אלקטרודה מיקרו-אגר מלח גשר ניתוח שיעור תחלופה פרוטון של חלבוני ממברנה רקומביננטי
7 בינואר 2019
ב מדידות אלקטרופיזיולוגיות, הנוכחות של דיפוזיה פוטנציאליים מפריע את המידה המדויקת של הפוטנציאל הפוכה על ידי שינוי האלקטרודה פוטנציאליים. באמצעות גשר המלח מיקרו-אגר, ההשפעה של פעפוע פוטנציאליים ממוזער, מה שמאפשר מדידה מדויקת יותר של המצע מספרים תחלופה של חלבוני ממברנה רקומביננטי משוקם.
שיטה זו יכולה לעזור עם חקירה של חלבוני קרום כגון מובילים וערוצים. המידע על אובדן שיעור תחלופת מצע המשווה בין פעילות החלבון וספנטיות לבין התנאים הפיזיולוגיים והפתולוגיים השונים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא ממזערת וריאציית הזזה פוטנציאלית ותנאי חיץ חופשיים של כלוריד.
ומגדיל באופן משמעותי את הדיוק של קביעת שיעור המחזור עקב מדידות פוטנציאליות מדויקות יותר של קרום. לאסוף את האלמנטים למדרגות האגרוף. אלה כוללים שני טיפים פיפטה מיקרו נימי, להב חד ו caliper הזזה.
עבור האלקטרודה יש חוט כסף, נייר חול ותספורת אשלגן כלורי טוחנת בהישג יד. בנוסף יש אתנול ומים לניקוי ואספקת חשמל DC. המשך בעבודה עם שני הטיפים למיקרו-פיפטה.
התחל עם הקצה שיכיל את המאגר. מניחים את הטיפ השני ליד הראשון. הזז את הקצה השני, כך שכאשר יוכנס החלק הצר שלו ירחיב לפחות חמישה מילימטרים לחלק הצר של הראשון.
סמן את המיקום שבו יצורף המאגר הראשון המכיל עצה. לאחר מכן השתמש בקליפר כדי למדוד את אורך האלקטרודה של גשר המלח מיקרו אגר. השתמש בלהב כדי לחתוך את הקצה לאורך המתאים.
נקה את המשטח החתך עם אתנול ואחריו מים. לאחר מכן, לקבל אורך של כשמונה סנטימטרים של חוט כסף עבור האלקטרודה. נקה את החוט על מגבונים עם אתנול ואחריו מים.
לאחר הניקוי, יש להשתמש בנייר חול כדי להחליק את המשטח באורך של סנטימטר אחד בקצה אחד. חוט זה עם הקצה החלק שלו מוכן להיות מצופה אלקטרו-כימית. שים את הקצה החלק לתוך פתרון אשלגן כלורי עם הקצה השני מחובר לאספקת חשמל DC לציפוי.
כאשר מצופה, לנתק את האלקטרודה ולנקות אותו עם מים. לאחר ייבושו, לקבוע את האורך המאפשר לו לחדור את קצה נימי מיקרו עמוק ככל האפשר. חותכים את האלקטרודה מהצד הלא צותה לאורך המתאים.
עכשיו, להמשיך הלאה כדי להכין תותח מלח עם אגרוז. בבקבוק המכיל מים להמיס אשלגן כלורי ולהשתמש מערבל מגנטי כדי לסייע ערבוב. לאחר הסרת המערבב מוסיפים אגרוז לבקבוקון.
קח את הבקבוק למיקרוגל וחום אותו כדי להמיס את אגוארו על 100 מעלות צלזיוס. מוציאים את זה כדי לבדוק ויזואלית שהאגרוז מומס לחלוטין. ברגע שהתעוררות מומסת פיפטה 10 microliters לתוך המיקרו נימי לאט כדי למנוע בועות אוויר.
חשוב לצנרת בזהירות את תותח מלח אגר לתוך קצה נימי מיקרו, במיוחד בריכוזי אגר גבוהים. אם לא נעשה כראוי בועות אוויר מיוצרים בקלות בקצה לחסום זרימה חשמלית. לאחר הסרת הקצה מן פיפטה לדחוף את האלקטרודה לתוכו.
ודא שהאלקטרודה חודרת לתסתר המלח. כאשר האלקטרודה היא בטמפרטורת החדר לחבר אותו באלקטרודה התייחסות לתוך מגבר. תמיכה באלקטרודה הפניה כך שניתן יהיה להוריד אותו לתוך מיכל פלסטיק עם מיליליטר אחד של חיץ.
לאחר מכן, טובלים את האלקטרודה של גשר המלח לתוך הפתרון. יש למרוח מתח ולבדוק שיש תגובה עדכנית לפני שתמשיך. אם הבדיקה מוצלחת, נתק את האלקטרודות.
במידת הצורך, לאחסן את האלקטרודה גשר מלח על ידי טבילת אותו בתספורת אשלגן כלורי טוחן שלוש. לאחר מכן, הכינו את המאגר המכיל קצה פלסטיק. קח קצה נימי מיקרו ולזהות נקודה שני סנטימטרים מהחלק הצר.
השתמש בחוט חימום כדי לכופף את הצינור 90 מעלות במצב זה. עם סכין חדה לחתוך את הצינור חמישה מילימטרים מהכופף. נקה את האזור שנחתך עם אתנול ואחריו מים.
לפני שתמשיך, השתמש במיקרוסקופ אור עם סולם כדי למדוד את קוטר החור בקצה. לאחר מכן, להזיז את פיפטה להיות ליד מיכל של ממס ועוד של חיץ. פיפטה שלושה מיקרוליטרים של הממס לתוך ומתוך הקצה.
לאחר מכן, מלא את קצה המדידה בשלושה מיקרוליטרים של חיץ. עכשיו, לאחזר את גשר המלח מתספורת אשלגן כלורי. חבר את קצה המדידה עם המאגר לאלקטרודה של גשר המלח.
חבר את האלקטרודה של גשר המלח ואת אלקטרודת הייחוס למגבר. בשלב זה, להשעות את האלקטרודה גשר מלח בתתברית החיץ עם אלקטרודה התייחסות. ייצוג התצורה עבור הניסוי נמצא בשרטוט זה.
במהלך הניסוי, הממברנה ת להיווצר בסוף המאגר המכיל פיפטה. לאסוף נתונים כדי למצוא את קיבולת הממברנה. עשה זאת על-ידי החלת אות מתח משולש לסירוגין כדי ליצור תגובת זרם מלבנית לסירוגין.
לאחר מכן, מצא את היוליכות והמתח בזרם אפס. הפוך את היישום של רמפת מתח לאוטומציה הנעה בין מינוס 50 ל-50 מילי-וולט והקליט את הזרם. התאם פונקציה ליניארית לנתונים.
השיפוע הוא ההי מוליכות, יירוט ה-x הוא המתח בזרם אפס. כאשר נעשה להסיר את קצה המדידה מגשר המלח. מלאו קצה מדידה חדש במאגר, התאימו אותו לערך pH שונה כדי להגדיר מעבר צבע של פרוטון לאורך הממברנה.
להקים מחדש את הגדרה ניסיוני עם קצה מדידה חדש אלקטרודות על מנת לחזור על המידות. להלן הקלטות מתח זרם מייצגות בנוכחות שיפוע pH. ובהיעדר שיפוע pH.
הקווים מייצגים התאמה ליניארית לנתונים. ההסטה בנקודת ההצטלבות של ציר ה- x עבור ערכי ה- pH השונים נחזית על-ידי משוואת Nernst. נתונים אלה מייצגים את השינוי בפוטנציאל הממברנה בזמן לאלקטרודה כלוריד כסף סטנדרטית בלבן, ואת אלקטרודה גשר מלח מיקרו אגר בשחור.
האלקטרודה של גשר המלח אגר הייתה יציבה יותר עם תזוזה מקסימלית של פחות מחמישה מילי-וולטים במשך 300 שניות של מדידה. בעלילה זו של השינוי הפוטנציאלי כפונקציה של שיפוע pH שני האלקטרודות נתפסים להתנהג באופן שונה באופן משמעותי כמו שיפוע pH עולה. ניתן למצוא את שיעור תחלופת הפרוטון ולהושוות אותו לשני סוגי האלקטרודות.
להלן מספרי מחזור פרוטון שנקבעו עבור חלבון מיטוכונדריאלי בלתי מפריד UCP1 אחד נמדד על ידי האלקטרודה גשר מלח לעומת אלקטרודה סטנדרטית. יש גם נתונים עבור UCP3 שהוכן באופן דומה. התעריפים נראים מדויקים יותר עם האלקטרודה גשר מלח אגר.
בעת ניסיון הליך זה חשוב לזכור כי האלקטרודה חודרת את תותח מלח אגר. גשר המלח חייב גם לטבול לתוך פתרון החיץ. לבסוף, ודא כי תסנון מלח אגר אינו מכיל בועות אוויר.
סקירה כללית
מחקר זה מתמקד במינימום של הפרעות פוטנציאל דיפוזיה במדידות אלקטרופיזיולוגיות של חלבון ממברנה באמצעות גשר מלח של מיקרו-אגר. שיטה זו משפרת את דיוקן של מדידות תחלופת substrat בחלבוני ממברנה רקומביננטיים ששוחללו מחדש.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- אלקטרופיזיולוגיה
- ניתוח חלבוני ממברנה
- פיתוח שיטות ניסיוניות
רקע
- מדידות אלקטרופיזיולוגיות רגישות לפוטנציאלי דיפוזיה.
- מדידות מדויקות הן קריטיות להבנת התפקוד של חלבוני ממברנה.
- קצבי תחלופה מספקים תובנות לגבי הפעילות והספציפיות של החלבון.
- תנאי בופר נטולי כלוריד הם מועילים במדידות אלו.
מטרת המחקר
- פיתוח טכניקה להפחתת השונות בהסטת הפוטנציאל.
- מתן אפשרות למדידה מדויקת של שיעורי תחלופת חלבוני ממברנה.
- חקירת התנהגותם של חלבוני ממברנה תחת תנאים שונים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הפלטפורמה המרכזית כוללת בנייה של אלקטרודת גשר מלח מגאגר מיקרוסקופי.
- הניסויים עושים שימוש בקצות פיפטאט מיקרו-קפילריות ובאלקטרודות של תיל כסף בתמיסות בופר.
- שלבים חשובים כוללים הכנת תמיסות מלח של agarose וביצוע ציפויים אלקטרוכימיים.
- איסוף הנתונים כולל הפעלת רמפות מתח ומדידת תגובות זרם.
תוצאות עיקריות
- גשר המלח ממיקרו-אגר הפגין יציבות מוגברת עם הסטות פוטנציאל מינימליות לאורך זמן.
- ניתוחים השוואתיים חשפו הבדלים בשיעורי תחלופת הפרוטונים בין סוגי האלקטרודות.
- הנתונים תומכים בשימוש בשיטה זו למדידות מדויקות של פוטנציאל ממברנה.
מסקנות
- מחקר זה מדגים כי גשר מלח של מיקרו-אגר משפר את הדיוק של מדידות אלקטרופיזיולוגיות.
- הטכניקה עשויה להוביל להבנה משופרת של תפקודי חלבוני ממברנה.
- להתקדמויות אלו יש השלכות על חקר תהליכים תאיים ומודלים פוטנציאליים של מחלות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מדידה מדויקת של שיעורי תחלופת חלבונים ממברנתיים היא קריטית לתיקוף יעדים בתהליך גילוי תרופות, שכן היא מאפשרת השוואה אמינה של פעילות חלבונים תחת תנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים. אלקטרודת גשר מלח מיקרו-אגר (micro-agar salt bridge electrode) מפחיתה ארטיפקטים של פוטנציאל דיפוזיה, ובכך משפרת את הדיוק במבחנים אלקטרופיזיולוגיים המשמשים להפחתת סיכונים של היפותזות מכניסטיות. התקדמות זו תומכת בביטחון ניבוי בשלבים מוקדמים של הגילוי על ידי ייצוב מדידות פוטנציאל ממברנה עבור טרנספורטרים ותעלות רקומביננטיים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינת השערות טיפוליות על ידי כימות קצבי תחלוף הפרוטונים של נשאי מיטוכונדריה כגון UCP1 ו-UCP3.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות פוטנציאל אלקטרודה יציב, ובכך מפחית את השונות בתיקוף של מטרות תפקודיות.
- ערך חיזוי: משפר את רמת הביטחון בזיהוי מועמדים מובילים (lead identification) על ידי אספקת מדידות בר-שחזור של תחלוף סובסטרט לאורך מדרגי pH.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מוכנות הבדיקה: מכין מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף עבור זרימות עבודה המשך, על ידי מזעור השונות הפוטנציאלית בהסחה בתנאי בופר ללא כלוריד.
- שחזור: משפר את הסטנדרטיזציה של מערכי אלקטרופיזיולוגיה, ומאפשר שימוש חוזר וניתן להרחבה בפלטפורמה עבור יעדי חלבוני ממברנה שונים.
- פלט כמותי: מקל על הערכה מהימנה של תרכובות באמצעות מדידות מדויקות של פוטנציאל הממברנה והתאמת מוליכות לינארית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: תומך בהפחתת סיכונים מכניסטית על ידי מתן אפשרות להשוואה של קצבי תחלופת פרוטונים בווריאנטים של חלבוני ממברנה הקשורים למחלה.
- המשכיות תרגומית: מקשר בין בדיקות תפקודיות בשלב הגילוי לוולידציה פרה-קלינית באמצעות קריאות אלקטרופיזיולוגיות יציבות וניתנות לשחזור.
- קידום מותאם סיכונים: מסייע במיון תיק הפיתוח על ידי אספקת נתונים על קצב התחלופה המשקפים את פעילות החלבון בתנאים פתופיזיולוגיים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות ועד לזיהוי מובילים (leads), כאשר מדידה מדויקת של קצב התחלופה מנחה את בחירת המטרה ואת האופטימיזציה שלה.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבדיקת השערות ובבירור נתיבים על ידי מתן אפשרות להערכה מדויקת של פעילות הובלה אלקטרוגנית בחלבונים ממברנתיים רקומביננטיים.
- סריקה: משפרת את המוכנות והשחזוריות של הבדיקה באמצעות פוטנציאל אלקטרודה מיוצב, ובכך מפחיתה רעשים בהקלטות זרם-מתח.
- אנליטיקה: מספקת מדידות כמותיות של פוטנציאל ממברנה ומוליכות המאפשרות השוואה של פעילות חלבונים בין תנאים ניסיוניים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשרת לעבודות פרה-קליניות על ידי אספקת נתוני קצב תחלופה המנבאים את תפקוד החלבון בהקשרים פיזיולוגיים טבעיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת יכולת אלקטרופיזיולוגית הניתנת לשימוש חוזר עבור מספר מטרות של חלבונים ממברנתיים, ובכך מפחיתה פיתוח כפול של בדיקות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזוי בתיקוף המטרה, הפחתת עמימות מכניסטית בבדיקות תעתוק אלקטרוגניות.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה, הדירות ויכולת הרחבה של מדידות פוטנציאל ממבנה בין מעבדות שונות.
- ערך אסטרטגי: קבלת החלטות משופרת לגבי המשך התקדמות (go/no-go), יעילות הון והפחתת סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים באמצעות הפחתת סיכונים תפקודית מוקדמת.
- השפעה על הפורטפוליו: תיעדוף והחלטות קידום מותאמות לסיכון, המבוססות על השוואות מדויקות של קצב מחזור (turnover rate).
שיקולי יישום
- דורש מומחיות באלקטרופיזיולוגיה, מיקרו-פבריקציה והכנת תמיסות אגרוז כדי למנוע היווצרות בועות אוויר.
- תלוי בציוד הכולל ספק כוח DC, מגבר, פיפטות מיקרו-קפילריות וחוטי כסף לציפוי אלקטרודות.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי ייצור גשרי מלח והחדרת אלקטרודות כדי להבטיח עקביות במדידות.
- כולל שיקולי התאמה למערכות שונות של חלבוני ממברנה, במיוחד בכל הנוגע להרכב הבאפר ולהקמת מדרג pH.
- מגבלות מעשיות כוללות את הצורך בפיפטור קפדני למניעת בועות אוויר בתמיסת המלח של האגר, שעלולות לחסום את הזרימה החשמלית.
שאלות נפוצות בביו-פרמה
Chapters in this video
0:04
Title
0:44
Preparation of the Micro-agar Salt Bridge Electrode
5:26
Measurement of the Electrical Parameters of the Membrane Reconstituted with Recombinant Protein
6:23
Results: Comparison of Membrane Measurements Made with AgCl and Salt Bridge Electrodes
7:41
Conclusion
