בידוד של Glomeruli, In Vivo תיוג של חלבונים פני שטח התא Glomerular

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום נפרולוגיה על התפקיד של חלבון פני השטח התא סחר במחלת כליות פרוטאינורית ולא פרוטאינורית. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהיא מקלה על המחקר של חלבון פני השטח התא סחר in-vivo, כי יותר מחלבון אחד ניתן לנתח לכל ניסוי. למרות שיטה זו יכולה לספק תובנה לתוך סחר משטח התא גלומרולרי, ניתן להחיל גם על מערכות איברים אחרות כי הם חדור נגישים על ידי טכניקות בידוד.

התחל על ידי אישור חוסר תגובה לצביטת בוהן וחיטוי הצד הגחוני של העכבר הרדמה עם 70% isopropyl. בצע חציון לחתוך דרך העור מהאגן אל עצם החזה ולהשתמש פינצטה כדי להסיר את העור מן fascia הבטן. חותכים את העור משני צידי קו האמצע הבטן ולעשות מדיום דרך שכבת שריר הבטן משלפוחית השתן כדי xiphoid.

השתמש במספריים ומלקחיים כדי לחלק את השרירים לארבעה רבעים ולהשתמש בשני מלחציים כירורגיים כדי לאבטח את שני הרבעים העליונים לכיוון הצוואר של בעלי החיים. מניחים את החיה תחת מיקרוסקופ לנתח ולהשתמש החלפה סטרילית כדי להזיז הצידה את האיברים הקרביים. באמצעות מספריים עדין, לחתוך את הרצועה phrenic כבד.

באמצעות פינצטה כירורגית עדינים, מניחים תפר אחד סביב העורק המזנטרי ב כבד של עורקי הכליה. וסובב את בית האבות, קרוב לעורקי הכליה, בלוטת יותרת הכליה. שחררו את אבי העורקים הדיסטלי מהפאשיה, השומן ורקמות אחרות.

לאחר מכן, מהדקים את הוונה קאווה ואת אבי העורקים בשיא הביפורציה ומ מניחים תפר נוסף סביב דיסטל אבי העורקים של כליות. השתמש פינצטה כדי להדק את התפר אבי העורקים proximal, להחריש את זרימת הדם לחתוך חור קטן מחצית קוטר אבי העורקים לתוך אבי העורקים, דיסטלי לעורקי הכליות. הכנס קטטר 10 ס"מ מחובר מזרק 10 מיליליטר המכיל חמישה מיליליטר של קרח קר PBS בתוספת סידן ומגנזיום לתוך בית הדם.

ולתקן את הקטטר עם הקשירה המוכנה. ואז להתחיל לזלזל בכליות בקצב זרימה של שני מיליליטר לדקה. שימוש במספריים עדין כדי לחתוך חור לתוך וריד הכליה בעורקי הכליה ומהדק את התפר סביב עורקי כבד מזנטי.

לאחר הנפח כולו של PBS נמסר להחליף את perfusate עם חמישה מיליליטר של קרח קר PBS בתוספת סידן ומגנזיום בתוספת 0.5 מיליגרם למיליליטר ביוטין עבור תיוג פני השטח. המשך לבלבל את הכליות בקצב זרימה של שני מיליליטר לדקה. כאשר הנפח כולו נמסר, לצרף מזרק המכיל חמישה מיליליטר של קרח קר PBS בתוספת סידן ומגנזיום בתוספת 100 גליצין מילימולר לקטטר.

הרוו את הגלומרולי עם כל חמשת המיליליטרים של תות תזמת הגליצין בקצב זרימה של שני מיליליטר לדקה. לאחר מכן לחדד את הכליות עם חמישה מיליליטר של קרח קר PBS בתוספת סידן ומגנזיום בתוספת 200 microliters של חרוזים מגנטיים למיליליטר בקצב זרימה של שני מיליליטר לדקה. האמבוליזציה של הגלומרולי עם חרוזים מגנטיים חומים תהיה גלויה על פני הכליה.

כאשר כל חרוזים נמסרו להסיר את הקפסולה של הכליות לקצור את הכליות ב hilum. מניחים את הכליות בצלחת תרבות תאים 10 ס"מ המכיל 15 מיליליטר של PBS בתוספת סידן ומגנזיום. השתמש בלהב חדש עם קצוות כפולים כדי לחתוך את הכליות לחתיכות הקטנות ביותר האפשריות.

מעבירים את הרקמה לצינור של שני מיליליטר המכיל מיליליטר אחד של קולגן A למשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס, ומערבבים בעדינות את ת פתרון הרקמה לפני ואחרי העיכול עם קצה פיפלט 1000 מיקרוליטר שונה. בסוף הדגירה, לסנן את הרקמה מתעכל דרך מסננת תא 100 מיקרון. השתמש מגרד תאים קר קרח PBS בתוספת סידן ומגנזיום כדי לרסק את הרקמה הנותרת דרך מסננת התא.

להביא את הנפח הסופי של ההשעיה תא יחיד כליה עד 50 מיליליטר עם PBS קר קרח טרי בתוספת סידן ומגנזיום ולאסוף את תאי הכליות על ידי צנטריפוגה. הסר את supernatant ואז להשעות מחדש את גלולה עם קצת פחות מ 1.5 מיליליטר של קרח קר PBS בתוספת סידן ומגנזיום תוך מערבולת ולהעביר את ההשעיה גלומרולרי לתוך צינור חדש שני מיליליטר. כדי לשטוף את glomeruli, מניחים את הצינור לתוך מגנט כדי לצבור את glomeruli.

לאחר דקה אחת, השתמש פיפטה 1000 microliter כדי להסיר את supernatant. ולהסיר את הצינור מהמגנט. מוסיפים מיליליטר אחד של PBS בתוספת סידן ומגנזיום לרקמות.

פיפטה גלומרולי למעלה ולמטה פעם אחת ומערבולת התאים. להחזיר את הצינור למגנט ולשטוף את glomeruli שוב כפי שהוכח רק. עד שטוהר מדגם הגיע לפחות ל-90% על-ידי ניתוח מיקרוסקופ אור בהגדלה של 40 עד 100 X.

ואז לאסוף את גלומרולי מטוהר חרוז מגנטי על ידי צנטריפוגה. כדי להשיג טוהר של יותר מ-95%, היה צורך לשטוף את הגלומרולי ביסודיות כפי שהוכח. זלבול ביוטין מקל על תיוג של לולאות נימי ביוטין אבל לא נשלט כליות עכבר מנוזרות.

משקעים חיסוניים של שבר ביוטין של תמציות גלומרולרי מגלה כי חלבוני transmembrane גלומרולרי nephrin ו podocalyxin הם immunoprecipitated עם ביוטין אבל לא עם שבר הבקרה. כתמים של שבר immunoprecipitated עם סטרפטבידין עוד יותר מאשר את נוכחותו של נפרין בחור ביוטין בביוטין מחורש אך לא שליטה בעלי חיים מחושלים. קדרן אנדותל חלבון אנדותל ומולקולת הידבקות תאית 2 הם גם immunoprecipitated בתוך שבר ביוטין.

בשלב המוקדם של nephritis nephrotoxic ביטוי מופחת של נפרין פני השטח של התא נצפתה בבעלי חיים nephrotoxic nephritis בהשוואה לפקדים. ואכן ניתוח densitometic מראה הפחתה משמעותית של נפרין laded ביוטין בבעלי חיים nephrotoxic nephritis בהשוואה לבקרים. ניתוח כמותי של יחס הנפרין לאקטין הכולל אינו מגלה הבדלים משמעותיים בין עכברי הנפרוטוקסיים.

בנוסף, כמויות שוות של podocytes נצפו nephrotoxic nephritis ובעלי חיים שליטה. בדלקת נפריטיס נפרוטוקסית מאוחרת, בעלי חיים נפרוטוקסיים נפריטיים מפגינים התאוששות של ביטוי נפרין ללא הבדלים משמעותיים בנפרין פני השטח של התא הנפרין שנמדדו בין עכברים נפרוטיים נפרוטוקסיים לבין הפחתה כוללת של הנפרין בבעלי חיים נפריתיים נפרוטוקסיים. יתר על כן, מספרי podocyte מצטמצם בהשוואה לבעלי חיים שליטה.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור על מזרקים בועה חופשי במהלך הקשר שלהם על מנת למנוע תסחיף אוויר של glomeruli ולעבוד בתנאים קרים כקרח פעם חליטה בכליות החלה. בעקבות הליך זה ניתן לבצע שיטות אחרות כמו בידוד של RNA glomeruli וחלבון כדי לענות על שאלות נוספות על ביטוי חלבון או אינטראקציות בכליות בריאות וחוליות.