ניתוח דיגיטלי של מעטפת חיסונית של חלבון ZW10 אינטראקציה רקמות ריאות האדם
1 במאי 2019
ZW10 (ZWINT) משתתפת במחסום הציר הmitotic ובפתוגנזה של קרצינומה. כאן, אנו מציגים מתודולוגיה של כתמים חיסוני של ZWINT ברקמות סרטן ריאות האדם, ואחריו סריקה דיגיטלית של שקופיות שלמות וניתוח תמונה. מתודולוגיה זו יכולה לספק תמונות דיגיטליות באיכות גבוהה ותוצאות אמינות.
שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בפתולוגית ואת האימונוהיסטוכימיה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי מהר מספיק וזה מייצר מדיה דיגיטלית באיכות גבוהה. התחילו בתיקון דגימת רקמת קונג ב-3 על 3 ס"מ ב-4% פרפורמלדהיד למשך 24 שעות בטמפרטורת החדר.
למחרת, לייבש את הרקמה טבילות אתנול עולה בטמפרטורת החדר, ואחריו שלושה טבילות ב 100% קסילן במשך 20 דקות לכל טיפול. לאחר טבילת הקסילן האחרונה, מניחים את הרקמה בפרפין צלזיוס של 63 מעלות למשך 30 דקות, ולאחר מכן טבילה שנייה של 45 דקות בפרפין טרי של 63 מעלות צלזיוס, ואז משנים את הפרפין פעם נוספת עבור דגירה של שעה אחת אחרונה. כאשר הפרפין התקרר, השתמש במיקרוטום סיבובי כדי לרכוש חמישה חלקים בעובי מיקרומטר של דגימת הרקמה המוטמעת בפרפין, ולוכד את החלקים על 20 שקופיות מצופות מיקרוגרם למיליליטר.
עבור dewaxing, למקם את המגלשות בתנור 65 מעלות צלזיוס במשך שעתיים, ואחריו טבילה ב dimethylbenzene במשך 15 דקות השרייה 100% קסילן במשך 15 דקות, ולאחר מכן rehydrating את המגלשות בסדרה טבילה אתנול יורד. לתיקון אנטיגן, מניחים את השקופיות בתיבה לתיקון אנטיגן ומוסיפים 300 מיליליטר של נוזל תיקון חומצת לימון לקופסה. מחממים את התיבה במיקרוגל בה הספק גבוה במשך שתי דקות, ואחריו חימום בה הספק נמוך כדי לקיים רותחים במשך שש דקות.
כאשר השקופיות התקררו לטמפרטורת החדר, לשטוף את דגימות הרקמה עם שלוש חמש דקות 0.01 PBS טוחן שוטף בשייקר סיבובי בטמפרטורת החדר. כדי לחסל את peroxidase אנדוגני, דגירה את המגלשות עם 3% מי חמצן במים מזוקקים כפול במשך 30 דקות בתיבה רטובה בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, לשטוף את השקופיות כפי שהוכח ולחבר כל כריכה לא ספציפית על כל קטע עם 100 microliters של 10% סרום עזים במשך 39 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
לאחר מכן, סמן את הרקמות עם 100 מיקרוליטרים של נוגדן אנטי ZWINT לכל שקופית בארבע מעלות צלזיוס בן לילה, ואחריו שלוש שטיפות ב- PBS טוחן 0.01. לאחר הכביסה האחרונה, הדגירה את המגלשות עם נוגדן משני מתאים במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, ואחריו שלוש 0.01 שטיפות PBS טוחן. לאחר הכביסה האחרונה, מוסיפים את המגלשות ל-300 מיקרוליטרים של DAB טרי למשך 10 דקות, ולאחר מכן שטיפה של 10 שניות עם מי ברז בטמפרטורת החדר.
דלפקים מכתימים את הרקמות בתתווית הכתמת המטוקסילין במשך שתי דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן שוטפים במי ברז במשך 15 דקות, ואז מייבשים שוב את הרקמה בטבילות אתנול עולות, ואחריהן שני טבילות של 15 דקות בקסילן בטמפרטורת החדר. לאחר טבילת האתנול האחרונה של 100%, הר את החלקים עם 15 מיקרוליטרים של 5% קסילן בתסנת חניכיים נייטרלית וכסה כל דגימת רקמה בזכוכית כיסוי. לסריקה אוטומטית של כל השקופיות של המקטעים, תחילה אפשר לשקופיות להתייבש בטמפרטורת החדר למשך 12 שעות כדי לייבש את דגימות הרקמה.
לאחר מכן, בסורק השקופיות כולו האוטומטי, בחר ברייטפילד באופן ידני והזן את ממשק הסריקה הידני. תקן את שם השקופיות ובחר נתיב אחסון עבור התמונות. קבעו את אזור הסריקה ובחרו בדוגמאות הסריקה בעזרת האפשרות 'הגדרת סף על-ידי המשתמש'.
הסף הוא כ-50 עם ערך הרחבה של 200 מיקרומטרים באזור הסריקה. קבעו את ערך מוקד הסריקה ובחרו 'מיקוד אוטומטי' ו'שכבה אחת', ולאחר מכן טען את השקופיות בתחנת העבודה והתחל את הסריקה האוטומטית. לאחר סריקת כל השקופיות, שמור את התמונות לניתוח מאוחר יותר.
כדי לנתח את התמונות של חלקי רקמת הריאה, פתח את התוכנה לניתוח תמונה היסטופתולוגי ובחר מחשב מקומי כדי לפתוח את הקובץ עם נתוני הסריקה. בחרו ברמת הזום המתאימה ולהשתמש ב'החלף מצב התאמת צבע' כדי להגדיר את הצבע לניגודיות האופטימלית, ולאחר מכן הקיפו ותנו שם לאזורי העניין בכל תמונה. לאחר מכן, תחת תוספים, בחר QC. בונה התרחישים יצץ.
בחר 'כיוונון צפיפות' והתאם את סרגל הזיהוי. התאם את רמות הניקוד עד שעוצמת הכתם של האזורים בעיגול דומה לזו של התמונות המקוריות, ואחסן את המודל ותן לו שם כקובץ חדש, ולאחר מכן החל את המודל על שקופיות אחרות ובחר ביאור נבחר כדי לאפשר לתוכנה לחשב באופן אוטומטי את ציון ה- APE עבור אזורי העניין בכל תמונה. סריקה דיגיטלית שקופיות שלמות של חלקי רקמת ריאה של גידול ורקמות שאינן גידול סמוכות של דגימות סרטן ריאות תאים שאינם קטנים מייצרת תמונות דיגיטליות באיכות גבוהה.
ציוני APE המחושבים מסוגים אלה של דגימות סרטן ריאות הם בדרך כלל גבוהים משמעותית מאלה שנקבעו עבור רקמות שאינן סרטן סמוכות. בנוסף, רמות ביטוי ZWINT בסעיפים רקמת קרצינומה של תאים קשקשיים נקבעים לעתים קרובות להיות גבוה באופן משמעותי מאלה שנמדדו דגימות רקמת abnocarcinoma. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להתכונן עם איכות גבוהה של הגידול או אזורי הגידול במהלך ביצוע סריקה פתולוגית.
בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות של המיקרוסקופיה על מנת לענות על שאלות נוספות. לא השיטה או השיטה השונה לסריקה פתולוגית. לאחר טכניקה זו סלל את הדרך לחוקרים בתחום הסריקה הפתולוגית לחקור אבחון דיגיטלי מטרת המחקר.
אל תשכח כי עבודה עם paraformaldehyde יכול להיות מסוכן מאוד אמצעי זהירות כגון מסכות תמיד יש לנקוט בעת ביצוע הליך זה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג מתודולוגיה לצביעה אימונוהיסטוכימית של החלבון ZWINT (ZW10 interacting protein) ברקמות של סרטן ריאות אנושי. הטכניקה כוללת סריקה דיגיטלית של שקופיות שלמות וניתוח תמונות, המספקים תמונות דיגיטליות באיכות גבוהה ותוצאות אמינות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- פתולוגיה
- אימונוהיסטוכימיה
רקע
- ZWINT מעורב בנקודת הבקרה של כישורי המיטוזה.
- הוא ממלא תפקיד בפתוגנזה של קרצינומה.
- הבנת ZWINT יכולה לסייע במחקר הסרטן.
- צביעה אימונוהיסטוכימית היא טכניקה קריטית בחקר ביטוי חלבונים.
מטרת המחקר
- פיתוח מתודולוגיה מהימנה לצביעה אימונוהיסטוכימית של ZWINT.
- שיפור איכות הדימות הדיגיטלי במחקרי סרטן.
- סיוע בהבנה מעמיקה יותר של תפקידו של ZWINT בסרטן ריאות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- קיבוע של דגימות רקמת ריאה ב-4% paraformaldehyde.
- דהידרציה (הסרת מים) באמצעות טבילה בסדרות עולות של ethanol.
- הטמעה בפרפין לצורך חיתוך.
- שימוש במיקרוטום סיבובי להשגת חתכים דקים.
תוצאות עיקריות
- דימויים דיגיטליים באיכות גבוהה של ZWINT ברקמות של סרטן ריאות.
- תוצאות מהימנות משיטת הצביעה האימונוהיסטוכימית.
- השלכות פוטנציאליות להבנת הפתולוגיה של הסרטן.
- ניתן להחיל את המתודולוגיה על סוגים אחרים של סרטן.
מסקנות
- המתודולוגיה שפותחה יעילה עבור אנליזה של ZWINT.
- היא מספקת כלי בעל ערך למחקר סרטן.
- מחקרים עתידיים יכולים להתבסס על טכניקה זו עבור יישומים רחבים יותר.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מתודולוגיה זו מאפשרת ניתוח בעל תפוקה גבוהה וניתן לשחזור של ביטוי חלבונים ברקמות של סרטן ריאה בבני אדם, ובכך תומכת בתיקוף מטרות ובגילוי סממנים ביולוגיים בפיתוח תרופות אונקולוגיות. דימות דיגיטלי של שקף שלם (whole-slide imaging) מקל על שיתוף פעולה בין-תחומי ועל ארכיון נתונים לטווח ארוך, ובכך מפחית שונות בדירוג היסטופתולוגי. גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי במודלים פרה-קליניים על ידי אספקת נתוני ביטוי כמותיים בעלי רזולוציה מרחבית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של דפוסי הביטוי של ZWINT ברקמות ריאה גידוליות לעומת רקמות ריאה שאינן גידוליות, כדי לתמוך בבדיקת היפותזות טיפוליות.
- ערך תפעולי: מספק מדדי APE כמותיים וסטנדרטיים המפחיתים את הסובייקטיביות בהערכה אימונוהיסטוכימית.
- ערך ניבוי: תומך בסטריפיקציה של ביומרקרים על ידי זיהוי ביטוי דיפרנציאלי בתתי-סוגים של קרצינומה של תאי קשקשת לעומת אדנוקרצינומה.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: מייצר מאגרי נתונים של תמונות דיגיטליות הניתנים לשחזור, המתאימים לתהליכי אופטימיזציה של בדיקות ותיקוף נוגדנים.
- ערך תפעולי: מאפשר ניתוח מרובה (multiplex) ובחינה בו-זמנית על ידי מספר פתולוגים, ובכך משפר את המהימנות הבין-שופטים.
- יכולת הרחבה: מקל על עיבוד אצוות של שקופיות צבוע עבור קמפיינים של סריקה רחבה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מקשר נתוני ביטוי משלב הגילוי למודלים פרה-קליניים באמצעות מדדים עקביים וכמותיים.
- הסרת סיכונים מכניסטית: מבהירה את תפקידו של ZWINT בשיבוש נקודת הבקרה של הציר המיטוטי בתהליכי הפתוגנזה של סרטן ריאה.
- קידום מותאם סיכון: תומך בהחלטות go/no-go על ידי אספקת ספי ביטוי אובייקטיביים הקשורים לאזורים היסטופתולוגיים.
שילוב זרימת עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מאימות המטרה ועד לפיתוח פרה-קליני, על ידי אספקת תוצרי אימונוהיסטוכימיה סטנדרטיים וכמותיים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבירור מסלולים ובאישור מטרות באמצעות מיפוי ביטוי חלבונים ברזולוציה מרחבית ברקמות רלוונטיות למחלה.
- סריקה: מאפשרת מוכנות של בדיקות באמצעות פרוטוקולי צביעה הניתנים לשחזור וניתוח דיגיטלי של תמונות המתאים להערכת השפעת תרכובות.
- אנליטיקה: מספקת ציוני APE כמותיים ומדדי עוצמה המאפשרים השוואה סטטיסטית בין תנאים ניסיוניים.
- מחקר תרגומי: מקשר ממצאים אימונוהיסטוכימיים להמשכיות פרה-קלינית באמצעות דירוג סטנדרטי המיושם במודלים של קסנוגרפט או אורגנואידים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס תהליכון (pipeline) של פתולוגיה דיגיטלית לשימוש חוזר עבור ניתוח חלבונים אונקוגניים במגוון אינדיקציות לסרטן.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מעלה את רמת הביטחון בתיקוף המטרה באמצעות מדידות אובייקטיביות וניתנות לכימות של ביטוי חלבונים.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות והסטנדרטיזציה בין אתרים באמצעות ארכיון דיגיטלי וכיול צבע עקבי.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי פורטפוליו על ידי הפחתת אי-הוודאות הביולוגית בפרופילי ביטוי של מטרות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעוד ותיעדוף מטרות מותאם סיכונים, המבוסס על נתוני ביטוי חסונים בעלי רזולוציה מרחבית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות באימונוהיסטוכימיה, פתולוגיה ותוכנה לניתוח תמונות דיגיטליות.
- תלוי בהכנה איכותית של הרקמה ובשקיפות של סרט דגימה ללא ארטיפקטים של חומר איטום.
- מחייב סימון של אזורים על ידי פתולוג כדי להבדיל בין אזורי גידול לאזורים שאינם גידולים.
- דורש בקרה קפדנית על שחזור הצבעים במהלך סריקת השקף המלא (whole-slide scanning) כדי להבטיח כימות מדויק של העוצמה.
- מוגבל על ידי הצורך באופטימיזציה של טיטרציה לנוגדנים ותנאי חסימה (blocking) כדי למזער קישור לא ספציפי.
