלטה ב- 8A דמות מראה את המספר הצפוי של פסגות נפתרה. ובכן, הרומז על מצבה העגום של חלבון מקופל כיאות. בנוכחות VimRod (איור 8 ב') הספקטרום מציגה קו מקיף הרחבת והעלמות שיא, המקביל מחייב בין E-ההקלטה לבין VimRod. איגוד זה הוא איבד על ידי מוטציה של R1914E כמו evidenced על ידי השוואה של איור 8C ו ד 8. שינוי קטן הוא ציין בספקטרום על תוספת של VimRod המוטציה R1914E ומעידה על חוסר מחייב בין E-ההקלטה מוטציה זו VimRod. עוצמות שיא E-ההקלטה בהיעדר הנוכחות/VimRod היו יחסית, התווה עוצמות השיא היחסי של איור 8E, אשר מציין את טווח שיא הרחבת במתחם E-ההקלטה. המוטציה R1914E של E-ההקלטה (לא מוצג) נשמר כ 97% של פסגות ב 20% או בעוצמות שיא גבוה יותר בנוכחות של VimRod לעומת כ-20% עבור סוג בר (איור 8E). זה המייצג אובדן של פונקציה בנקודה מוטציה, עם מוטציות נוספות שיש תופעות ביניים גם שיש כבר למדה4.
כדי לאמת, quantitate האיגוד VimRod וניתוח E-ההקלטה MST באמצעות His6-VimRod המסומנת אדום-טריס-נ הפלורסנט כיעד מעורבב עם הפחתת ריכוזים של ליגנד E-ההקלטה מ מ מ 1.28 כדי 39.1 nM בוצעו. Titrations מחייב שלוש בוצעו, התוצאות הן בממוצע, המוצגת באיור9. הנתונים היו מתאימים מודל סטנדרטי של ליגנד אחד-אתר איגוד ונתן KD של 25.7 ± 2.1 μM. הערכה של האיגוד בין VimRod ל- E-ההקלטה על ידי תהודה פלזמון משטח נתן ערך KD דומה של ± 1.3 19.1 μM4.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig1.jpg"> איור 1: מסך לכידת של ההתקנה של הניסוי NMR. החלון המוצג משמש כדי להגדיר ניסוי תקן שתאסוף HSQC dataset. ניסוי פרמטרים נקראים סמוכים לניסוי. הניסוי ZGPR המוצג נבחר כניסוי הראשונית כדי לטעון את הפרמטרים פרוטון התלויים סטנדרטי, הממס. החלון התואר משמש קלט נסיוני פרטים עבור שמירת למטרות רשומות. כדי לאסוף את הספקטרום HSQC הניסוי ZGPR מוחלף SFHMQC3GPPH. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig2.jpg"> איור 2: התאמת הפרמטרים ניסיוני NMR של. החלון המוצג משמש להזנת את הפרמטרים הבסיסיים על הרצף הדופק NMR כדי לייעל את האות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig3.jpg"> איור 3: עיבוד נתונים NMR. פרמטרים המשמשת לעיבוד כל אחד שני הממדים של הספקטרום NMR מוצגים, עם חיצים המציינים אלו מותאמים בדרך כלל. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig4.jpg"> איור 4: פרמטרים עבור איסוף NMR שיא. הפרמטרים המשמש עבור איסוף NMR פסגות בספקטרום NMR מעובד מוצגים עם ערכים אופייניים. להתאים את טווח עמודים לדקה, עוצמת ואת מספר פסגות כדי למטב את הספקטרום. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig5.jpg"> איור 5: נציג Peaklist עם עוצמות. כל שיא זה נבחר בספקטרום NMR ניתנת מספר, ו שלה 1H 15N כימי במשמרות, עוצמת אות מוצגים. Peaklist הזה יכול לשמש לאחר מכן להשוות ספקטרה שהושג בהיעדר הנוכחות/שותף אינטראקציה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig6.jpg"> איור 6: טיהור של מתויג His6 VimRod על ידי ה-IMAC ו א ס. Chromatogram עבור • תנאי מן העמודה IMAC מראה שיא מרכזי אחד של VimRod. B. chromatogram עבור • תנאי מהעמודה מראה פסגה רצינית אחת. ג מרחביות-דף שברים שנאספו במהלך טיהור: MW סטנדרטים MW המצוין kDa משמאל ג'ל (ז) תא lysate (1), IMAC זרימה דרך (2), לשטוף (3), במאגר • תנאי (E1), איחדו S • תנאי (E2). להקות גלוי משקלים מולקולרי גבוה הנמצאים בסמטאות E1, E2 הם oligomers של VimRod טהור כמו מאושרות על-ידי תספיג חלבון (נתונים לא מוצג). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig7.jpg"> איור 7: טיהור של E-ההקלטה מאת IMAC ו א ס. מרחביות-דף של הטיהור IMAC מציג את הסטנדרטים משקל מולקולרי עם MW המצוין kDa משמאל את הג'ל (ז) ו- eluate את מהעמודה הראשונה IMAC (E1), אס המחשוף מוצרים (+ אס), ולא את הזרימה של העמודה השניה IMAC (FT). B. כרומטוגרפיה מהעמודה מראה פסגה רצינית אחת. ג מרחביות-דף של הסטנדרטים משקל מולקולרי (ז) ושברים מפסגת S. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig8.jpg"> איור 8: HSQC ספקטרום של פראי-סוג של מוטציה R1914E של E-ההקלטה בנוכחות והעדר VimRod. ספקטרום HSQC להראות פראי-סוג E-ההקלטה (100 מיקרומטר) ב- 20 מ מ טריס-HCl, 150 מ מ NaCl, 1 מ"מ DTT, pH 7 של העדר (א) או נוכחות של 50 מיקרומטר VimRod (B). פאנלים C ו- D הם ספקטרום HSQC של המוטציה R1914E (100µM) היעדרות או נוכחות של 50 מיקרומטר VimRod, בהתאמה. בחלונית E הפסגה15N היחסי 1H - עוצמות של E-ההקלטה עם או בלי VimRod האיגוד מוצגים כפונקציה של מספר שיא, אשר הוקצו באופן שרירותי, לא מבוסס על רצף עמדה. ערכים אלה יכולים לשמש להגדרת משמעותה ניתוק להפחתת עוצמת שיא על תוספת של ליגנד. אם הקצאות זמינים, ניתן לראות את הערכים המשמעותיים לעיתים קרובות כדי למפות אזור מחייב. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig8large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig9.jpg"> איור 9: איגוד של E-ההקלטה כדי VimRod. E-ההקלטה היה מדולל ב סדרת דילולים כפולה מ מ מ 1.28 כדי 39.1 ננומטר, מודגרות עם VimRod שכותרתו לפני ביצוע ניתוח MST. נתוני שלושת מבחני עצמאית היו משולבות. הנתונים היו מתאימה לדגם KD נותן KD של 25.7 μM עם ביטחון KD של ± 2.1 μM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig9large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>מגיב</td>
			<td>כמות</td>
		</tr>
<tr>
<td>סודיום פוספט, dibasic (נטול מים)</td>
			<td>6.0 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>אשלגן פוספט, monobasic (נטול מים)</td>
			<td>3.0 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>נתרן כלוריד</td>
			<td>0.5 ג'י</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
			<td>עד 950 מ"ל</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1. M9 מדיה עבור תיוג איזוטרופי.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>מגיב</td>
			<td>כמות</td>
		</tr>
<tr>
<td>
15 מלון NH4קלרנית</td>
			<td>1.0 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>גלוקוז (או 13C-גלוקוז)</td>
			<td>2.0 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 מ' MgSO4
</td>
			<td>2 מ</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl 50 מ מ2
</td>
			<td>4 מ"ל</td>
		</tr>
<tr>
<td>20 מ"ג/מ"ל תיאמין</td>
			<td>1.0 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>FeCl 3 מ מ3
</td>
			<td>400 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>מתכת מיקס (טבלה 3)</td>
			<td>500 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
			<td>עד 50 מ ל</td>
		</tr>
</tbody></table>בטבלה 2. שילוב מזין עבור תוספת של M9 מדיה.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>מגיב</td>
			<td>כמות</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 מ מ ZnSO4
</td>
			<td>323 מ"ג</td>
		</tr>
<tr>
<td>MnSO 1 מ4
</td>
			<td>75.5 מ ג</td>
		</tr>
<tr>
<td>4.7 מ מ גובה3בו3
</td>
			<td>145 מ ג</td>
		</tr>
<tr>
<td>CuSO 0.7 מ מ4
</td>
			<td>55.9 מ ג</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
			<td>עד 500 מ"ל</td>
		</tr>
</tbody></table>בטבלה 3. שילוב מתכת תוספת מעשירה את התמהיל התזונתי של MT.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>מדגם</td>
			<td>1 מ מ E-ההקלטה מאגר א1 (µL)</td>
			<td>1 מ מ VimRod במאגר A (µL)</td>
			<td>מאגר (µL)</td>
			<td>DSS מיקרומטר 200 D2O (µL)</td>
			<td>מאגר B2 (µL)</td>
			<td>הנפח הכולל (µL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>E-ההקלטה לבד</td>
			<td>50</td>
			<td>0</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>350</td>
			<td>500</td>
		</tr>
<tr>
<td>E-ההקלטה + VimRod</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>0</td>
			<td>50</td>
			<td>350</td>
			<td>500</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">
1 מאגר ת: 20 מ מ טריס-HCl, 1 מ"מ DTT, ה-pH 7</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">
2 מאגר ב': 23 מ מ טריס-HCl, מ"מ 1.14 DTT, ה-pH 7</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>בטבלה 4. הכנת הדוגמא NMR.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול על ההפקה ועל טיהור של חלבונים עם התווית עם איזוטופים יציבים, ואפיון עוקבות של אינטראקציות חלבון-חלבון באמצעות תהודה מגנטית גרעינית (NMR) ספקטרוסקופיה ו- MicroScale ניסויים Thermophoresis (MST).

מדידת אינטראקציות של חלבונים הכדוריים, Filamentous על ידי תהודה מגנטית גרעינית ספקטרוסקופיה (NMR) Microscale Thermophoresis (MST)

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מרכזיות בתחום האינטראקציה עם החלבון, כגון האם חלבון נקשר ישירות למולקולה קטנה או גדולה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שזו דרך פשוטה ומהירה לזהות אינטראקציות ישירות ברמה האטומית. הפעל את זרימת האוויר באמצעות הוצאת פקודת הפליטה.זה יביא את הדגימה מהמגנט. עכשיו, למקם את הדגימה בתוך ספינר על גבי המגנט בפתיחה. הוסף באמצעות הפקודה ij.המתן עד שהדגימה תתיישב בתוך המגנט לפני שתמשיך. צור ערכת נתונים חדשה באמצעות הפקודה edc וטען פרמטרים סטנדרטיים של פרוטון NMR על-ידי בחירת הניסוי ZGPR. מלא את השדות שם, מספר ניסוי ומספר תיקיית נתונים מעובדת.בחר את הממס בשדה הגדר ממס ולחץ על ביצוע getprosol לקרוא גשושית סטנדרטית ופרמטרים תלויים ממס. נעל את הדגימה לממס deuterated באמצעות פקודת המנעול ולחכות עד שהוא סיים לטאטא ומשיג מנעול. תקן את תדירות תהודה של המגנט על ידי כוונון המדגם באמצעות פקודת הכוונון האוטומטית atma.נטר את העקומה הנדנדה עד להשלמת הכוונון האוטומטי. שים את השדה המגנטי באמצעות topshim. שימינג עושה התאמה לשדה המגנטי.השג אחידות סביב המדגם. מומלץ לאחסן זאת בערכים באמצעות הפקודה wsh, ולקרוא אותם באמצעות rsh לפני topshim, אם משתמשים בדוגמאות זהות או דומות. עכשיו להתאים את רווח המקלט עם הפקודה rga כדי להשיג את האות המרבי יחס רעש.מניחים את מרכז הספקטרום על היסט תהודה מים, ולהגדיר את הדופק פרוטון 90 מעלות בהספק גבוה באמצעות calibo1p1. לאסוף את הספקטרום פרוטון באמצעות הפקודה אפס ללכת zg ולעבד עם EFP. זה כולל כפל אקספוננציאלי, ריקבון אינדוקציה חינם המשלב הרחבת קו, טרנספורמציה פורייה של FID, ו pk כדי להחיל תיקון פאזה.החל את ה- apk של תיקון הפאזה האוטומטי ואת התיקון הבסיסי האוטומטי באמצעות אפשרות הפולינום ללא אינטגרציה. צור ערכת נתונים חדשה עבור הניסוי SOFAST HMBC על ידי בחירת SFHMQC3GPPH בניסוי. העתק את P1 ו- O1 הממוטבים מספקטרום הפרוטון ואכלס פולסים תלויים P1 באמצעות הפקודה getprosol 1H p1 plw1, כאשר p1 הוא ערך P1 ממוטב, ו plw1 הוא רמת הכוח עבור P1. עכשיו, למטב את קבוע CNST54 כדי להגדיר את ההיסט עבור משמרת כימית amide.כמו כן, מטב את CNST55 כדי להגדיר את רוחב הפס כדי להקיף את אזורי העניין הספקטרליים, ולאפשר למטב את רווח המקלט. כדי לבחור פרמטרים אלה, לחלץ את ה- FID הראשון מהספקטרום הדו-ממדי ולחפש את האות שנצפה כדי להגדיר אותם. בנוסף, לשנות את עיכוב הרפיה, מספר סריקות, וסריקות דמה כדי לקבל רגישות אות מקובלת עם gs הפקודה, אשר מאפשר ללכת לסרוק כדי לפקח על איכות הנתונים בזמן אמת.לבסוף, להקליט את הספקטרום באמצעות אפס גו זג. הגדר את פרמטרי העיבוד לגודל של ממדי F2 ישירים ו- F1 עקיפים של הספקטרום, עם חיזוי ליניארי אופציונלי בממד עקיף. בחרו QSINE כפונקציה Window והזינו הסטת פעמון Sine של שניים כדי לעבד את הספקטרום הדו-ממדי.הזינו את הפקודה xfb לעיבוד הנתונים בשני הכיוונים באמצעות פונקציית החלון והמרת פורייה. השתמש בפקודה apk2d כדי לבצע תיקון פאזה אוטומטי בשני הכיוונים. תקן את תוכנית הבסיס באמצעות פונקציית התיקון הבסיסית האוטומטית abs2 לנתונים הדו-מימדית.פעולה זו מחילה פונקציה פולינומית בין ערכי ppm המוגדרים בפרמטרי העיבוד, ותפיק ספקטרום דו-מימדי לניתוח נוסף. אם אתה מתכנן לבצע עיבוד סדרתי להשוואה של נתוני אינטראקציה עם מולקולה אחרת, אחסן את פרמטרי העיבוד עם הפקודה wpar ואחזר אותם עם rpar. הזן את הפקודה pp כדי להתחיל בתהליך בחירת השיא.הגדר את טווח העמודות, העוצמה המינימלית ומספר הפסגות המרבי בהתבסס על הפסגות הצפויות. לאחר מכן לחץ על אישור. אמת את התוצאות על-ידי בדיקה חזותית. במידת הצורך, הפעל מחדש את התהליך עד שהתוצאות יהיה משביע רצון בהתבסס על איכות הספקטרום.צור רשימת שיא באמצעות הפקודה pp. רשימת שיא זו מכילה מידע על גובה נתונים ועוצמת שיא כברירת מחדל. ניתן לייצא את רשימת השיא לספקטרום הבא ותוכניות אחרות יכולות לקרוא אותה.עכשיו לצפות ספקטרום HSQC חלבון לשינויים ברמות שיא או תנועה במשמרות כימיות המצביעות על אינטראקציה עם מולקולה אחרת. אם המולקולה המקיימת אינטראקציה גדולה, צפו להפחתות ברמות השיא יחד עם היעלמות של כמה פסגות. יבא את רשימת השיאים לטבלת הנתונים הבאה על-ידי לחיצה על הכרטיסיה 'פסגות' ובחירה באפשרות 'ייבוא' בלחיצה ימנית בחלון הפסגות.דמיינו את הפסגות על הספקטרום וב במידת הצורך, הזיזו אותן לעמדות חדשות. לחץ על מעצמות איפוס עבור טבלה מלאה כדי ליצור רשימת שיא עבור הספקטרום הכוללת התעצמויות. רשימת שיא זו תישא את מידע המיקום מרשימת השיא המאוחסנת.יצא את רשימות השיא מערכות נתונים שונות לגיליון אלקטרוני או לתוכנית מתמטית אחרת לניתוח על-ידי בחירה בפונקציה Export. חישבו את השינוי בעוצמות השיא עם עוצמת שיא התפקוד בספקטרום מורכב, עוצמת שיא בספקטרום החלבון לכל שיא. ניתן להמיר ערכים לשינוי באחוזים בכפל ב- 100.שים לב כי נפחי שיא הם גם שימושיים, אם כי עוצמות שיא קל יותר למדוד עבור פסגות ממוקמים קרוב זה לזה, כמו בדרך כלל במקרה של חלבונים עם צפיפות גבוהה של פסגות רחבות יחסית. N15HSQCs נרכשו עבור סוג פראי E-PRD, כמו גם מוטציה R1914E, בנוכחות או היעדר VimRod. הספקטרום של סוג הבר E-PRD מראה את המספר הצפוי של פסגות שנפתרו היטב, המעיד על חלבון מקופל כראוי.בנוכחות VimRod, הספקטרום מראה הרחבת קו נרחב והיעלמות שיא, המתאים מחייב בין E-PRD ו VimRod. שינוי קטן נצפתה בין הספקטרום של מוטציית R1914E בכוחות עצמה עם תוספת של VimRod, המציין חוסר מחייב זה מוטציה E-PRD. כאן התעצמות שיא ה-E-PRD בנוכחותו ובהיעדרו של VimRod הושוותה ותוכננה כרמות השיא היחסיות כדי להצביע על טווח תרחבות השיא במתחם E-PRD.כדי לאמת ולכומת את הכריכה של VimRod ו- E-PRD, ניתוח MST באמצעות His6-VimRod שכותרתו עם צבע אדום-tris-NTA פלואורסצנטי כיעד, בוצע באמצעות ריכוזים יורדים של ליגנד E-PRD. הנתונים התאימו לדגם סטנדרטי של איגוד ליגנד של אתר אחד ונתנו KD של 25.7 פלוס או מינוס 2.1 מיקרומולר. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להשתמש בתנאי רכישה ועיבוד זהים.יתקשה בגלל גישה לדגימות חלבון עם תווית איזוטופ לאיסוף ספקטרום NMR. ההשלכות של טכניקה זו להרחיב לכיוון טיפול בסרטן, זיהום, או מחלה ניוונית כי הם כרוכים היווצרות של אינטראקציות חלבון כי הם בסכנה במחלה.

measuring-interactions-globular-filamentous-proteins-nuclear-magnetic

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

סרטון זה מתאר את טכניקת ספקטרוסקופיית התהודה המגנטית הגרעינית לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון בין 15חלבוני אנבופלקין מסוג פרא ומוטציה המסומנים N לבין חלבון וימנטין ללא תווית. האינטראקציה המוצלחת בין אנבופלקין פראי לווימנטין מובילה להרחבת קווים נרחבת ולהיעלמות שיא בספקטרום ה-NMR, בעוד שהיעדר אינטראקציה בין האנבופלקין המוטציה לווימנטין מביא לשיאים פתורים היטב בספקטרום ה-NMR.

תהודה מגנטית גרעינית לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון ברמה האטומית

סרטון זה מדגים תרמופורזה מיקרוסקולית לחקר האינטראקציה חלבון-שומנים. הבדיקה מזהה את האינטראקציה בין מולקולות על ידי כימות התנועה התרמופורטית של חלבונים המסומנים בפלואורסצנט בתגובה לשיפוע טמפרטורה. המולקולה הפלואורסצנטית מעורבבת עם ריכוזים שונים של מולקולות השומנים הלא פלואורסצנטיות, ותערובת המולקולות בתמיסה נטענת בנימים. על הדגימות בנימים מוחל שיפוע טמפרטורה, והתנועה של המולקולה הפלואורסצנטית בשיפוע הטמפרטורה מזוהה ונרשמת.

תרמופורזה מיקרוסקופית לחקר אינטראקציות חלבון-שומנים בתמיסה

thermophoresis microscale (MST) יכול להיות בשימוש נרחב לקביעת זיקה מחייבת ללא טיהור של חלבון המטרה מlysates התא. הפרוטוקול כולל ביטוי יתר של החלבון ה-GFP-התמזגו, תמוגה תא שבאינו denaturing תנאים, וזיהוי של אות MST בנוכחות ריכוזים שונים של ליגנד.

שיטה ללא טיהור חלבונים של קביעת זיקה מחייבת ידי thermophoresis Microscale

MicroScale Thermophoresis (MST) היא טכנולוגיה רגישה לאפיון אינטראקציות aptamer-מטרה. כתב יד זה מתאר פרוטוקול MST לאפיון אינטראקציות בין אפטמר למולקולות קטנות.

מיפוי אתר הקישור של Aptamer על ATP שימוש microscale Thermophoresis

מבנים של חלבון סופרא מולקולרית הרכבות ברזולוציה אטומית הם רלוונטיות גבוהה בשל התפקידים מכריע שלהם במגוון רחב של תופעות ביולוגיות. במסמך זה, אנו מציגים פרוטוקול לבצע מחקרים מבניים ברזולוציה גבוהה על הרכבות לא מסיסים, הבלתי גבישי החלבון macromolecular על-ידי קסם-זווית ספינינג ספקטרוסקופיה של מצב מוצק תהודה מגנטית גרעינית (MAS SSNMR).

מחקרים מבניים אטומי בקנה מידה של הרכבות Macromolecular על ידי תהודה מגנטית גרעינית solid-state ספקטרוסקופיה

תרמופורזה מיקרומטרית מקבלת קבועי כריכה במהירות בעלות חומר נמוכה. תרמופורזה מיקרו-קשקשית ללא תווית או תווית זמינה מסחרית; עם זאת, תווית תרמופורזה חינם אינו מסוגל מגוון של מדידות אינטראקציה שניתן לבצע באמצעות תוויות פלואורסצנטיות. אנו מספקים פרוטוקול למדידות תרמופורזה מתויגות.

שימוש בתרמופורזה מיקרומטרית למדידת אינטראקציות בין חלבון לליפיד

מוצג פרוטוקול ליישום ספקטרוסקופיית NMR לשיפור הרפיה פאראמגנטית לזיהוי אינטראקציות בין-מולקולריות ותוך-מולקולריות חלשות וחולפות בחלבונים בעלי אי-סדר מהותי.

שיפור הרפיה פאראמגנטית לאיתור ואפיון אסוציאציות עצמיות של חלבונים לא מסודרים במהותם

כאן אנו מציגים פרוטוקול המפרט רכישה, עיבוד וניתוח של סדרת ניסויי NMR שמטרתם לאפיין אינטראקציות חלבון-גליקן בתמיסה. מתוארות רוב המתודולוגיות הנפוצות המבוססות על ליגנדות וחלבונים, אשר ללא ספק תורמות לתחומי הגליקוביולוגיה המבנית ומחקרי הזיהוי המולקולרי.

התרת אינטראקציות גליקן-חלבון: תהודה מגנטית גרעינית (NMR) להצלה

ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית (NMR) יכולה לאפיין דינמיקה מבנית של חלבונים באופן ספציפי לשאריות. אנו מספקים פרוטוקול מעשי להקלטת NMR 15N R1 ו- R2 הרפיה ו {1H}-15N אפקט Overhauser הטרוגרעיני (hetNOE), רגיש לפיקושניות לציר הזמן של ננו-שניות.

NMR 15N ניסויי הרפיה לחקר דינמיקה מבנית של פיקו-שנייה עד ננו-שניות של חלבונים

פרוטוקול מבוסס NMR זה חוקר אינטראקציות חלבון-גליקן חלשות באמצעות ציאנובירין-N ו-D-מאנוז. בשילוב שיטות זיהוי ליגנד וחלבון, הוא ממפה אתרי קשירה, מזהה השפעות אלוסטריות ומזהה קומפלקסים של מפגשים. הגישה מתארת הכנת דגימה וניתוח נתונים, ומציעה תובנות מבניות ודינמיות בעלות ערך עבור מנגנוני אבחון וזיהוי ספציפיים לגליקן.

חקר אינטראקציות חלבון-גליקן: התקדמות בתהודה מגנטית גרעינית

למד איך לייצר ולטהר חלבונים מסומני איזוטופים יציבים לניתוח אינטראקציות חלבון-חלבון באמצעות ספקטרוסקופיית NMR ו-MicroScale Thermophoresis. הפרוטוקול מספק שיטה מהירה ויעילה לחקר דינמיקת חלבונים ברמת האטום.

מדידת אינטראקציות של חלבונים הכדוריים, Filamentous על ידי תהודה מגנטית גרעינית ספקטרוסקופיה (NMR) Microscale Thermophoresis (MST) (וידאו) | JoVE Journal

מדידת אינטראקציות של חלבונים הכדוריים, Filamentous על ידי תהודה מגנטית גרעינית ספקטרוסקופיה (NMR) Microscale Thermophoresis (MST)

גלה סרטונים נוספים