ב חוץ גופית Assay פעילות עבור ppGpp (p) המעביר מ Clostridium difficile וטיהור

כאן, אנו מתארים שיטה לטיהור מתויג היסטידין pyrophosphokinase אנזימים וניצול כרומטוגרפיה שכבה דקה של סובסטרטים radiolabelled ומוצרים כדי assay עבור פעילות אנזימטי בתוך חוץ גופית. וזמינותו פעילות האנזים ישימה בהרחבה על כל קינאז, נוקלאוטיד cyclase או התגובה פוספור-העברת מנגנון אשר כולל נוקלאוטיד טריפוספט הידרוליזה.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח על אנזימי phosphotransfer כולל ספציפיות מצע אנזים קינטיקה תגובה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת איסוף מהיר של ערכות נתונים מרובות כי הם עקביים מאוד, המאפשר כימות חזק סטטיסטית של פעילות האנזים. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית כי איתור התגובות על לוחות TLC וכימות המינים הרדיואקטיביים בתגובות קל הרבה יותר להדגים מאשר להסביר.

בנוסף לאתה, הדגימה של ההליך תהיה אסיה פודל, סטודנטית נוספת לתואר שני מהמעבדה שלי. התחל פרוטוקול זה עם דיכוי יתר בלתי ניתן לעיכול של חלבון מתויג היסטידין כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הכן מיליליטר אחד של שף חומצה ניטילואצטית ניקל בעמודת כבידה כדי לטהר את החלבון.

יום לפני השימוש, לצייד את העמודה לילה בארבע מעלות צלזיוס עם שני מיליליטר של חיץ שיווי משקל. למחרת להביא את הטור מארבע מעלות צלזיוס לטמפרטורת החדר לפני טעינת lysate הבהיר ולתת לו לעמוד במשך כשעתיים עד שלוש שעות. לאחר מכן תן שוב את גלולת החיץ במאגר התיזה.

Sonicate התאים על קרח במשך 10 פעמים 10 שניות מרווחים, השהיה 30 שניות בין פולסים. להבהיר את lysate על ידי צנטריפוגה ב 3, 080 פעמים גרם במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס באמצעות מיקרוצנטריפוגה. הכן את lysate הבהיר עם כמויות שוות של מאגר תיזה, ולאחר מכן להחיל את lysate מוכן, הבהיר על העמודה ולאסוף את הזרימה דרך.

החל מחדש את זרימת ה-lysate המובהרת אל העמודה ואוסף את הזרימה המשנית. ואז לשטוף את העמוד עם חמישה מיליליטר של חיץ לשטוף אחד ולאסוף את הזרימה דרך. לשטוף את העמודה שוב עם חמישה מיליליטר של חיץ לשטוף שני ולאסוף את הזרימה דרך.

עכשיו להחיל שני מיליליטר של מאגר אלוטיום. לאסוף זרימה דרך בשני שברים של מיליליטר אחד כל אחד. במהלך טיהור חלבונים, הכללת מגנזיום כלורי במאגרי הטיהור, שינוי בפרוטוקול היצרן, חיונית לפעילות אנזימטית.

כדי להעריך באופן איכותי טיהור חלבונים על ידי SDS-PAGE, הפעל 20 אליקוטים מיקרוליטר של כל שברי העמודות בערימה של 4%, 10% הפעלת ג'ל פוליאקרילמיד במשך 60 דקות ב- 170 וולט. מכתימים את הג'ל בכחול קומאסי 0.1% בטמפרטורת החדר במשך חמש שעות, מתנדנדים בעדינות על נדנדה על ספסל. לאחר מכן יש לבודד את הג'ל בחומצה אצטית קרחונית של 40%-10% בטמפרטורת החדר, המתנדנדת על נדנדת הספסל.

דיאליזה שבר אלוט שני נגד חיץ דיאליזה ביחס של 200:1 באמצעות מכשיר דיאליזה מיליליטר אחד עם 20 קילודלטון משקל מולקולרי ניתוק לילה בארבע מעלות צלזיוס. לקבוע את הריכוז של דגימת חלבון דיאליזה על ידי מדידת ספיגה ב 280 ננומטר ושימוש מקדם הכחדה טוחן מחושב. יש לאחסן 100 מיקרוליטר של דגימת החלבון הדיאליזה במינוס 80 מעלות צלזיוס עד לשימוש.

לפני ביצוע התגובה, להכין PEI תאית צלחות כרומטוגרפיה שכבה דקה על ידי שטיפת אותם במים deionized. מניחים את הצלחות בתא זכוכית עם מים מזוקקים כפולים לעומק של כ 0.5 ס"מ. לאחר מתן אפשרות למים לנדוד לראש הצלחת, מוציאים את הצלחות מתא הזכוכית ומשאירים על מתלה ספסל להתייבש בן לילה.

סמן את הלוחות המיובשים שני סנטימטרים מקצה אחד עם עיפרון רך כדי לציין היכן הדגימות יוחלו על TLC. עבור דגימות שני מיקרוליטר, להחיל דגימות לא פחות מס"מ אחד זה מזה. בעת תכנון ניסויים, תמיד להשאיר נקודה אחת על כל צלחת לא משמש לשמש נתיב ריק לכמות מדגם.

כדי לבצע את בדיקת פעילות האנזים, הכן תגובות בודדות באמצעות ATP גמא P32 כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הוסף את RSH לאחר הרכיבים האחרים היו מעורבים, כמו תוספת של RSH לתערובת המכילה נוקלאוטיד יוזם את המשגיח פעילות אנזימטית. כדי לשלוט על הידרוליזה ATP מזיהום פעילות גרעין, להרכיב תגובה 10 מיקרוליטר המכיל ללא חלבון דגירה זה במקביל.

ספוט דגימות שני מיקרוליטר ב T שווה אפס ובסוף הניסוי כדי להבטיח כי ATP לא היה הידרוליזה בהיעדר חלבון. מיד עם הוספת RSH, להסיר שני microliters ולתפוות אותו על לוח PEI-תאית שכותרתו כמו T שווה מדגם אפס דקות. הדגירה את התגובה ב 37 מעלות צלזיוס, הסרת aliquots שני microliter בנקודות הזמן הרצויות.

לאחר שנאספו כל aliquots, לבצע כרומטוגרפיה שכבה דקה על ידי מילוי תא כרומטוגרפיה עם 1.5 טוחן מונובסיום פוספט לעומק של 0.5 ס"מ. לטבול את הקצה התחתון של הצלחת בממס ולאפשר את הממס לעבור לראש הצלחת על פני כ 90 דקות. מוציאים את הצלחת ממיכל הכרומטוגרפיה ומ מניחים אותה על מתלה ייבוש ספסל כדי להתייבש באוויר בן לילה.

לאחר הצלחת יבשה, לעטוף את הצלחת בסרט פלסטיק, כדי למנוע העברה של חומר רדיואקטיבי לקלטת הדמיה לנתח על ידי אוטוביוגרפיה. חשוף את צלחת PEI-תאית המכילה תגובות מופרדות לקלטת זרחן במשך ארבע שעות בטמפרטורת החדר. לאחר החשיפה, דמיין את הקלטת על זרחן.

באמצעות תוכנת דימות עם ממשק משתמש גרפי, צייר אזורים מעניינים או ROIs על-ידי בחירה תחילה באפשרות צייר מלבן ולאחר מכן השתמש בעכבר כדי לצייר ROIs מלבניים סביב נתיב שלם אחד ואת נקודות ATP ו- guanosine-tetraphosphate הכלולות בנתיב זה. השתמש בפקודות בחירה, העתקה והדבקה כדי לצייר פריטים מועתקים זהים בתוך הנתיבים האחרים כדי להבטיח שההסברים מודדים אות בתוך אזורים זהים בכל נתיב. כלול זיכרון דיסקים (ROIs) מנתיב שלא נעשה בו שימוש כדי שישמש כריק.

באמצעות ניתוח, כלים, מנהל ההשקעות, הוספת פקודות של תוכנת ההדמיה, בחר את כל ה- ROIs המצוירים על הלוח PEI-תאית. עכשיו להשתמש בפקודות לנתח, להגדיר מדידות, למדוד לכמת את עוצמת האות בתוך כל ROI ולייצא את המידות כמו spreadsheeet. בגיליון האלקטרוני, הפחת ערכי ROI ריקים מאותות ניסיוניים.

המרת הנתונים לאחוז guanosine-tetraphosphate סינתטי הוא קריטי, כי זה מבטיח כי ערכות נתונים שנאספו בימים שונים עם אצוות שונות של חלבון או גמא P32 ATP שונים הם עקביים ניתן לאסוף עבור הקפדה סטטיסטית. קריקטורה זו מדגימה כיצד אזורי עניין משמשים להגדרת נתיב המכיל את האות הרדיואקטיבי הכולל בדגימה ואת האזורים הרדיואקטיביים ATP וגואנוסין טטרפוספט מעניינים. אותות ATP ו- guanosine tetraphosphate מנורמלים לאות הכולל במקום לדווח על הערכים המוחלטים מכיוון ששגיאת צינור או ריקבון של המצע הרדיואקטיבי יכולים להשפיע על האות הכולל המדגם אך אינם משפיעים על פעילות האנזים.

מוצג כאן הוא לוח TLC בפועל של תגובה שבוצעה באמצעות RSH C.difficile מטוהרים. תגובת בקרה ללא חלבון מאפשרת כימות של הידרוליזה ATP בלתי מרושתת בעוד נתיב ריק מאפשר כימות אותות מדויק. בנקודות ATP וגואנוסין-טטרפוספט, האנזים מעביר את הפוספט הרדיואקטיבי ממצע ATP למבשר התמ"ג, ויוצר טטרה פוספט גואנוזין רדיואקטיבי.

זה מאשר כי סינתזת גואנוזה טטרפוספט putative מ C.difficile הוא אנזים פעיל. על ידי דגימת התגובה במרווחים, ניתן לראות את ההתקדמות. כאן האות הגולמי נצפה בכל נקודת זמן.

ATP הולך ופוחת וגואנוסין טטרפוספט גדל. מוצגים כאן הנתונים המנורמלים. קווי השגיאה קטנים בהרבה מכיוון שהנורמליזציה מהווה שגיאת pipetting כלשהי.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב להיזהר לא לגרד את השרף על צלחת TLC, כמו זה יכול להפריע הגירה ממס. זוהי טכניקה נגישה מאוד עם ניתוח נתונים פשוט שיכול לספק במהירות כימות חזק של פעילות האנזים. השתמשנו בו כדי לאשר כי Clostridium difficile מסנתז גואנוסין טטרפוספט, אשר מעולם לא דווח בעבר.

אל תשכח כי עבודה עם רדיואקטיביות יכול להיות מסוכן מאוד ואתה חייב לעקוב אחר הכללים של המוסד שלך לאחסון ושימוש בחומרים רדיואקטיביים בעת ביצוע הליך זה. שיטה זו יכולה לספק תובנה לתוך סינתזת גואנוסין טטרפוספט אבל זה יכול להיות מיושם גם על תגובות phosphotransfer אחרים, כולל פעילות קינאז חלבון סינתזה דיגואנילאט מחזורי.