Name: צמח צמיחה ושינוי בתיווך Agrobacterium פרחוני-מח ש של Extremophyte Schrenkiella parvula (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: למדו את שיטת ההשרייה בפרחים להנדסה גנטית של Schrenkiella parvula באמצעות Agrobacterium. פרוטוקול זה מאפשר יצירת קווים טרנסגניים יציבים לחקר הסתגלות צמחים לסטרס מלחים רב-יוני.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי פרס הלאומית למדע MCB 1616827.

1. צימוח
<ol><li>
עיקור זרע (אופציונלי)
	<ol>
<li>להכין 50% מלבין מזוקק פעמיים מים (ddH2O) עם 1 או 2 טיפות של חומר ניקוי ללא יונית (ראה טבלה של חומרים) צינור 50 מ ל. היפוך ברכבת התחתית מספר פעמים כדי לערבב את הפתרון. הערה: עדיף לבצע עיקור זרע בזרימה שכבתית ארון עם משטח סטיריליים UV למשך 15 דקות.</li>
		<li>להוסיף את הפתרון אקונומיקה ~ 100-200 ס parvula זרעים צינור 1.5 מ ל. לערבב היטב ולתת את הצינור לשבת במשך 5 דקות.</li>
		<li>להסיר את המלבין הצינור ולהוסיף 70% אתנול. לשטוף את הזרעים על-ידי pipetting מספר פעמים ולאחר מכן להסיר מיד את הפתרון אתנול.</li>
		<li>לשטוף את הזרעים במים סטיריליים כדי להסיר עודפי אקונומיקה ואתנול, ולאחר מכן הסר את המים. חזור על השלב 5 עד 6 פעמים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ריבוד זרע
	<ol>
<li>לטבול את הזרעים במים מעוקר, ולאחסן במשך 5 עד 7 ימים ב- 4 מעלות צלזיוס. לחלופין, לזרוע זרעים יבשים לא מחוטאים ישירות על קרקע רטובה, ולמקם את המגש אדמה במשך 5 עד 7 ימים ב- 4 מעלות צלזיוס.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
גידול צמחים בהכנה של טרנספורמציה
	<ol>
<li>מילוי האדמה לערבב (ראה טבלה של חומרים) לתוך 7 x 6 ס מ2 סירים, להשרות את הסירים במים, לרסס מים מלמעלה כדי להבטיח מדיום הגידול רטוב בצורה אחידה. להוסיף 5-דשן חרוזים (ראה טבלה של חומרים) על פני אדמת כל סיר. הערה: ככל שאנו חווים, ס parvula גדל היטב על כל תערובת אדמה היכן לבנה א יכול לגדול.</li>
		<li>באמצעות קיסם רטוב, להעביר 20 ~ 25 זרעים לכל סיר על פני האדמה. הערה: שיטה נוחה היא לשים אצווה של 4 – 5 זרעים ארבע הפינות ומרכז של הסיר (איור 1, 15 יום, החלונית השמאלית).</li>
		<li>מכסים את המגש סיר עם כיפה ברורה כדי לשמור את הזרעים תחת לחות גבוהה במהלך הנביטה.</li>
		<li>לשמור את המגשים צמח בתוך תא הצמיחה עוצמת האור שוכן בגובה 130 µmol מ'−2 s− 1 אור, טמפרטורה 22 – 24 ° C ו h 14 לכל יום/10 h המחזור הלילה. הסר את הכיפות לאחר 7-10 ימים לאחר נביטה. מוסיפים מים בתחתית המגש לשמור על אדמת לחלח אחיד ברמה רצויה.</li>
		<li>לנכש שתילים נוספים ולהשאיר רק 4 – 5 שתילים בריאים לכל סיר טוב מופרדים זה מזה (איור 1, 15 יום, לוח נכון).</li>
		<li>בעדינות להשקות את הצמחים בכל יומיים, לדשן עם 0.2 x של הוגלנד פתרון16 פעם בשבועיים. הערה: שמירה על לחות הקרקע ברמה אחידה היא המפתח גדל parvula ס הפירסומים ובעקביות.</li>
		<li>להמשיך לגדל את הצמחים במשך 8-10 שבועות עד התפרחות מרובות לייצר 100 – 150 ניצנים פרחוני לכל צמח (איור 1, יום 60 – 80). ביום המתוכנן הטרנספורמציה מבוסס פרחוני-מח ש (שלב 4.5), הסר siliques בוגרת ומתפתחות כל הצמחים.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. שיבוט רכיב גנטי/גנומית עניין לתוך וקטור לשינוי צמח
<ol><li>להגביר את מקטע DNA היעד באמצעות פולימראז תגובת שרשרת (PCR)17 , המבודד מוצר ה-PCR באמצעות מיצוי של ג'ל קיט (ראה טבלה של חומרים) על פי פרוטוקול הערכה או כל שיטה אחרת המתאימה לטהר את הדנ א באמצעות agarose ג'ל אלקטרופורזה17,18. ודא את הרצף של המוצר PCR מבודד עד סנגר רצף19.</li>
	<li>שיבוט המוצר PCR הרצוי לתוך השיבוט וקטור והמרה הבונה משובטים לתוך המוסמכים e. coli תאים באמצעות שיבוט מבוסס טופואיזומראז קיט (ראה טבלה של חומרים) בעקבות הנחיות היצרן.</li>
	<li>להפיץ את µL 50 מוצרים טרנספורמציה במדיה לוריא-Bertani20 (LB) אגר התפתחות חיידקים (טבלה 1) עם אנטיביוטיקה מתאימה, למשל., 50 µg / mL Spectinomycin (ראה טבלה של חומרים), דגירה על 37 ° C בין לילה.</li>
	<li>למחרת, בחר מושבות יחידה 5 – 10, לחסן לתוך נוזלי בינוני ליברות עם אנטיביוטיקה מתאימה ולאחר דגירה ייבוש עדין ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.</li>
	<li>פלסמידים ולבודד באמצעות בידוד פלסמיד קיט (ראה טבלה של חומרים) וודא דרך רצף סנגר19 אם הרצף היעד מוגבר ב- 2.1 כראוי שוכפל.</li>
	<li>להעביר את המוצר PCR משובטים ומאומת על וקטור היעד של הצמח השינוי תואם המבוסס על רקומבינציה שיבוט (ראה טבלה של חומרים), באמצעות שילוב של אנזים recombinase קיט להלן (ראה טבלה של חומרים), ההדרכה היצרן ערכת. חזור מ שלב 2.3 לשלב 2.5 כדי לבודד ולוודא שיבוטים מחסה תקין פלסמיד בונה.</li>
</ol>3. להפוך את וקטור לבנות לשינוי צמח Agrobacterium tumefaciens
<ol><li>להפוך את פלסמיד של הבונה וקטור מ- 2.6 המתח tumefaciens א GV3101:pMP90RK21, אשר בנמלים גן עמידות ריפאמפיצין לבחירת רקע כרומוזומלית. להשתמש באנטיביוטיקה המתאימה, למשל Gentamycin או Kanamycin (ראה טבלה של חומרים), עבור הבחירה של צמח טרנספורמציה לבנות (פלסמיד Ti). פרוטוקול קצר לשינוי tumefaciens א ויה אלקטרופורציה כלולה בסעיף 3.2.</li>
	<li>
Tumefaciens א שינוי על ידי אלקטרופורציה
	<ol>
<li>הפשרת המוסמכת תאים tumefaciens א 22 על קרח. מיקס 0.1 – 1 µg של פלסמיד שהוכנו 2.6, מומס 1 – 2 µL של ddH2O, עם תאים המוסמכת על קרח. להעביר את התערובת לתוך cuvette אלקטרופורציה (ראה טבלה של חומרים).</li>
		<li>לבצע אלקטרופורציה על התערובת של פלסמידים ותאים המוסמכת מ 3.2.1, באמצעות electroporator (ראה טבלה של חומרים) בעקבות הנחיות היצרן. הערה: לנקות את השטח של cuvette לפני שמתחילים את אלקטרופורציה.</li>
		<li>להעביר את התערובת התגובה cuvette צינור microcentrifuge המכיל 1.5 מ ל LB נוזל מערבבים היטב עם pipetting, תקופת דגירה של h 1 ב 28 ° C עם טלטול עדין.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לחסן את טרנספורמציה tumefaciens א מ סעיף 3.2 על צלחות LB אנטיביוטיקה הבחירה המתאימה (למשל Kanamycin 25 µg / מל, Spectinomycin 50 µg / mL, Gentamycin 25 µg / mL, ו- 50 ריפאמפיצין µg / mL) דגירה -28 מעלות צלזיוס למשך 3 ימים.</li>
</ol>4. Agrobacterium בתיווך טרנספורמציה של parvula ס
<ol><li>לחסן את הסינגל הפך מושבות של צלחות לתוך 10 מ ל LB המדיה נוזלית המכילה אנטיביוטיקה (כמו 3.3) ב סטרילי 50 מל חרוט צינור (ראה טבלה של חומרים). תקופת דגירה של 24 ש ח בחודש חממה חזק (ראה טבלה של חומרים) ב 250 r.p.m. ב 28 º C.</li>
	<li>להעביר את הפתרון חיידקי 3.4.1 בקבוקון סטרילי 250 מ ל, להוסיף 40 מ"ל של מדיה נוזלי ליברות עם אנטיביוטיקה מתאימה, דגירה 12 שעות עד הצפיפות האופטית-גל nm 600 (OD600) מגיע בסביבות 2.0.</li>
	<li>Centrifuge tumefaciens א cultureat 3,100 x g עבור 10 דקות להסיר את תגובת שיקוע, מחדש להשעות את התרבות חיידקי ב- 40 מ"ל של פתרון חדירה tumefaciens א (טבלה 1).</li>
	<li>לדלל את resuspended tumefaciens א עם חדירה לפתרון יתר סופית600 של 0.8. להוסיף 25 µL של חומרים פעילי שטח פתרון (טבלה 1) ל- 50 מ של מדולל tumefaciens א פתרון ומיקס על ידי היפוך מספר פעמים.</li>
	<li>טובלים את פריחת הצמחים הפתרון tumefaciens א מוכן בסעיף 4.4 לשימוש ס' 20 פתרון חיידקי טריים לאחר טבילה תפרחת של שישה סירים. ודא כי כל הפרחים נמצאים בקשר עם הפתרון. Pipet פתרונות חיידקי ישירות על גבי פרחים הממוקמת בחלק התחתון של התפרחת, אם הם לא יכולים להיות הטבלתי את הפתרון. הערה: לשינוי בסיבוב הראשון, הקפד להסיר את כל siliques בוגרת ומתפתחות באמצעות סכין חדה או מספריים קטנות. אל תסיר siliques אם מבצע טרנספורמציה בפעם השנייה.</li>
</ol>5. פוסט-טרנספורמציה צמח והטיפול הטרנספורמציה השניה
<ol><li>הנח את הצמחים פרחוני טבול אופקית במגשים נקי עם כיפות כדי לכסות את הצמחים מקום בחדר חשוך צמיחה 1 – 2 ימים. הערה: שמירה הפרחים תחת לחה חשוב בשלב זה (איור 1, צמחים אחרי השינוי).</li>
	<li>הצמחים לחזור למצב מאוזן ולהעביר את הצמחים חדר צמיחה עם ה 14 לכל יום/10 שעה לכל מחזור לילה, 130 µmol-2 m s-1 עוצמת אור וטמפרטורה 22 עד 24 ° C.</li>
	<li>נטר התפרחות טבל בשבוע הבא. אם מספר משמעותי של פרחים בטל (איור 2), חזור על טבילה פרחוני (שלב 4) לאחר כ- 4 שבועות או לאחר מספר רב של פרחים פיתחו לאחרונה. הערה: בניגוד השלב הכנה של השינוי הראשון (שלב 1.3.7), אל תסיר הקיימים מראש או לפתח siliques (איור 2) לפני הסיבוב השני של טרנספורמציה.</li>
	<li>לגדל את הצמחים עד זרעים בוגר, הקציר זרעים ב ~ 21 שבועות.</li>
	<li>זרעים יבשים במשך 2-3 שבועות בטמפרטורת החדר בכלי אטום לאוויר עם מלא desiccants (ראה טבלה של חומרים).</li>
</ol>6. בחירת Transformants חיובית
<ol><li>לשתול את הזרעים T1 כמתואר על זרעים פראי סוג שלבים 1.2-1.3.</li>
	<li>לגדל את הצמחים עד לפתח העלים האמיתי הראשון 2, כ- 10-14 ימים לאחר נביטה.</li>
	<li>
לבצע את הבחירה הראשונה להתנגדות קוטל עשבים (איור 3A ו- 3B) כפי שיפורט להלן.
	<ol>
<li>לדלל את glufosinate-אמוניום (11.3%) קוטל עשבים (או בסטה) (טבלה 1) כדי 1:1,000 (וי/v). תרסיס פתרון באסטה מדולל על השתילים, לכסות את הצמחים עם כיפות בן לילה.</li>
		<li>חזור על באסטה ריסוס 2 – 3 פעמים כל 5-7 ימים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
לבצע את הבחירה השניה באמצעות מבחן באסטה-שחרור כפי שיפורט להלן.
	<ol>
<li>זיהוי צמחים לשרוד לאחר להיות ריסס 3 – 4 פעמים עם פתרון באסטה. לגדל את הצמחים עוד 2-3 שבועות עד 3-5 עלים לפתח פני שטח גדול יחסית.</li>
		<li>לבחור הגדול העלה בוגרת לכל צמח, לשפשף את פני השטח של העלה בעדינות עם האצבע כדי להסיר את שכבת שעווה, ומניחים על טיפה של הפתרון באסטה מדולל (מתוך שלב 6.3.1). הערה: סמן את המיקום של העלה להחיל עם הירידה באסטה על-ידי הצבת קלטת נייר על הגבעול הקרוב.</li>
		<li>לפקח על העלים להחיל עם הירידה באסטה סימנים של כמישה עד לשבוע אחד. בחר את הצמחים עם עלים מושפע הטיפות באסטה. הערה: עלים מצמחים הכי חיובי-false מתחיל לקמול בתוך יומיים, בעוד עלים של אמת-תוצאות חיוביות שלמים גם לאחר הירידה של באסטה פתרון מתייבש (איור 3C).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
אשר transformants חיובי באמצעות PCR גנומית.
	<ol>
<li>לאסוף 2-3 עלים של הצמחים לשרוד בשלב 6.4.5.</li>
		<li>תמצית דנ א גנומי מן העלים באמצעות שיטת CTAB23 או כל המתאים DNA החילוץ שיטה אחרת.</li>
		<li>לבצע PCR באמצעות חילוץ גנומית דגימות דנ א צמחים יעד פראי-סוג צמחים (כפקדי שלילי), הבונה פלסמיד מהשלב 3.1 (כמו פקד חיובי). להשתמש בזוג המתאים של PCR תחל ספיציפית הגן סמן סלקטיבית, למשל, עבור עמידים באסטה ג'ין (בר), TCAGCAGGTGGGTGTAGA (קדימה), GTCAACCACTACATCGAGACAA (הפוכה).<ol>
<li>עבור תחל ה-PCR דוגמה מיקוד הגן בר , השתמש התנאים PCR הבאים: השלב הראשוני דנטורציה ב 98 ° C ל 30 s; ואחריו 30 מחזורים של denaturing ב 98 ° C ל 30 s, חישול ב 59 ° C ל 30 s, והארכת ב-72 מעלות ל 30 s; והסיומת הסופי ב-72 מעלות במשך 5 דקות. הערה: כדי להבטיח החדרת T-DNA כולו, מומלץ גם ביצוע PCR גנומית באמצעות פריימר PCR מן הגן סמן סלקטיבית, פריימר PCR אחר ספציפי רצף המטרה משוכפלות הווקטור טרנספורמציה צמח בשלב</li>
		</ol>
</li>
		<li>לאשר הנוכחות של הגודל הצפוי של המוצר PCR מוגבר בר agarose ג'ל אלקטרופורזה17 על הדגימות היעד (איור 4א) כמו גם על-ידי קביעת רצף באמצעות19 של מוצר ה-PCR מבודד ההליך כמו שלב 2.1.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Dassanayake, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21822265">The genome of the extremophile crucifer Thellungiella parvula.</a> Nature Genetics. 43 (9), 913-918 (2011).</li>
<li>Oh, D. -H., Dassanayake, M., Bohnert, H. J., Cheeseman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+at+the+extreme%3A+lessons+from+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Life at the extreme: lessons from the genome.</a> Genome Biology. 13 (3), 241(2012).</li>
<li>Whited, J. <a target="_blank" href="https://www.cell.com/cell/pdf/S0092-8674(15)01125-3.pdf">The Next Top Models.</a> Cell. 163 (1), 18-20 (2015).</li>
<li>Dassanayake, M., Yun, D. O. D., Bressan, R. A., Cheeseman, J. M., Bohnert, J. H. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B978012381466100002X">The scope of things to come: New paradigms in biotechnology.</a> Plant Biotechnology and Agriculture: Prospects for the 21st Century. , 19-34 (2009).</li>
<li>Dittami, S. M., Tonon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomes+of+extremophile+crucifers%3A+New+platforms+for+comparative+genomics+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Genomes of extremophile crucifers: New platforms for comparative genomics and beyond.</a> Genome Biology. 13 (8), 166(2012).</li>
<li>Amtmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+from+evolution%3A+Thellungiella+generates+new+knowledge+on+essential+and+critical+components+of+abiotic+stress+tolerance+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Learning from evolution: Thellungiella generates new knowledge on essential and critical components of abiotic stress tolerance in plants.</a> Molecular Plant. 2 (1), 3-12 (2009).</li>
<li>Oh, D. -H., Hong, H., Lee, S. Y., Yun, D. -J., Bohnert, H. J., Dassanayake, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+structures+and+transcriptomes+signify+niche+adaptation+for+the+multiple-ion-tolerant+extremophyte+Schrenkiella+parvula%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Genome structures and transcriptomes signify niche adaptation for the multiple-ion-tolerant extremophyte Schrenkiella parvula.</a> Plant Physiology. 164 (4), 2123-2138 (2014).</li>
<li>Orsini, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+of+salt+tolerance+parameters+in+11+wild+relatives+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">A comparative study of salt tolerance parameters in 11 wild relatives of Arabidopsis thaliana.</a> Journal of Experimental Botany. 61 (13), 3787-3798 (2010).</li>
<li>Uzilday, B., Ozgur, R., Sekmen, A. H., Yildiztugay, E., Turkan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+alternative+electron+sinks+and+antioxidant+defence+in+chloroplasts+of+the+extreme+halophyte+Eutrema+parvulum+%28Thellungiella+parvula%29+under+salinity%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Changes in the alternative electron sinks and antioxidant defence in chloroplasts of the extreme halophyte Eutrema parvulum (Thellungiella parvula) under salinity.</a> Annals of Botany. 115 (3), 449-463 (2015).</li>
<li>Teusink, R. S., Rahman, M., Bressan, R. A., Jenks, M. A. <a target="_blank" href="https://www.journals.uchicago.edu/doi/10.1086/338825">Cuticular waxes on Arabidopsis thaliana close relatives Thellungiella halophila and Thellungiella parvula.</a> International Journal of Plant Sciences. 163 (2), 309-315 (2002).</li>
<li>Jarvis, D. E., Ryu, C. H., Beilstein, M. A., Schumaker, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+for+SOS1+in+the+convergent+evolution+of+salt+tolerance+in+Eutrema+salsugineum+and+Schrenkiella+parvula%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Distinct roles for SOS1 in the convergent evolution of salt tolerance in Eutrema salsugineum and Schrenkiella parvula.</a> Molecular Biology and Evolution. 31 (8), 2094-2107 (2014).</li>
<li>Clough, S. J., Bent, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Floral+dip%3A+A+simplified+method+for+Agrobacterium-mediated+transformation+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Floral dip: A simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.</a> Plant Journal. 16 (6), 735-743 (1998).</li>
<li>Koornneef, M., Meinke, D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20409266">The development of Arabidopsis as a model plant.</a> Plant Journal. 61 (6), 909-921 (2010).</li>
<li>Bai, J., Wu, F., Mao, Y., He, Y. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/protocolexchange/protocols/2769">In planta transformation of Brassica rapa and B. napus via vernalization-infiltration methods.</a> Protocol Exchange. 10, 1028(2013).</li>
<li>Sparrow, P. A. C., Goldsack, C. M. P., Østergaard, L. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/251150135_Transformation_Technology_in_the_Brassicaceae">Transformation technology in the Brassicaceae.</a> Genetics and Genomics of the Brassicaceae. , 505-525 (2011).</li>
<li>Hoagland, D. R., Arnon, D. I. <a target="_blank" href="https://archive.org/details/watercultureme3450hoag">The water-culture method for growing plants without soil.</a> California Agricultural Experiment Station Circular. 347 (347), 1-32 (1950).</li>
<li>Saiki, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer-directed+enzymatic+amplification+of+DNA+with+a+thermostable+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase.</a> Science. 239 (4839), 487-491 (1988).</li>
<li>Sun, Y., Sriramajayam, K., Luo, D., Liao, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Quick%2C+cost-free+method+of+purification+of+dna+fragments+from+agarose+gel%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">A Quick, cost-free method of purification of dna fragments from agarose gel.</a> Journal of Cancer. 3, 93-95 (2012).</li>
<li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/271968">DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).</li>
<li>Bertani, G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14888646">Studies on Lysogenesis I. The mode of phage liberation by lysogenic Eschericia coli.</a> Journal of Bacteriolgy. 62 (3), 293-300 (1951).</li>
<li>Koncz, C., Martini, N., Szabados, L., Hrouda, M., Bachmair, A., Schell, J. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/chapter/10.1007/978-94-011-0511-8_4">Specialized vectors for gene tagging and expression studies.</a> Plant Molecular Biology Manual. , 53-74 (1994).</li>
<li>Weigel, D., Glazebrook, J. <a target="_blank" href="https://europepmc.org/abstract/med/22484681">Transformation of Agrobacterium using electroporation.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (30), (2006).</li>
<li>Murray, M. G., Thompson, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+of+high+molecular+weight+plant+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation of high molecular weight plant DNA.</a> Nucleic Acids Research. 8 (19), 4321-4326 (1980).</li>
<li>Inan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salt+cress.+a+halophyte+and+cryophyte+Arabidopsis+relative+model+system+and+its+applicability+to+molecular+genetic+analyses+of+growth+and+development+of+extremophiles%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Salt cress. a halophyte and cryophyte Arabidopsis relative model system and its applicability to molecular genetic analyses of growth and development of extremophiles.</a> Plant Physiol. 135 (3), 1718-1737 (2004).</li>
<li>Ghedira, R., De Buck, S., Nolf, J., Depicker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efficiency+of+Arabidopsis+thaliana+floral+dip+transformation+is+determined+not+only+by+the+Agrobacterium+strain+used+but+also+by+the+physiology+and+the+ecotype+of+the+dipped+plant%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">The efficiency of Arabidopsis thaliana floral dip transformation is determined not only by the Agrobacterium strain used but also by the physiology and the ecotype of the dipped plant.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 26 (7), 823-832 (2013).</li>
<li>Shaohong, F. U., Xianya, W. E. I., Yingze, N. I. U., Shixing, G. U. O. <a target="_blank" href="http://gcirc.org/fileadmin/documents/Proceedings/IRCWuhan2007vol2/Biotechnology/45-49.pdf">Transformation of Brassica napus with the method of floral-dip.</a> Biotechnology: Genomics and Its Applications. , 45-49 (2005).</li>
<li>Li, J., Tan, X., Zhu, F., Guo, J. <a target="_blank" href="http://www.ccsenet.org/journal/index.php/ijb/article/view/4778">A rapid and simple method for Brassica napus floral-dip transformation and selection of transgenic plantlets.</a> International Journal of Biology. 2 (1), 127(2010).</li>
<li>Li, H. Q., Xu, J., Chen, L., Li, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+an+efficient+Agrobacterium+tumefaciens-mediated+leaf+disc+transformation+of+Thellungiella+halophila%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Establishment of an efficient Agrobacterium tumefaciens-mediated leaf disc transformation of Thellungiella halophila.</a> Plant Cell Reports. 26 (10), 1785-1789 (2007).</li>
<li>Wu, G., Rossidivito, G., Hu, T., Berlyand, Y., Poethig, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traffic+lines%3A+New+tools+for+genetic+analysis+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Traffic lines: New tools for genetic analysis in Arabidopsis thaliana.</a> Genetics. 200 (1), 35-45 (2015).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

מצב פיזיולוגי של הצמח משפיע באופן משמעותי את היעילות של טרנספורמציה25. שימוש בצמחים בריא וחסון לשינוי היא דרישה מרכזית לשינוי מוצלח ב ס parvula. מים או צמחים הדגיש האור יהיה פחות פרחים לעומת הצמחים בריא אידיאלי עבור טרנספורמציה (איור 1, במרכז החלונית). Parvula ס יכול לגדול על עוצמת האור פחות מ-130 µmol m s-2 -1, אבל הצמחים נוטים להיות frailer; צמחים כאלו יוביל יותר בוטלה פרחים בעקבות פרחוני-מח ש. ס parvula נוטה לבטל טבו...

ב פרוטוקול זה, אנו מתארים את הצמיחה ואת הקמת קווי הטרנסגניים יציבה עבור דגם extremophyte Schrenkiella parvula. הזמינות של מערכת יעילה השינוי מהווה סימן היכר של כל דגם גנטי רב תכליתי. צמחים לשגשג בסביבות קיצוניות, התייחס כמו extremophytes, לספק משאב קריטי להבנת צמח עיבודים מושם סביבתיים. Schrenkiella parvula (לשעבר Thellungiella parvula , Eutrema parvulum) הוא אחד דגם extremophyte כזה, עם הרחבת משאבי גנומית1,2,3,4,5. עם זאת, השינוי פרוטוקולים לא עדיין דווחו עבור ס parvula במחקרים שפורסמו.
הגנום של parvula ס הוא הגנום extremophyte שפורסמו הראשון ב מצליבים (חרדל-כרוב משפחה) ומראה של synteny גנום הכוללת נרחב עם המודל הלא-extremophyte, תודרנית לבנה1. לכן, מחקרים השוואתיים בין לבנה א ס parvula יכול להפיק תועלת העושר של מחקרים גנטיים מתבצע על לבנה א לעשות השערות אינפורמטיבי על איך הגנום S. parvula יש התפתחו ומוסדרת אחרת להתמודד עם קיצוני סביבתי מדגיש5,6,7. ס parvula היא אחת ביותר מלח-סובלנית מינים (מבוסס על אדמת NaCl LD50) בין קרובי משפחה פראי ידועה של לבנה א8. בנוסף הסובלנות NaCl, ס parvula שורד, משלים את מחזור החיים שלו בנוכחות יונים מרובים מלח בריכוזים גבוהים רעיל צמחים רוב7. בתגובה הלחצים והאביוטיים שכיחה בבית גידולו הטבעי, זה התפתח תכונות שונות, ביניהם כמה נחקרו ביוכימית או פיזיולוגיים רמה 8,9,10, 11.
מאז 2010, היו מעל 400 פרסומים עמיתים-reveiwed ס parvula כמין היעד או השתמש בה השוואה עם הגנום צמחים אחרים. עם זאת, צוואר בקבוק ברור יכול להיות מזוהה עם מבט מקרוב של איזה סוג של מחקרים נערכו. הרוב המכריע של דוחות אלה לדבר על פוטנציאל השימוש parvula ס במחקרים עתידיים או להשתמש בו השוואתי גנומית או לימודים phylogenomic. בגלל העדר פרוטוקול הוכחה הרעיון טרנספורמציה הוקמה עבור S. parvula, זה לא נעשה שימוש במחקרים גנומית פונקציונלי, למרות שיש לאחד הגנומים הצמח באיכות הגבוהה ביותר זמין עד כה (> 5 מגהבייט contig N50) התאספו ו מבואר pseudomolecules ברמת כרומוזום1.
השיטה בתיווך Agrobacterium טרנספורמציה פרחוני-מח ש הפך השיטה באופן כללי ביותר בשימוש כדי ליצור קווים trasngenic לבנה א, הפיתוח של מערכת לשחזור של השינוי היה גורם קריטי להצלחתו בתור מודל גנטי12,13. עם זאת, לא כל המינים מצליבים הוכחו להיהפך בהצלחה באמצעות השיטה פרחוני-מח ש שפותחו עבור לבנה א. . במיוחד, המין השני לשושלת מצליבים הכוללים parvula ס כבר הסרבן פרחוני-מח ש טרנספורמציה המבוססת על שיטות14,15.
ההרגל צמיחה פריחה ייווצרו ס parvula, בשילוב עם מורפולוגיה עלים צרים שלה עשה את זה מאתגר לאמץ את השיטה טרנספורמציה פרחוני-מח ש בתיווך Agrobacterium רגיל. במחקר זה, אנו מדווחים על פרוטוקול ששונה שפיתחנו לשינוי לשחזור ס parvula.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>VWR International, Radnor, PA</td><td>90000-762</td><td>Bacto Agar Soldifying Agent, BD Diagnostics</td></tr><tr><td>B5 ויטמינים</td><td>סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, MO</td><td>G1019</td><td>Gamborg' s Vitamin</td></tr><tr><td>Solution Desiccant</td><td>W A Hammond Drierite, Xenia, OH</td><td>22005</td><td>מציין DRIERITE 6 mesh</td></tr><tr><td>וקטור יעד לטרנספורמציה של צמחים</td> וקטור <td>TAIR</td><td>:6531113857</td><td>pKGWFS7</td></tr><tr><td>קובטת אלקטרופורציה</td><td>ארה"ב Scientific</td><td>9104-5050</td><td>קובטת אלקטרופורציה, מכסה עגול, פער של 0.2 ס"מ</td></tr><tr><td>מעבדות BIO-RAD, הרקולס, קליפורניה</td><td></td><td>1652100</td><td>MicroPulser Electroporator</td></tr><tr><td>חרוזי דשן</td><td>Osmocote Garden, Marysville, OH</td><td>N / A</td><td>Osmocote מזון צמחי לשחרור חכם&nbsp; פרח & </td></tr><tr><td>ערכת מיצוי ג'ל</td> צמחי <td>iNtRON Biotechnology, בוסטון, MA</td><td>17289</td><td>MEGAquick-spin ערכת טיהור DNA של שבר כולל</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Sigma-Aldrich, סנט לואיס, MO</td><td>G1914-5G</td><td>Gentamicin sulfate</td></tr><tr><td>Glufosinate-ammonium (11.3%) קוטל עשבים (BASTA)</td> <td>Bayer מדעי הסביבה, Montvale, NJ</td><td>N/A</td><td>Finale קוטל עשבים</td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>VWR International, Radnor, PA</td><td>200004-444</td><td>Kanamycin monosulfate</td></tr><tr><td>MES</td><td>Bioworld, Dublin, OH</td><td>41320024-2</td><td>MES, Free Acid</td></tr><tr><td>MS salt</td><td>MP Biomedicals, Santa Anna, CA</td><td>092621822</td><td>תערובת מלח הבסיס השונה של Hoagland</td></tr><tr><td>N6-benzylaminopurine (BA)&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, MO</td><td>B3274</td><td>6-תמיסת בנזילמינופורין</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>סיגמא-אלריך</td><td>S7653</td><td>נתרן כלורי</td></tr><tr><td>חומר ניקוי לא יוני</td><td>סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, MO</td><td>9005-64-5</td><td>TWEEN 20&nbsp;</td></tr><tr><td>ערכת בידוד פלסמיד</td><td>Zymo Research, Irvine, CA</td><td>D4036</td><td>ערכות פלסמיד Zyppy</td></tr><tr><td>ערכת תערובת אנזים רקומבינאז Life</td><td>Technology</td><td>11791-020</td><td>Gateway LR Clonase II תערובת אנזים</td></tr><tr><td>Rifampicin</td><td>Sigma-Aldrich, סנט לואיס, MO</td><td>R3501-1G</td><td>Rifampicin, אבקה, 
&#8805; 97% (HPLC)</td></tr> <tr><td>חממת טלטול</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA</td><td>SHKE4450</td><td>MaxQ 4450 Benchtop Orbital Shakeers</td></tr><tr><td>תערובת אדמה</td><td>Sun Gro</td><td>SUN239223328CFLP</td><td>Sun Gro Metro-Mix 360 Grower Mix</td></tr><tr><td>Spectinomycin</td><td>VWR International, Radnor, PA</td><td>IC15206705</td><td></td></tr><tr><td>צינורות חרוטיים סטריליים 50 מ"ל</td><td>USA Scientific, Ocala, FL</td><td>1500-1811</td><td>50 מ"ל צינורות בורג חרוטיים, קופולימר, מתלים,</td></tr><tr><td>סוכרוז</td> סטרילי <td>VWR International, Radnor, PA</td><td>57-50-1</td><td>סוכרוז,</td></tr><tr><td>תמיסת פעילי שטח</td> ACS <td>זרעי Lehle, Round Rock, TX</td><td>VIS-02</td><td>Silwet L-77</td></tr><tr><td>ערכת שיבוט מבוססת טופואיזומראז</td><td>Life Technologies, Carlsbad, CA</td><td>K240020</td><td>ערכת שיבוט pENTR/D-TOPO, עם זריקה אחת TOP10 מוכשר כימית E. coli</td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>VWR International, Radnor, PA</td><td>90000-282</td><td>BD Bacto Tryptone, תמצית שמרים BD Biosciences</td></tr><tr><td></td><td>VWR International, Radnor, PA</td><td>90000-722&nbsp;</td><td>תמצית שמרי בקטו BD, BD Biosciences</td></tr></tbody></table>

צמח צמיחה ושינוי בתיווך agrobacterium פרחוני-מח ש של extremophyte schrenkiella parvula

Plant Growth and Agrobacterium-mediated Floral-dip Transformation of the Extremophyte Schrenkiella parvula

Schrenkiella parvula הוא extremophyte הותאם מושם והאביוטיים שונים, כולל לחצים רעילות יון מרובים. למרות באיכות גבוהה גנומית המשאבים הזמינים כדי ללמוד איך הצמחים להתאים הסביבה מדגיש, ערכו כמודל גנומיקה תפקודית, כלי הגביל היעדרה של מערכת שינוי ריאלי. ב פרוטוקול זה, אנחנו לדווח על איך ליצור יציבה הטרנסגניים ס parvula קווים באמצעות שיטת פרחוני-מח ש בתיווך Agrobacterium. לשנות את פרוטוקול טרנספורמציה המשמש לבנה א עבור התכונות הייחודיות של S. parvula, כגון של הרגל פריחה ייווצרו ותוכן שעווה epicuticular גבוהה על עלים. בקצרה, ס parvula זרעים היו מרובדת ב 4 מעלות צלזיוס למשך חמישה ימים לפני השתילה. הצמחים גדלו ב- photoperiod אור 14 h ואת כהה 10שע 130 µmol מ'-2s-1 עוצמת אור, ב- 22 ° C עד 24 ° C. 8-9 צמחים בת שבוע עם התפרחות מרובות נבחרו לשינוי. התפרחות אלה היו טבולים ב פתרון חדירה של Agrobacterium tumefaciens GV3101, נושאת את פלסמיד pMP90RK . ביצענו שני סיבובים של פרח טובלים במרווח של 3-4 שבועות כדי להגביר את היעילות טרנספורמציה. הזרעים T1 היו נאספים, יבשים במשך ארבעה שבועות במיכל עם desiccants לפני הנביטה עבור המועמד מסך טרנספורמציה קווים. התנגדות באסטה שימש למסך T1 צמחים. ריססנו את הפתרון באסטה שלוש פעמים במרווח של שלושה ימים, החל מ- שני צמחים בת שבוע כדי לצמצם את תוצאות חיוביות שגויות. מבחן טיפה באסטה בוצעה ב ששרדו צמחים בודדים כדי לזהות נכון transformants חיובי. היעילות השינוי היה 0.033%, מניב 3-4 הצמחים הטרנסגניים לכל 10,000 זרעים T1 מופצות.

פיתחנו פרוטוקול טרנספורמציה המאפשרת קציר של T0 זרעים בתוך 150 ימים, באמצעות שיטה פרחוני-מח ש שונה מזו עבור לבנה א. איור 1 מציג סיכום של ציר זמן, ס parvula צמחים המייצגים את הבמה אופטימלית עבור ביצוע השינוי דרך פרחוני-מח ש. בחרנו ס parvula צמחים עם פרחים 70 –80 בתפרחות מרובים ב- 60-80 ימים לאחר נביטה כמו השלב היעד לשינוי. מספר קטן של פרחים פתוחים או מופרית קיימים siliques בשלב זה הוסרו לפני החדירה של tumefaciens א...

שינוי בתיווך Agrobacterium באמצעות שיטת פרחוני-מח ש יכול להיות מועסק בהצלחה כדי ליצור שורות הטרנסגניים יציב של המודל extremophyte Schrenkiella parvula. אנו מציגים פרוטוקול שונה מזו עבור תודרנית לבנה, בהתחשב גידול שונים והרגלי הפיזיולוגיות של extremophyte.

צמח צמיחה ושינוי בתיווך Agrobacterium פרחוני-מח ש של Extremophyte Schrenkiella parvula

Schrenkiella parvula is an extremophyte adapted to various abiotic stresses, including multiple ion toxicity stresses. Despite high-quality genomic ...

שיטה זו, פרוטוקול טרנספורמציה לשחזור עבור Parvula Schrenkiella, יכול לעזור לענות על שאלות בתחום הגנום השוואתי ותפקודי של צמחים, במיוחד מחקרים החוקרים התאמות צמחים לסביבות קשות. טכניקה זו מאפשרת חקירות של תפקודים שגרתיים ב Parvula Schrenkiella על extremophyte מותאם לחצים מלח רב יון. הוא גם מאפשר מחקרים השוואתיים אשר גם מסתכל קרוב משפחה שלה, ההורה האם Aribidopsis Thaliana.השוואת שרנקיאלה פרבולה לארבידופסיס תאליאנה יכולה לספק תובנות על שונות בוויסות גנים ותפקוד המאפשרים התאמה ייחודית של פרבולה שרנקילה. פרוטוקול השינוי של ערבידופסיס תאליאנה כבר היה מבוסס היטב. השיטה מאפשרת כיום מחקרים השוואתיים באמצעות צמחי שרנקיאלה פרבולה מהודרים.בדרך כלל חוקרים חדשים בשיטה זו יתקשו בגלל הרגל הפריחה ומורפולוגיה עלה של צמחים Schrenkiella Parvula אשר עושים טרנספורמציה יעילה באמצעות מטבל פלורה, כמו גם את הבחירה של טרנספורמנטים אמיתיים קשה. כדי להתחיל, להשתמש קיסם רטוב להעביר על 20 כדי 25 זרעי S.Parvula על אדמה רטובה. ואז לשכבות את הזרעים בארבע מעלות צלזיוס במשך חמישה עד שבעה ימים.לאחר ריבוד, להחזיר את הזרעים לתא הצמיחה במשך שבעה עד 10 ימים. לאחר שכל השתילים נבטו, השאירו רק שתיל אחד בכל אחת מארבע הפינות ובמרכז הסירים. לגדל את הצמחים במשך שמונה עד 10 שבועות בתא הצמיחה עד שהם פורחים.ביום השינוי, בחר צמחי S.Parvula בהתאם לפרוטוקול הטקסט. השתמש מדפים ומספריים קטנים כדי להסיר את כל תפרחות מאביק כי הם כבר מתפתחים לתוך סיליק. לאחר שהצמחים מוכנים, הכינו פתרון חדירה לאגרובקטריום.לאחר מכן, לטבול את תפרחת S.Parvula בתספורת חדירת אגרובקטריום במשך 20 שניות. מוצג כאן הוא השלב המוקדם ביותר של הצמחים שניתן להשתמש בהם עבור טרנספורמציה, כל עוד סיליקות שפותחו כבר מוסרים לפני השינוי, צמחים ישנים עם פרחים נוספים ניתן להשתמש. לאחר השינוי, מניחים צמחים טבולים פרחים אופקית במגשים נקיים עם כיפות כדי לכסות את הצמחים.ואז למקם את הצמחים בחדר צמיחה חשוך במשך יום עד יומיים. מחזירים את הצמחים למצב זקוף ומעבירים אותם לחדר הצמיחה. בשבוע שלאחר מכן, לפקח על תפרחות טבולות.עשרה ימים לאחר המטבל הפרחוני הראשון, צמחי S.Parvula ימשיכו לייצר תפרחות וסיליקות חדשות. סיבוב שני של מטבל פרחוני יכול להתבצע כדי להפוך עוד יותר את תפרחות המתעוררים החדשים. לגדל את הצמחים עד זרעים להתבגר, לקצור את הזרעים סביב 21 שבועות.יבש את הזרעים במשך שבועיים עד שלושה שבועות בטמפרטורת החדר במיכל אטום מלא התייבשות. לשתול את T אחד זרעים על פי פרוטוקול הטקסט. לגדל את הצמחים עד שני עד שלושה עלים אמיתיים הראשונים לפתח.כדי לבצע את הבחירה הראשונה עבור עמידות קוטל עשבים, לדלל קוטל עשבים אמוניום glufosinate לרסס אותו על השתילים. כסו את השתילים עם הכיפות במשך הלילה. תחזיר את המגשים לחדר הגידול, ותסיר את הכיפה.המתן עד שרוב השתילים ייבחרו על ידי קוטל עשבים. כדי להתחיל את הבחירה השנייה, לזהות את הצמחים ששרדו לאחר ריסוס שלוש עד ארבע פעמים עם פתרון BASTA. לאחר גידול הצמחים במשך שבועיים עד שלושה שבועות נוספים, בחר את העלה הבוגר הגדול ביותר על כל צמח.הבא לשפשף את פני השטח של העלה בעדינות עם אצבע כדי להסיר את שכבת השעווה. ואז למקם טיפה של פתרון BASTA מדולל על העלה. לפקח על העלים שטופלו עם פתרון BASTA לסימנים של נבול עד שבוע.לבסוף בחר את הצמחים עם עלים מושפעים על ידי טיפות BASTA לניתוח נוסף. בפרוטוקול זה, S.Parvula השתנה עם אגרובקטריום בשיטת טבילה פרחונית. זיהום עם אגרובקטריום הביא הפלה של כמה פרחים.עם זאת הצמחים S.Parvula המשיכו לייצר פרחים חדשים לאחר טבילת הפרח הראשונה, והוא יכול להשתנות שוב. באמצעות בדיקות תרסיס ושחרור של BASTA, ניתן לזהות במדויק טרנספורמנטים חיוביים אמיתיים. ניתן להפחית את מספר הדגימות שנבדקו באמצעות אישור PCR.בעוד שיטה זו דומה לשינוי של Arabidopsis Thaliana, חשוב לזכור את ההבדלים בצמיחה ומורפולוגיה של שרנקיאלה Parvula. שינוי הפרוטוקול כדי לשקף הבדלים אלה הוא קריטי לשינוי מוצלח. טכניקה זו יכולה לעזור לחוקרים לחקור את האבולוציה של וריאציות גנומיות המוביל התאמות מתח מלח מרובים במודל extremophyte, שרנקיאלה Parvula.שילוב טכניקה זו עם המידע על הפונקציות של Aradopsis Thaliana, צמח נוסף הקשורים קשר הדוק שרנקיאלה Parvula. חוקרים יכולים לחקור את הווריאציות ברגולציה ובפונקציות כי אלה שני מבנים נפרדים בין שני מינים אלה. במהלך תהליך הטרנספורמציה, חשוב להכיל את כל פתרון חדירת האגרובקטריום במיכלים autoclaveable.יש לעקר ולהשליך בבטחה את כל החומרים שבאו במגע עם אגרובקטריום הכולל כפפות, טיפים לפיפיט מאקרו ומגבות נייר.

plant-growth-agrobacterium-mediated-floral-dip-transformation

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

מאמר זה ממחיש את הפרחים, טובלים...

Floral-לטבול טרנספורמציה של ארבידופסיס thaliana לבדיקת PTSO2: β-glucuronidase Gene Expression Reporter

מקור: Lee, H. et al., מערכת חלבון פלואורסצנטי ירוקה מפוצלת להדמיית אפקטורים המועברים מחיידקים במהלך זיהום. J. Vis. Exp. (2018)סרטון זה מדגים שיטה לניטור זיהום חיידקי ואספקת חלבון אפקטור בתאי צמחים באמצעות השלמת חלבון פלואורסצנטי ירוק מפוצל (sfGFP) בשילוב עם מיקרוסקופיה קונפוקלית. הגישה מאפשרת הדמיה מדויקת של טרנסלוקציה של אפקטור לציטוזול התא המארח.

ניטור זיהום חיידקי ואספקת חלבון אפקטור בתאי הצמח

בסרטון זה אנו מדגימים יצירה של צמחי ארבידופסיס טרנסגניים המבטאים טרנסגן יציב באמצעות טרנספורמציה גנטית בינארית בינארית מבוססת כרומוזומים מלאכותיים בתיווך אגרובקטריום.

טרנספורמציה גנטית בינארית חיידקית מבוססת וקטור כרומוזום מלאכותי בצמחי Arabidopsis: טכניקה ליצירת צמחים טרנסגניים עם החדרת עותק יחיד

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להפוך פשתן באמצעות Agrobacterium שינוי צמח בתיווך באמצעות פרחוני לטבול. פרוטוקול זה הוא פשוט לביצוע ולא יקר, עדיין מניב שיעור שינוי גבוה יותר מאשר בשיטות הזמינות הנוכחיות לשינוי פשתן.

טרנספורמציה הפרחוני-Dip של פשתן ( Linum usitatissimum) כדי ליצור progenies טרנסגניים עם שיעור שינוי גבוה

באמצעות pBIBAC-GW וקטור בינארי הופך ייצור הטרנסגניים צמחים עם הוספות עותק יחיד ללא פגע, תהליך קל ופשוט. . הנה, סדרה של פרוטוקולים מוצג מדריך את הקורא לאורך התהליך הטרנסגניים תודרנית מפעלים לייצור, ובדיקות את הצמחים על intactness, להעתיק מספר התוספות.

ייצור הטרנסגניים צמחים עם הוספות עותק יחיד באמצעות וקטור בינארי BIBAC-ג'י

גישות מבוססות חלבון פלואורסצנטי לפקח effectors מופרש על ידי חיידקים לתוך התאים המארחים הם מאתגרים. זאת בשל בעיית אי התאימות בין חלבונים פלורסנט ומערכת ההפרשה סוג-III. כאן, מערכת ה-GFP פיצול ממוטב superfolder משמש עבור ויזואליזציה של effectors מופרש על ידי חיידקים לתוך התא הצמח הפונדקאי.

מערכת חלבון פלואורסצנטי ירוק לדמיין Effectors מועברת בין חיידקים במהלך זיהום

כאן, אנו מציגים שני פרוטוקולים להפוך את תפוחי האדמה צמחים. הטרנספורמציה Agrobacterium tumefaciens מוביל צמח מהונדס מלאה בעוד Agrobacterium rhizogenes מייצרת הטרנסגניים שורשים שעירים יורה פראי סוג זה יכול להיות עצמי שעבר בירושה. אנחנו מכן לזהות יזם פעילות על-ידי גאס צביעת שורשים טרנספורמציה.

Agrobacterium tumefaciens , Agrobacterium rhizogenes-מתווכת טרנספורמציה של תפוחי אדמה, יזם פעילות של גן Suberin על ידי גאס Staining

כאן אנו מציגים קל להשתמש בפרוטוקולים להפקת וטיהור diterpenoid מטבוליטים דרך הביטוי קומבינטורית של אנזימים ביולוגיים ב Es chia coli או טבק benthamiana, ואחריו מוצר כרומאטוגרפי טיהור. מטבוליטים המתקבלים מתאימים למחקרים שונים כולל אפיון מבנה מולקולרי, מחקרים פונקציונלים וביואקטיביים.

גישה ניתנת להתאמה אישית לייצור אנזימטי וטיהור המוצרים הטבעיים של Diterpenoid

פרוטוקול זה מתאר את השימוש בטרנספורמציה בתיווך גידולים אגרובקטריום (AMT) לשילוב גנים בעלי עניין בגנום הגרעיני של המיקרו-אצות הירוקות Chlorella vulgaris, מה שמוביל לייצור טרנספורמנטים יציבים.

Agrobacterium tumefaciens-מתווך גנטי של מיקרו-אצות ירוקות, Chlorella vulgaris

אנו מציגים פרוטוקול יעיל ואופטימלי לטרנספורמציה בתיווך אגרובקטריה של מין דו-חיים אל-מיני, Rorippa aquatica, ללא הליכים עתירי משאבים של תרבית רקמות סטריליות. באמצעות סמן טרנספורמציה חזותי וצינור התחדשות של הכדורים נוצרו בהצלחה טרנספורמנטים קרובים לשיבוטים, ובכך קידם את המחקרים העתידיים של הסתגלות הצמח לסביבה התת-ימית.

טרנספורמציה יעילה בתיווך אגרובקטריה מבוססת רגנרציה של מין דו-חיים א-מיני, Rorippa aquatica

אנו מציגים פרוטוקול פשוט, יעיל וניתן לשכפול לטרנספורמציה בתיווך אגרובקטריום של Phytophthora palmivora, שמתאים גם ל-P. capsici.

שיטה מפושטת לטרנספורמציה בתיווך אגרובקטריום של Phytophthora palmivora

למדו את שיטת ההשרייה בפרחים להנדסה גנטית של Schrenkiella parvula באמצעות Agrobacterium. פרוטוקול זה מאפשר יצירת קווים טרנסגניים יציבים לחקר הסתגלות צמחים לסטרס מלחים רב-יוני.

צמח צמיחה ושינוי בתיווך Agrobacterium פרחוני-מח ש של Extremophyte Schrenkiella parvula

גלה סרטונים נוספים