מדידת אינטראקציות של חלבונים הכדוריים, Filamentous על ידי תהודה מגנטית גרעינית ספקטרוסקופיה (NMR) Microscale Thermophoresis (MST)
2 בנובמבר 2018
כאן, אנו מציגים פרוטוקול על ההפקה ועל טיהור של חלבונים עם התווית עם איזוטופים יציבים, ואפיון עוקבות של אינטראקציות חלבון-חלבון באמצעות תהודה מגנטית גרעינית (NMR) ספקטרוסקופיה ו- MicroScale ניסויים Thermophoresis (MST).
שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מרכזיות בתחום האינטראקציה עם החלבון, כגון האם חלבון נקשר ישירות למולקולה קטנה או גדולה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שזו דרך פשוטה ומהירה לזהות אינטראקציות ישירות ברמה האטומית. הפעל את זרימת האוויר באמצעות הוצאת פקודת הפליטה.
זה יביא את הדגימה מהמגנט. עכשיו, למקם את הדגימה בתוך ספינר על גבי המגנט בפתיחה. הוסף באמצעות הפקודה ij.
המתן עד שהדגימה תתיישב בתוך המגנט לפני שתמשיך. צור ערכת נתונים חדשה באמצעות הפקודה edc וטען פרמטרים סטנדרטיים של פרוטון NMR על-ידי בחירת הניסוי ZGPR. מלא את השדות שם, מספר ניסוי ומספר תיקיית נתונים מעובדת.
בחר את הממס בשדה הגדר ממס ולחץ על ביצוע getprosol לקרוא גשושית סטנדרטית ופרמטרים תלויים ממס. נעל את הדגימה לממס deuterated באמצעות פקודת המנעול ולחכות עד שהוא סיים לטאטא ומשיג מנעול. תקן את תדירות תהודה של המגנט על ידי כוונון המדגם באמצעות פקודת הכוונון האוטומטית atma.
נטר את העקומה הנדנדה עד להשלמת הכוונון האוטומטי. שים את השדה המגנטי באמצעות topshim. שימינג עושה התאמה לשדה המגנטי.
השג אחידות סביב המדגם. מומלץ לאחסן זאת בערכים באמצעות הפקודה wsh, ולקרוא אותם באמצעות rsh לפני topshim, אם משתמשים בדוגמאות זהות או דומות. עכשיו להתאים את רווח המקלט עם הפקודה rga כדי להשיג את האות המרבי יחס רעש.
מניחים את מרכז הספקטרום על היסט תהודה מים, ולהגדיר את הדופק פרוטון 90 מעלות בהספק גבוה באמצעות calibo1p1. לאסוף את הספקטרום פרוטון באמצעות הפקודה אפס ללכת zg ולעבד עם EFP. זה כולל כפל אקספוננציאלי, ריקבון אינדוקציה חינם המשלב הרחבת קו, טרנספורמציה פורייה של FID, ו pk כדי להחיל תיקון פאזה.
החל את ה- apk של תיקון הפאזה האוטומטי ואת התיקון הבסיסי האוטומטי באמצעות אפשרות הפולינום ללא אינטגרציה. צור ערכת נתונים חדשה עבור הניסוי SOFAST HMBC על ידי בחירת SFHMQC3GPPH בניסוי. העתק את P1 ו- O1 הממוטבים מספקטרום הפרוטון ואכלס פולסים תלויים P1 באמצעות הפקודה getprosol 1H p1 plw1, כאשר p1 הוא ערך P1 ממוטב, ו plw1 הוא רמת הכוח עבור P1. עכשיו, למטב את קבוע CNST54 כדי להגדיר את ההיסט עבור משמרת כימית amide.
כמו כן, מטב את CNST55 כדי להגדיר את רוחב הפס כדי להקיף את אזורי העניין הספקטרליים, ולאפשר למטב את רווח המקלט. כדי לבחור פרמטרים אלה, לחלץ את ה- FID הראשון מהספקטרום הדו-ממדי ולחפש את האות שנצפה כדי להגדיר אותם. בנוסף, לשנות את עיכוב הרפיה, מספר סריקות, וסריקות דמה כדי לקבל רגישות אות מקובלת עם gs הפקודה, אשר מאפשר ללכת לסרוק כדי לפקח על איכות הנתונים בזמן אמת.
לבסוף, להקליט את הספקטרום באמצעות אפס גו זג. הגדר את פרמטרי העיבוד לגודל של ממדי F2 ישירים ו- F1 עקיפים של הספקטרום, עם חיזוי ליניארי אופציונלי בממד עקיף. בחרו QSINE כפונקציה Window והזינו הסטת פעמון Sine של שניים כדי לעבד את הספקטרום הדו-ממדי.
הזינו את הפקודה xfb לעיבוד הנתונים בשני הכיוונים באמצעות פונקציית החלון והמרת פורייה. השתמש בפקודה apk2d כדי לבצע תיקון פאזה אוטומטי בשני הכיוונים. תקן את תוכנית הבסיס באמצעות פונקציית התיקון הבסיסית האוטומטית abs2 לנתונים הדו-מימדית.
פעולה זו מחילה פונקציה פולינומית בין ערכי ppm המוגדרים בפרמטרי העיבוד, ותפיק ספקטרום דו-מימדי לניתוח נוסף. אם אתה מתכנן לבצע עיבוד סדרתי להשוואה של נתוני אינטראקציה עם מולקולה אחרת, אחסן את פרמטרי העיבוד עם הפקודה wpar ואחזר אותם עם rpar. הזן את הפקודה pp כדי להתחיל בתהליך בחירת השיא.
הגדר את טווח העמודות, העוצמה המינימלית ומספר הפסגות המרבי בהתבסס על הפסגות הצפויות. לאחר מכן לחץ על אישור. אמת את התוצאות על-ידי בדיקה חזותית. במידת הצורך, הפעל מחדש את התהליך עד שהתוצאות יהיה משביע רצון בהתבסס על איכות הספקטרום.
צור רשימת שיא באמצעות הפקודה pp. רשימת שיא זו מכילה מידע על גובה נתונים ועוצמת שיא כברירת מחדל. ניתן לייצא את רשימת השיא לספקטרום הבא ותוכניות אחרות יכולות לקרוא אותה.
עכשיו לצפות ספקטרום HSQC חלבון לשינויים ברמות שיא או תנועה במשמרות כימיות המצביעות על אינטראקציה עם מולקולה אחרת. אם המולקולה המקיימת אינטראקציה גדולה, צפו להפחתות ברמות השיא יחד עם היעלמות של כמה פסגות. יבא את רשימת השיאים לטבלת הנתונים הבאה על-ידי לחיצה על הכרטיסיה 'פסגות' ובחירה באפשרות 'ייבוא' בלחיצה ימנית בחלון הפסגות.
דמיינו את הפסגות על הספקטרום וב במידת הצורך, הזיזו אותן לעמדות חדשות. לחץ על מעצמות איפוס עבור טבלה מלאה כדי ליצור רשימת שיא עבור הספקטרום הכוללת התעצמויות. רשימת שיא זו תישא את מידע המיקום מרשימת השיא המאוחסנת.
יצא את רשימות השיא מערכות נתונים שונות לגיליון אלקטרוני או לתוכנית מתמטית אחרת לניתוח על-ידי בחירה בפונקציה Export. חישבו את השינוי בעוצמות השיא עם עוצמת שיא התפקוד בספקטרום מורכב, עוצמת שיא בספקטרום החלבון לכל שיא. ניתן להמיר ערכים לשינוי באחוזים בכפל ב- 100.
שים לב כי נפחי שיא הם גם שימושיים, אם כי עוצמות שיא קל יותר למדוד עבור פסגות ממוקמים קרוב זה לזה, כמו בדרך כלל במקרה של חלבונים עם צפיפות גבוהה של פסגות רחבות יחסית. N15HSQCs נרכשו עבור סוג פראי E-PRD, כמו גם מוטציה R1914E, בנוכחות או היעדר VimRod. הספקטרום של סוג הבר E-PRD מראה את המספר הצפוי של פסגות שנפתרו היטב, המעיד על חלבון מקופל כראוי.
בנוכחות VimRod, הספקטרום מראה הרחבת קו נרחב והיעלמות שיא, המתאים מחייב בין E-PRD ו VimRod. שינוי קטן נצפתה בין הספקטרום של מוטציית R1914E בכוחות עצמה עם תוספת של VimRod, המציין חוסר מחייב זה מוטציה E-PRD. כאן התעצמות שיא ה-E-PRD בנוכחותו ובהיעדרו של VimRod הושוותה ותוכננה כרמות השיא היחסיות כדי להצביע על טווח תרחבות השיא במתחם E-PRD.
כדי לאמת ולכומת את הכריכה של VimRod ו- E-PRD, ניתוח MST באמצעות His6-VimRod שכותרתו עם צבע אדום-tris-NTA פלואורסצנטי כיעד, בוצע באמצעות ריכוזים יורדים של ליגנד E-PRD. הנתונים התאימו לדגם סטנדרטי של איגוד ליגנד של אתר אחד ונתנו KD של 25.7 פלוס או מינוס 2.1 מיקרומולר. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להשתמש בתנאי רכישה ועיבוד זהים.
יתקשה בגלל גישה לדגימות חלבון עם תווית איזוטופ לאיסוף ספקטרום NMR. ההשלכות של טכניקה זו להרחיב לכיוון טיפול בסרטן, זיהום, או מחלה ניוונית כי הם כרוכים היווצרות של אינטראקציות חלבון כי הם בסכנה במחלה.
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול לייצור וניקוי של חלבונים המסומנים באיזוטופים יציבים, המאפשרים את אפיון האינטראקציות בין חלבונים באמצעות ספקטרוסקופיית NMR וטרמופורזה בקנה מידה קטן (MST).
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביוכימיה
- ביולוגיה מבנית
- אינטראקציות בין חלבונים
רקע
- הבנת אינטראקציות בין חלבונים היא קריטית להבהרה של תהליכים ביולוגיים.
- סימון באמצעות איזוטופים יציבים משפר את הגילוי של אינטראקציות אלו.
- ספקטרוסקופיית NMR מספקת תובנות ברמה אטומית לגבי דינמיקה של חלבונים.
- MST מציעה גישה משלימה לחקר זיקות קשירה.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול יעיל לסימון חלבונים ולניתוח אינטראקציות.
- הדגמת היעילות של NMR ו-MST באפיון אינטראקציות בין חלבונים.
- אספקת שיטה אמינה לחוקרים ללימוד דינמיקה של חלבונים.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- ייצור וניקוי של חלבונים המסומנים באיזוטופים יציבים.
- ספקטרוסקופיית NMR לניתוח מבנה חלבונים ואינטראקציות.
- MST למדידת זיקות קישור (binding affinities) בין חלבונים לליגנדים.
- טכניקות לעיבוד נתונים לצורך ניתוח ספקטרלי וזיהוי פיקים.
תוצאות עיקריות
- הושגו סימון וניקוי מוצלחים של חלבונים.
- ספקטרום NMR חשף שינויים משמעותיים בעקבות קישור ליגנד.
- MST אישר אינטראקציות ישירות בין חלבונים למולקולות קטנות.
- ניתוח הנתונים סיפק תובנות לגבי זיקות קישור ודינמיקת אינטראקציה.
מסקנות
- הפרוטוקול מציע שיטה מהירה ויעילה לחקר אינטראקציות בין חלבונים.
- NMR ו-MST הן טכניקות משלימות המשפרות את ההבנה של דינמיקת חלבונים.
- ניתן להחיל גישה זו על חלבונים שונים ומחקרי אינטראקציות מגוונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מדידה ישירה של אינטראקציות בין חלבונים ברזולוציה אטומית היא קריטית להפחתת סיכונים באימות מטרה (target validation) ולהגברת ההבנה המכניסטית בשלבי הגילוי המוקדמים. שימוש משולב בספקטרוסקופיית NMR וב-MST מאפשר הערכה כמותית של אירועי קישור, מה שתומך בביטחון ניבוי לגבי מעורבות המטרה (target engagement) ומסייע בקבלת החלטות לגבי תיעדוף תיקי פיתוח. זרימת עבודה זו רלוונטית במיוחד להערכת ההשפעה של מוטציות או תנאי תמיסה על סגוליות ואפיניות של האינטראקציה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה ישירה של אירועי קישור של חלבונים להבהרת מנגנונים מולקולריים.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרה על ידי הבחנה בין אינטראקציות ספציפיות לאינטראקציות לא ספציפיות.
- מסייע בהפחתת סיכונים מנגנונית על ידי כימות השפעותיהן של מוטציות או שינויים סביבתיים על הקישור.
- מספק ראיות ברמה אטומית להנחיית החלטות go/no-go בבחירת מטרה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מבסס מערכות מותקפות לסריקה של מודולטורים או משבשים של אינטראקציות בין חלבונים בשלבים מאוחרים יותר.
- מספק תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור של זיקת קישור ועוצמת אינטראקציה.
- מאפשר סטנדרטיזציה של תנאי הבדיקה לצורך השוואה בין וריאנטים או תרכובים.
- תומך ביכולת הרחבה (scalability) על ידי מתן אפשרות לייצוא של רשימות שיאים ונתונים לניתוח נוסף.
מחקר תרגומי וטרום-קליני
- מתיישב עם מערכות רלוונטיות למחלה באמצעות מידול של אינטראקציות המעורבות בסרטן, זיהום או ניוון עצבי.
- מספק רצף מהגילוי המולקולרי ועד לתיקוף פרה-קליני של חומרים המודולים אינטראקציות.
- מאפשר התקדמות מותאמת סיכונים על ידי כימות ההשפעה של מוטציות הקשורות למחלה על הקישור.
- תומך בפיתוח ביומרקרים תרגומיים באמצעות מדידה מדויקת של שינויים באינטראקציה.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
שיטה זו משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות ראשונית דרך זיהוי מובילים (lead identification) ועד לתיקוף פרה-קליני, ובכך מספקת פלטפורמה הניתנת לשימוש חוזר לניתוח אינטראקציות.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקה מונחית-היפותזה של קישור חלבונים ומיפוי נתיבים מכניסטיים.
- סריקה: מספקת פלטים כמותיים וניתנים לשחזור עבור פיתוח בדיקות והערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מספקת רשימות שיאים ונתוני זיקה שניתן לייצא לצורך השוואה בין תנאים שונים וניתוח סטטיסטי.
- מחקר תרגומי: מקשר בין ממצאים מולקולריים למודלים של מחלות על ידי כימות שינויים באינטראקציות הרלוונטיות לפתולוגיה.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע זרימת עבודה סטנדרטית וניתנת להתאמה למגוון מחקרי אינטראקציות חלבונים בין תוכניות שונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: מקדם סטנדרטיזציה, הדירות ויכולת הרחבה של בדיקות אינטראקציה.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת לגבי המשך או הפסקת התהליך (go/no-go) וניהול תיק פרויקטים יעיל מבחינת הון.
- השפעה על תיק הפרויקטים: תומך בתיעוד עדיפויות מותאם סיכון ובקידום של מטרות ומובילים (leads) מתוקתקים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בספקטרוסקופיית NMR, ב-MST ובטכניקות לסימון חלבונים.
- מחייב גישה לחלבונים מסומני איזוטופים ולמכשור אנליטי מתקדם.
- דורש סטנדרטיזציה קפדנית של פרמטרי רכישת נתונים ועיבוד נתונים בין הניסויים השונים.
- עשוי לדרוש התאמה למערכות חלבונים שונות או לסוגי אינטראקציות שונים.
- תלוי באיכות הדגימה ובזמינות של חלבונים מופרשים לצורך ביצוע אנליזה מהימנה.
