Name: במחלה ישירה הזרקה של וירוסים Adeno-הקשורים רקומביננטי בעכברים מבוגרים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: למדו שיטת הזרקה תוך-חוטית ישירה של וירוסים Adeno-הקשורים בעכברים ערים לטיפול ניסיוני במחלות מערכת העצבים המרכזית כמו ALS. השיטה משתמשת בלידוקאין להערכת יעילות ההזרקה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומן על ידי מענק של חביי המחוז המחלקה של משאבי אנוש, ביטוח לאומי (CY201605), מענק של מדעי הטבע קרן של מחוז הביי (H2017206101), ואנחנו מאוד אסיר תודה ד ר על גאו Guangping, שסיפק את AAV עבור מחקר זה.

FVB/NJ עכברים התרבית במתקן בעלי חיים של מעבדה מפתח לנוירולוגיה של חביי. כל עכבר ניסויים היו שאושרו על-ידי השנייה בבית החולים של חביי רפואי אוניברסיטת ועדת האתיקה, עפ י התקנון של ניהול חיות מעבדה שיפורסמו על ידי משרד המדע והטכנולוגיה של הרפובליקה העממית של סין.
1. הכנת 20% לידוקאין הידרוכלוריד פתרון מניות
<ol><li>שוקל 2 גר' לידוקאין הידרוכלוריד. להוסיף 5-6 מ"ל של מים סטריליים, מערבולת בעדינות. להגדיל את נפח כולל של 10 מ"ל מים סטריליים.</li>
	<li>1.2 לסנן את הפתרון מניות דרך מסננים 0.2-מיקרון. Aliquot הפתרון מניות, 1 מ"ל לכל microcentrifuge 1.5 mL צינור, לאטום אותו עם סרט איטום. חנות ב 4 º C.</li>
</ol>2. לכוון את משלוח במחלה AAV בעכברים ער
<ol><li>לנגב אזור העבודה באמצעות גזה סטרילית עם 70% אתנול ולהכין את הציוד הנדרש כאמור בטבלה1.</li>
	<li>להכין µL 100 של AAVrh.10/1% הידרוכלוריד לידוקאין מורכבים על-ידי הוספת µL 95 של rAAVrh10 מניות פתרון (5 x 1012 הגנום עותקים/mL) לתוך צינור microcentrifuge µL 200 סטרילי, ולהוסיף 5 µL של 20% לידוקאין הידרוכלוריד פתרון מניות. מערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה. לאחר מכן, אחסן את הפתרון וירוס על קרח (4 ° C). הערה: µL 8 לכל העכבר4 ישמש.</li>
	<li>
הכנת את המזרק עם פתרון AAV להזרקה
	<ol>
<li>להרכיב µL 25 המילטון מזרק עם מחט 27 G, יישר את קצה המחט עם המשקל הנפחי. משופע על המזרק.</li>
		<li>צייר µL 8 עם 4 x 1010 עותקים הגנום של הפתרון וירוס לתוך המזרק בעדינות. הקפד להסיר בועות אוויר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הכנת העכבר הערה: עכברים FVB/NJ זכר או נקבה (בן 30-70 ימים) השתמשו במחקר זה. הזרקת זה הופעל בשכונה.<ol>
<li>לעקר את אזור העבודה בשכונה עם 70% אתנול. לשים את העכבר ער (זכר או נקבה, 30-70 ימים בת 13 – 20 גרם משקל) bedpiece במצב של שכיבה בשכונה. מכסים את הגוף העליון עם גזה סטרילית כדי להרגיע את העכבר להימנע ננשך.</li>
		<li>לתקן את החיה על-ידי כשתפסת כראוי, בחוזקה על המחוך באגן הירכיים שלה עם אגודל על האצבע בצד ובאמצע/לאצבע אחת בצד השני. לשמור על העור בין מחוכים האגן דו צדדיים מתוח כאשר האגודל לאצבע. החזק בעדינות על הגוף העליון של החיה עם כף היד.</li>
		<li>לגלח את הפרווה על גבו בין מחוכים האגן דו צדדיים, ולאחר מכן לחטא לפני השטח של העור עם יודיד סקראב ו- 70% אתנול מבוסס.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
במחלה הזרקת12
	<ol>
<li>להרגיש את השטח בין-חולייתי לאורך הקו האמצעי בין מחוכים האגן הדו-צדדיים עם האגודל או לאצבע של היד השנייה והקש ההזחה עם ציפורן כדי לציין את החלל בין-חולייתי L5-L6 (אתר ההזרקה).</li>
		<li>לסובב את בסיס הזנב מעט ובעדינות כדי לציין האמצע של עמוד השדרה. להתאים את המסגרת המשופעת המחט אל הראש של החיה לפני ההזרקה (שהוזכר בשלב 2.3.1).</li>
		<li>ודא כי החיות הן קבועות בחוזקה, ליישר את המחט לאורך הקו האמצעי של עמוד השדרה.</li>
		<li>את המחט בעדינות ואנכית (או להטות מעט 70 – 80°) בצומת של כניסה ולשמור המזרק במטוס sagittal המרכזית. להקטין את הזווית כ 30° באיטיות כאשר הוא מחובר לעצם, ואז להחליק את המחט לתוך המרחב בין-חולייתי. הערה: סרט ניכר הזנב פתאומי הוא סימן כניסה מוצלחת לחלל intradural. ברגע שהמחט נכנסת לשטח בין-חולייתי, ירגיש קצה המחט בחוזקה בחוזקה. המחט 27 G השתמשו במחקר זה מתאים למשלוח זה עכברים אך לא חולדות.</li>
		<li>להזריק את הפתרון וקטור (שהוזכר בשלב 2.2). להתחיל את הטיימר ולהזריק 8 µL של הפתרון וקטור במהירות של µL/4 1 ס שמור המחט כ 1 דקות לאחר סיום הלידה. לשלוף את המחט עם סיבוב עדין כדי להימנע דולף.</li>
		<li>ציון חולשה ארעית של העכבר הגפיים מיד לאחר הלידה כדי להעריך את איכות הזרקה4. הערה: התקן הוא כדלקמן4. ציון 0: חולשה; ציון 1: מינור חולשה של הגפיים האחוריות בלי הילוך חריגות; ציון 2: בינוני חולשה של הגפיים האחוריות עם ההליכה ברור חריגות; ציון 3: להשלים שיתוק של הגפיים האחוריות; ציון 4: להשלים שיתוק של הגפיים האחוריות, קוצר נשימה, חולשה מתונה של הגפיים פור; ציון 5: להשלים שיתוק של כל ארבעת הגפיים, ניכר קוצר נשימה.</li>
		<li>להזיז את העכבר בחזרה לכלוב. שחזור משיתוק.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ניקיון
	<ol>
<li>לרוקן את המזרק עם 1 מ"ל מים סטריליים. ציוד מעבדה למיין ולאסוף את כל החומרים שאינם חד פעמיות עבור עיקור בלוק. לנקות את הספסל עם 70% אתנול.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. רקמות הכנה נוגדן
<ol><li>
אוסף רקמה
	<ol>
<li>עזים ומתנגד עכברים ב 21 ימים שלאחר ההזרקה עם 3% כלורין (0.1 מ"ל של 10 גרם) עמוקות על ידי זריקה בקרום הבטן.</li>
		<li>Perfuse transcardially עם 20 מ של 0.01 M קר כקרח PBS (NaCl 147 מ"מ; 2PO NaH4 1.9 מ מ; K2HPO4 מ"מ 8.1, pH 7.4) ראשית, ואז 4% קר כקרח paraformaldehyde (ב- PBS 0.01 M) עם משאבה (10 מ ל/דקה עבור 1 דקות, ואז 5 mL/min במשך 9 דקות). התראה: Paraformaldehyde הוא מסרטנים רעילים. . להתמודד עם זה רק בשכונה fume בעת לבישת כפפות</li>
	</ol>
</li>
	<li>
דיסקציה של חוט השדרה, המוח
	<ol>
<li>לתקן את הגפיים, ראש כל בעל חיים במצב של שכיבה על קופסת קצף לכסות עם מחטי מזרקים, להתפשט ואז מסירים את העור מהראש כדי סקרום עם מספריים.</li>
		<li>קליפ הגולגולת בין העיניים, לחתוך לצד המסלול האמצעי של הגולגולת, קו אופקי על המוח הקטן, ואז לפתוח את הגולגולת לשני הצדדים.</li>
		<li>הרם את עצם העורף עם פינצטה, לפתוח את תעלת השדרה באופן דו-צדדי עם מספריים אופטלמולוגיות. לחתוך את הצלעות משני הצדדים ולהסיר את החצי העליון של חוליות בקפידה.</li>
		<li>תרים את המוח עם פינצטה מעוקל, לנתק את העצבים של בסיס הגולגולת, לאחר מכן לנתח בזהירות החוצה כל המוח ואת חוט השדרה. פוסט-לתקן את הרקמות ב 4% paraformaldehyde במשך 24 שעות ביממה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הכנת הרקמה פרוסות
	<ol>
<li>Cryoprotect המוח ואת חוט השדרה הצווארי, המותני בפתרון 30% סוכרוז למשך הלילה ב 4 º C. להטביע את הרקמה טמפרטורה אופטימלית חיתוך (אוקטובר) מתחם ומקפיאים מהר עם חנקן נוזלי.</li>
		<li>חותכים את הרקמה מיקרומטר 25 באמצעות cryostat ולאחסן הסעיפים קפוא ב- 0.01 M PBS ב 4 ° C לשימוש.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. אימונוהיסטוכימיה
<ol><li>Pretreat לתרשים ובסעיף 1% H2O2 למשך 10 דקות ולאחר מכן לשטוף ב- PBS במשך 10 דקות Incubate בפתרון חסימה המכילה 5% סרום, דטרגנט ללא יונית 0.3% ב- PBS לשעה.</li>
	<li>דגירה את הפרוסות עם נוגדנים העיקרי המקביל בן לילה ב 4 º C. לשטוף בסעיפים PBST (0.2% 20 Tween ב- PBS) במשך 30 דקות (3 פעמים במשך 10 דקות כל אחד).</li>
	<li>דגירה את הפרוסות עם נוגדן המתאים ביוטין-משני בטמפרטורת החדר במשך ה 1 לרחוץ PBST במשך 30 דקות (3 פעמים במשך 10 דקות כל אחד).</li>
	<li>דגירה הסעיפים עם זיקה ביוטין peroxidase מורכבים למשך 40 דקות, כתם עם סוכן achromogenic. הר הסעיפים על גבי שקופיות ויבש כראוי.</li>
	<li>להשרות את השקופיות אתנול נטול מים במשך 5 דקות, קסילן למשך 10 דקות, ואז לאטום את השקופיות עם מדיום הרכבה. לבסוף, תמונה השקופיות עם מיקרוסקופ מצויד עם תשלום מצמידים מכשיר (CCD)-100 x, 200 x ו- 400 x הגדלה.</li>
</ol>

<ol><li>Murlidharan, G., Samulski, R. J., Asokan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+adeno-associated+viral+vectors+in+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Biology of adeno-associated viral vectors in the central nervous system.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 7, 76(2014).</li>
<li>Lentz, T. B., Gray, S. J., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22001604">Viral vectors for gene delivery to the central nervous system.</a> Neurobiology Disease. 48 (2), 179-188 (2012).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+CNS+transduction+of+adult+mice+by+intravenously+delivered+rAAVrh.8+and+rAAVrh.10+and+nonhuman+primates+by+rAAVrh.10%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Global CNS transduction of adult mice by intravenously delivered rAAVrh.8 and rAAVrh.10 and nonhuman primates by rAAVrh.10.</a> Molecular Therapy. 22 (7), 1299-1309 (2014).</li>
<li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Single+Injection+of+Recombinant+Adeno-Associated+Virus+into+the+Lumbar+Cistern+Delivers+Transgene+Expression+Throughout+the+Whole+Spinal+Cord%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">A Single Injection of Recombinant Adeno-Associated Virus into the Lumbar Cistern Delivers Transgene Expression Throughout the Whole Spinal Cord.</a> Molecular Neurobiology. 53 (5), 3235-3248 (2016).</li>
<li>Hastie, E., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+at+50%3A+a+golden+anniversary+of+discovery%2C+research%2C+and+gene+therapy+success--a+personal+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus at 50: a golden anniversary of discovery, research, and gene therapy success--a personal perspective.</a> Human Gene Therapy. 26 (5), 257-265 (2015).</li>
<li>Hocquemiller, M., Giersch, L., Audrain, M., Parker, S., Cartier, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-Associated+Virus-Based+Gene+Therapy+for+CNS+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Adeno-Associated Virus-Based Gene Therapy for CNS Diseases.</a> Human Gene Therapy. 27 (7), 478-496 (2016).</li>
<li>Tanguy, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+AAVrh10+provides+higher+transgene+expression+than+AAV9+in+the+brain+and+the+spinal+cord+of+neonatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Systemic AAVrh10 provides higher transgene expression than AAV9 in the brain and the spinal cord of neonatal mice.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 36(2015).</li>
<li>Federic, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+spinal+motor+neuron+transduction+following+intrathecal+delivery+of+AAV9+in+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Robust spinal motor neuron transduction following intrathecal delivery of AAV9 in pigs.</a> Gene Therapy. 19, 852-859 (2012).</li>
<li>Ayers, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+and+efficient+transduction+of+spinal+cord+and+brain+following+neonatal+AAV+injection+and+potential+disease+modifying+effect+in+ALS+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Widespread and efficient transduction of spinal cord and brain following neonatal AAV injection and potential disease modifying effect in ALS mice.</a> Molecular Therapy. 23 (1), 53-62 (2015).</li>
<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+Intrathecal+Injection+of+rAAVrh10+Enhances+its+Transduction+of+Spinal+Cord+and+Therapeutic+Efficacy+in+a+Mutant+SOD1+Model+of+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Slow Intrathecal Injection of rAAVrh10 Enhances its Transduction of Spinal Cord and Therapeutic Efficacy in a Mutant SOD1 Model of ALS.</a> Neuroscience. 365, 192-205 (2017).</li>
<li>Borel, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+rAAVrh10+Mediated+SOD1+Silencing+in+Adult+SOD1%28G93A%29+Mice+and+Nonhuman+Primates%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Therapeutic rAAVrh10 Mediated SOD1 Silencing in Adult SOD1(G93A) Mice and Nonhuman Primates.</a> Human Gene Therapy. 27 (1), 19-31 (2016).</li>
<li>Fairbanks, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+delivery+of+analgesics+in+experimental+models+of+pain+and+analgesia%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Spinal delivery of analgesics in experimental models of pain and analgesia.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 55 (8), 1007-1041 (2003).</li>
<li>Hylden, J. L., Wilcox, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrathecal+morphine+in+mice%3A+a+new+technique%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Intrathecal morphine in mice: a new technique.</a> European Journal of Pharmacology. 67, 313-316 (1980).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+spinal+cord+transduction+by+intrathecal+injection+of+rAAV+delivers+efficacious+RNAi+therapy+for+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Widespread spinal cord transduction by intrathecal injection of rAAV delivers efficacious RNAi therapy for amyotrophic lateral sclerosis.</a> Human Molecular Genetics. 23 (3), 668-681 (2014).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((scAAV9-VEGF+prolongs+the+survival+of+transgenic+ALS+mice+by+promoting+activation+of+M2+microglia+and+PI3K%2FAkt+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">scAAV9-VEGF prolongs the survival of transgenic ALS mice by promoting activation of M2 microglia and PI3K/Akt pathway.</a> Brain Research. 1648, Pt A 1-10 (2016).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

טכנית, ישנם מספר שלבים קריטיים במהלך הזריקה זה בעכברים ער. ראשית, ראוי המחווה ושליטה המשרד של העכברים לאורך כל המבצע הוא תנאי מוקדם מסירה מוצלחת. שנית, הנקודה הכי קשה הוא מרגיש את החלל בין-חולייתי עם קצה המחט, כפי שנדרש לא להוסיף יותר מדי עמוק ללא התנגדות או להוסיף בכפייה תחת התנגדות חריפה במקרה של החיות או כיפוף קצה המחט. שלישית, למרות השיתוק ארעי עקב לידוקאין מספק מדד אובייקטיבי על זה הזרקת איכות, להתאמן יותר יש צורך להשיג תוצאות עקביות ומצליח.
בדו ח זה, פיתחנו שיטה הזרקה ישירה במחלה בעכברים...

AAV יכולים לתווך גנים בהעברת CNS עם מעט תופעות לוואי לטווח ארוך ונפוץ, ולכן הפך לאחד הרכבים המבטיחים ביותר עבור ריפוי גנטי לטיפול במחלות CNS כולל נוירודגנרטיביות (ALS), הנטינגטון (HD), מחלת אלצהיימר (AD), באנזימים מחלות (LSD), מחלת Gaucher (GD) מחלות ceroid עצביים lipofuscinosis (NCL)1. כיום, יותר מ-100 AAV אשר נגרמו מהזנים אליהם היה מבודד של בני האדם ובעלי החיים. בין אלה, לפחות 12 השתמשו בפרה, ניסויים קליניים, כולל הנפוץ ביותר בשימוש ג'ין וקטורים כגון AAV1, 2, 4, 5, 6, 8, 9, rAAVrh.8 ו- rAAVrh.101,2,3,4, 5,6.
מחלות מערכת העצבים המרכזית שונות דורשות אסטרטגיות שונות משלוח AAV עקב אזורים המושפעים CNS סוגי תאים שונים. CNS אזורים של התא סוגי AAV יכול מגלי משתנה בהתאם serotype כמו גם שיטת מסירה. לדוגמה, rAAVrh10 הוכח מגלי בעיקר האסטרוציטים כאשר נמסר על ידי הזרקה תוך ורידי סיסטמי (IV), ואילו זה transduced נוירונים וגם עכשיו, דונלד כאשר נמסר על ידי במחלה הזרקה4,7. בנוסף, הביאו parenchyma הזרקת התמרה חושית מקומיים כדי באזור ההזרקה, ואילו זריקה לתוך הנוזל מוחי שדרתי (CSF) דרך ע או הזרקת במחלה, גרמו CNS נפוצה של התמרה חושית8 . מחקרים גם הראו עוצמה טיפולית של טיפול גנטי המועבר AAV הפרעות ניווניות לפיו המינהל9,10,11. מחלות המשפיעות על אזורים רחבים של מערכת העצבים כגון ALS, במחלה הזרקה לתוך CSF הוכח כדי לכסות את רוב אזורים נגועים על ידי המחלה במינון נמוך, בהשוואה למשלוח מערכתית שיטה4,10. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו גם שאת המותני ניתן להזריק AAV במודלים של העכבר על ALS, אשר מונע פציעות פוטנציאליות המשויך צנתור laminectomy ולא במחלה4.
ניסיוני מותני ישירה שימש תחילה למסור סוכנים, בייחוד הרדמה, חוט השדרה שיכוך כאבים, הרדמה 188512,13. בדו ח זה, אנו ממחישים הניקוב המותני זה בשיטת הזרקת בעכברים בוגרים בסיועם של 1% לידוקאין הידרוכלוריד, מקומיים אמיד-derived הרדמה, בפתרון הזרקת להעריך, לפקח על איכות הזרקה. זריקות מוצלחות סומנו על ידי לידוקאין-induced שיתוק חולף, בעוד זריקות כושלות לא הראה התנהגות זו. אנו מסווגים את הרמה של חולשה ארעי כאחת חמישה ציונים כדי לעזור לחזות את יעילות הזרקת. לבסוף, אנו מראים כי רמת התמרה חושית rAAVrh10 עשוי להיות שמנבאת את הציון של שיתוק. לכן, שיטת העברה זו במחלה AAV יכול לשמש כדי לשפר את המסירה הגן בתיווך AAV לטיפול ניסיוני של מחלות מערכת העצבים המרכזית.

<table><tbody><tr><td>עכברי FVB/NJ</td><td>מעבדות צ'ארלס ריבר סין</td><td></td><td></td></tr><tr><td>לידוקאין הידרוכלוריד מונוהידראט</td><td>HEOWNS</td><td>73-78-9</td><td></td></tr><tr><td>AAV</td><td>ליבת וקטור ויראלי של המרכז לטיפול גנטי בבית הספר</td><td></td><td></td>לרפואה של אוניברסיטת מסצ'וסטס</tr><tr><td>25 ומיקרו; L&nbsp; מזרק המילטון/מחט 27-30 גרם</td><td>GASTIGHT</td><td>1702</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T compond</td><td>SAKURA</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>H 2O 2</td><td>SHUI HUAN PAI</td><td></td><td></td></tr> 170401 <tr><td>סרום עיזים</td><td>Solarbio</td><td>S9070</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>LIFE SCIENCES</td><td>T8200</td><td></td></tr><tr><td>ארנב אנטי-GFP</td><td>Life tech</td><td>G10362</td><td>1:333 דילול</td></tr><tr><td>הנוגדן השני (עז-אנטי ארנב)</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>111-005-144</td><td>1:1,000 דילול</td></tr><tr><td>VECTASTAIN ABC REAGENT</td><td>Vector Lab</td><td>PK-6100</td><td></td></tr><tr><td>ImmPACT DAB Peroxidase ערכת מצע</td><td>וקטור מעבדה</td><td>SK-4105</td><td></td></tr><tr><td>מדיום הרכבה לפלואורסצנטיות עם DAPI</td><td>Vectorshield</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Yong Da Chemical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4&middot; 2H2O</td><td>Yong Da Chemical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4&middot; 12H2O</td><td>יונג דה כימי</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פרפורמלדהיד</td><td>יונג דה כימי</td><td>307699</td><td></td></tr><tr><td>הדבקה מיקרוסקופ שקופיות</td><td>CITOGLAS</td><td>17083</td><td>25 מ"מ x 75 מ"מ</td></tr><tr><td>סופר-להחליק מיקרו-זכוכית</td><td>אלקטרו מיקרוסקופיה Siences</td><td>72236-60</td><td>24 מ"מ x 60 מ"מ</td></tr><tr><td>15 מ"ל צינור צנטריפוגה</td><td>קורנינג</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>96 באר אשכול תרביות תאים</td><td>Coster</td><td>3599</td><td></td></tr><tr><td>24 באר אשכול תרביות תאים</td><td>Coster</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>70% אתנול</td><td>WEN ZHI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>גזה</td><td>Wei AN</td><td></td><td>05171112 8 ס"מ x 10 ס"מ x 12 ס"מ</td></tr><tr><td>מזרק 1 מ"ל Hong</td><td>Da</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microtubes</td><td>פלזמה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרופיפט&nbsp;</td><td>eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פפט טיפים</td><td>Rainin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centirifuge</td><td>eppendorf</td><td>5427R</td><td></td></tr><tr><td>Regerator</td><td>Haier</td><td>BCD-539WT</td><td></td></tr><tr><td>מסנן</td><td>MILLEX GP</td><td>R4PA42342</td><td></td></tr><tr><td>משאבת</td><td>LongerPump</td><td>BT-100-2J/YZ1515X</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>אולימפוס</td><td>BX53</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוטום קפוא</td><td>Leica</td><td>CM1520</td><td></td></tr></tbody></table>

במחלה ישירה הזרקה של וירוסים adeno-הקשורים רקומביננטי בעכברים מבוגרים

Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice

הזרקת במחלה (IT) של adeno-הקשורים וירוס (AAV) יש עניין רב ב- CNS ריפוי גנטי מכוח את הבטיחות, noninvasiveness, והיעילות התמרה חושית מעולה שלופה מערכת העצבים. מחקרים קודמים הדגימו העוצמה טיפולית של טיפול גנטי המועבר AAV הפרעות ניווניות לפיו המינהל. עם זאת, שיעור גבוה של כשל לא צפוי עקב המגבלה הטכנית של הממשל זה חיות קטנות דווחו. . הנה, הקמנו מערכת הניקוד כדי לציין את מידת ההצלחה מותני אצל בעלי חיים קטנים על-ידי הוספת 1% לידוקאין הידרוכלוריד בתוך תמיסת הזרקה. בהמשך נראה כי מידת החולשה ארעית לאחר ההזרקה ניתן לחזות את יעילות התמרה חושית AAV. לכן, בשיטה זו זריקה זה יכול לשמש כדי למטב טיפולית ניסויים במודלים של העכבר של מחלות מערכת העצבים המרכזית מעשן יותר אזורים רחב של מערכת העצבים.

עכברים הראה דרגות שונות של חולשה חולף מיד אחרי זה הזרקה של פתרון AAV הידרוכלוריד לידוקאין 1% בשל איכות שונות של הזרקת במחלה. על פי כמותיים חצי כיתה 5 מערכת התוצאות הקמנו, בדקנו את הדפוסים התמרה חושית של AAV בעכברים עם דרגות שונות של האיבר לידוקאין-induced חולשה (ציון 0, n = 2; ציון 1, n = 1; ציון 4, n = 4; ציון 5, n = 3). EGFP immunostaining של שידרה הראה אין או קטן התמרה חושית בחוט השדרה המותני של עכברים ניקוד 0, התמרה חושית משופרת במקצת בעכברים ניקוד 1 ו transductions חזקה ונפוץ בעכברים...

כאן אנו מציגים טכניקה הזרקה ישירה במחלה באמצעות הידרוכלוריד לידוקאין 1% פתרון ויראלי להבטיח משלוח וירוס יעיל adeno-הקשורים לבעלי חיים קטנים ולהקים מערכת הניקוד לחזות התמרה חושית יעילות המרכזי מערכת העצבים על פי מידת חולשה חולפת הנגרמת על ידי לידוקאין.

במחלה ישירה הזרקה של וירוסים Adeno-הקשורים רקומביננטי בעכברים מבוגרים

Intrathecal (IT) injection of adeno-associated virus (AAV) has drawn considerable interest in CNS gene therapy by virtue of its safety, noninvasiveness, ...

שיטה זו מאפשרת אספקה תוך-פתאתקלית יעילה של מהוומני נגיפיים הקשורים לאדונו בבעלי חיים קטנים ערים לטיפול ניסיוני במחלות של מערכת העצבים המרכזית כגון ALS. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא כי הפתרון הנגיפי כולל 1%lidocaine הידרוכלוריד אשר גורם שיתוק חולף לאחר זריקה מוצלחת. למרות ששיטה זו מספקת אינדיקטור חזותי לשיפוט ההצלחה של המצב האוטומטי האינטרתתקלי, תרגול מספיק חיוני לשיפור שיעור ההצלחה של המסירה.לפני תחילת ההליך, לצרף מחט מד 27 למזרק המילטון 25 microliter וליישר את הקצה משופע של המחט עם סולם נפחי על המזרק. ואז בזהירות לטעון 8 microliters של 4 x 10 עותקים הגנום העשירי של פתרון הנגיף לתוך המזרק, דואג להימנע בועות. לאחר מכן, מניחים עכבר ער בן 30 עד 70 יום 12 עד 30 גרם על חתיכת מיטה בתקורה נוטה במכסה המנוע biosafety ולכסות את הגוף העליון עם גזה סטרילית כדי להרגיע את העכבר כדי למנוע ננשך.אחז בחוזקה בעכבר על מחוך האגן שלו עם האגודל בצד אחד והאצבע האמצעית והאצבע האמצעית בצד השני, תוך שמירה על העור בין מחוכי האגן הדו-צדדיים מתוחים עם אגודל ואצבע. לאחר מכן לגלח את הפרווה בין מחוכים האגן הדו-צדדיים ולעקר את העור החשוף עם קרצוף מבוסס יוד ו 70% אתנול. למסירה פנימית ישירה של פתרון הנגיף הקשור לאדונו, יש למחוץ את המרחב הבין חולייתי לאורך קו האמצע בין מחוך האגן הדו-צדדי ולהשתמש בציפורניים כדי לדכא כניסה לתוך העור כדי לציין את החלל הבין חולייתי L5 עד L6.סובב את בסיס הזנב מעט בעדינות כדי לחשוף את קו האמצע של עמוד השדרה ולהתאים את השיפה של המחט לכיוון ראש החיה. עם העכבר קבוע בחוזקה למקומו, ליישר את המחט לאורך קו האמצע של עמוד השדרה ולהכניס את המחט בעדינות ואנכית למרכז הכניסה שמירה על המזרק במישור קשת מרכזי. כאשר המחט באה במגע עם העצם, לאט לאט להקטין את הזווית כ 30 מעלות להחליק את המחט לתוך החלל הבין חולייתי.תנועה פתאומית בזנב היא סימן לכניסה מוצלחת לחלל התוך-טבעי. כאשר המחט נכנסת לחלל הבין חולייתי, הקצה ירגיש מהודק היטב. להזריק את הפתרון הווקטורי, ולשמור על המחט בתוך החלל התוך-עורי במשך דקה אחת.ואז לאט למשוך את המחט עם סיבוב כדי למזער את הדליפה. מיד ציון החולשה החולף של גפי העכבר כדי להעריך את איכות ההזרקה ולהחזיר את העכבר לכלוב שלה להתאוששות מן השיתוק. בנקודת הקצה הניסיונית המתאימה, לתקן את הגפיים ואת הראש של העכבר מוזרק במצב נוטה על כיסוי תיבת קצף ולהשתמש מספריים כדי להסיר את העור מהראש אל sacrum.חותכים את הגולגולת בין העיניים, חותכים לאורך קו האמצע של הגולגולת ואת הקו האופקי מעל המוח הקטן ולפתוח את הגולגולת מכל צד. השתמש פינצטה כדי להסיר את העצם העורפית ולהשתמש מספריים עיניים כדי לפתוח את תעלת עמוד השדרה דו צדדית. חותכים את הצלעות משני הצדדים ומסירים בזהירות את החלק העליון של החוליות.השתמש פינצטה מעוגלת כדי להרים את המוח ולנתק את העצבים של בסיס הגולגולת. ואז בזהירות לחלץ את המוח כולו ואת חוט השדרה ולתקן את הרקמות ב 4% paraformaldehyde במשך 24 שעות. בסוף תקופת הקיבוע, cryoprotect המוח ואת חוט השדרה צוואר הרחם המותני ב 30% פתרון סוכרוז לילה ב 4 מעלות צלזיוס ואחריו הטבעה תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית לפני הצמד הקפאה בחנקן נוזלי.לאחר מכן להשתמש cryostat כדי להשיג 25 חלקים עבים מיקרומטר של כל רקמה, אחסון החלקים הקפואים ב 0.01 PBS טוחן ב 4 מעלות צלזיוס כפי שהם מתקבלים. לניתוח אימונוהיסטוכימי של הרקמות, יש לפנות את החלקים הצפים החופשיים עם 1%מי חמצן למשך 10 דקות ולאחר מכן לשטוף 10 דקות ב-PBS. הבא דגירה הדגימות בתת פתרון חסימה המכיל 5%סרום ו 0.3% דטרגנט לא יוני ב PBS במשך שעה אחת ואחריו תיוג לילה ב 4 מעלות צלזיוס עם נוגדנים ראשוניים המתאימים של עניין.למחרת, לשטוף את החלקים עם 3 10 דקות שוטף PBS בתוספת Tween ולהדקר את המגלשות עם נוגדנים משניים biotinylated המתאים בטמפרטורת החדר במשך 1 שעה לאחר לשטוף האחרון. בסוף הדגירה, לשטוף את החלקים 3 פעמים PBST טרי כפי שהודגם רק להדגים את הדגימות עם קומפלקס פרוקסידאז ביוטין אינסוף במשך 40 דקות ואחריו כתמים עם סוכן כרומוגני המתאים. הר את החלקים המסווים על מגלשות מיקרוסקופ זכוכית להשרות את המגלשות באתנול נטול מים במשך 5 דקות לאחר החלקים רכוב התייבש לחלוטין.הבא להשרות את השקופיות קסילן במשך 10 דקות ולאטום אותם עם מדיום הרכבה מתאים. לאחר מכן דמיין את השקופיות עם מיקרוסקופ קל המצויד במטען יחד עם הגדלות של 100, 200 ו- 400 פעמים. eGFP immunostaining של חלקי רקמת חוט השדרה צוואר הרחם המותני מגלה טרנסדוקציה קטנה או ללא טרנסדוקציה בחוט השדרה המותני של עכברים עם ציון חולשה של 0, טרנסדוקציה משופרת במקצת בעכברים עם ציון חולשה של 1, ותמרים חזקים ונרחבים בעכברים עם ציון חולשה של 4 או 5.כימות עוצמת הכתמים של GFP של מקטעי רקמת חוט השדרה מעכברים המציגים דרגות שונות של חולשת גפיים ארעית מצביע על כך שחומרת החולשה לאחר הזרקת פתרון הנגיף תואמת באופן הדוק את היקף ההעתקה של חוט השדרה. במוח, אותות eGFP חזקים מזוהים בנורה חוש הריח, קליפת המוח הקדם-מצחית הגבית-מצחית, gyrus שקע, ואת אזור CA3 של ההיפוקמפוס, קליפת המוח הקטן, ואת האזורים השוליים של גזע המוח, כולל גרעין הפנים, מקלעת choroid, ואת תאי האפיתל ependymal. נוירונים מוטוריים בקרניים לפנים הם גם מתמר בחוזקה ברמות שונות של חוט השדרה.יתר על כן, בקליפת המוח, נוירונים חיוביים GFP כולל תאים פירמידליים מזוהים, כמו גם סוגים שונים של תאי גליה כולל microglia, אסטרוציטים, ו oligodendrocytes. טכניקה זו מאפשרת לחוקרים בתחום הנוירולוגיה לחקור את ההשפעות הטיפוליות של מסירה תוך-תיתטית ישירה בבעלי חיים ערים קטנים על מחלות של מערכת העצבים המרכזית.

direct-intrathecal-injection-recombinant-adeno-associated-viruses

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

כאן אנו מציגים את הזריקה תוך גולגולתי של וקטורים AAV תיוג הניאון של גליה נוירונים בקליפת המוח הראייתית.

הזרקה תוך גולגולתי של Adeno הקשורים וקטורים ויראליים

מקור: Li, D., et al. הזרקה תוך-תקלית ישירה של נגיפים רקומביננטיים הקשורים לאדנו בעכברים בוגרים. J. Vis. Exp. (2019)סרטון זה מדגים את הליך ההזרקה התוך-תקלית של נגיפים הקשורים לאדנו (AAV) לנוזל המוח (CSF) של עכבר ער, המכסה הכנת מזרק, יישור עמוד השדרה והחדרת מחט מדויקת. שיטה זו מאמתת העברת גנים ממוקדת, ותומכת בפוטנציאל שלה לטיפולים במערכת העצבים המרכזית.

העברה תוך-תקלית של וירוסים במודל עכבר לטיפול במחלות מערכת העצבים המרכזית

מקור:Pourshafie, N., et al. אספקה מערכתית של מיקרו-רנ"א באמצעות סרוטיפ 9 של נגיף רקומביננטי הקשור לאדנו, לטיפול במחלות עצב-שריר במכרסמים. J. Vis. Exp. (2018).בסרטון זה, ניוון שרירים בעמוד השדרה והבולבר או עכבר המושפע מ-SBMA עובר הזרקת וריד זנב של וקטורים רקומביננטיים AAV (וקטורים הקשורים לאדנו) הנושאים פלסמיד המקודד מיקרו-RNA טיפולי. הווקטור מייצר מיקרו-RNA שנקשר למוטציה AR (קולטן אנדרוגן)-mRNA (חומצה ריבונוקלאית שליח), מה שמפעיל את פירוקו. זה מפחית הצטברות חלבון רעיל ועוזר לשפר את התפקוד...

הזרקת וקטורים רקומביננטיים הקשורים לאדנו במודל עכבר ניוון שרירים בעמוד השדרה והבולברי

מקור: Grames, M. S., et al. שיטות וטיפים למתן תוך ורידי של נגיף הקשור לאדנו לחולדות והערכת התמרה של מערכת העצבים המרכזית. J. Vis. Exp. (2017)סרטון זה מדגים את הזרקת וריד הזנב של נגיף אדנו-קשור רקומביננטי (AAV) בחולדות. לאחר ההזרקה לווריד הזנב הרוחבי, הנגיף נכנס לזרם הדם, מסתובב דרך הלב ומגיע למוח, שם הוא נכנס לתאי עצב ומקל על ייצור חלבון מטרה ליישומים נוירותרפיים.

 מתן תוך ורידי של וקטורים רקומביננטיים של וירוסים הקשורים לאדנו במודל חולדה 

כאן אנו מדגימים טכניקה להתמרה עצבית נרחבת על ידי הזרקה תוך-חדרית של נגיף הקשור לאדנו למוח העכבר היילוד.  שיטה זו מספקת דרך מהירה וקלה להשיג ביטוי לכל החיים של טרנסגנים המועברים באופן ויראלי.

הזרקת נגיפי Intracerebroventricular של ילודים עכבר המוח לתמרה עצבית מתמשכת ונרחבת

מטרת המחקר הנוכחי הייתה לפתח ולאמת את העוצמה והבטיחות של נגיף השד הקשור ל- Adeno-9 (AAV9), באמצעות שימוש בטכניקה חדשה של מתן גנים תת-גנטי בעכברים בוגרים.

Subnial Adeno הקשורים וירוסים 9 (AAV9) וקטור משלוח ב עכברים למבוגרים

הפרוטוקול הנוכחי מתווה הוראות שלב אחר שלב לביצוע זריקות תוך-תיקליות בעכברים יילודים לצורך עריכת גנים והעברת תרופות.

הזרקה תוך-תטית של עכבר שזה עתה נולד לצורך עריכת גנום ואספקת תרופות

מתואר הליך כירורגי לביצוע זריקות לתוך בור המים המותני של החולדה הצעירה. גישה זו שימשה להעברה תוך-תאית של וקטורים של ריפוי גנטי, אך צפוי כי גישה זו תוכל לשמש למגוון טיפולים, כולל תאים ותרופות.

משלוח וקטורי תוך-תאי בחולדות צעירות באמצעות הזרקת בור מים מותני

כאן אנו מפרטים פרוטוקול אופטימלי להזרקת וריד זנב רוחבי של עכבר לניהול מערכתי של וירוס הקשור לאדנו (AAV) בעכברים בוגרים. בנוסף, אנו מתארים פרוטוקולים של בדיקות נפוצות להערכת התמרה AAV.

אספקה עקבית של וירוס הקשור לאדנו באמצעות הזרקת וריד זנב לרוחב בעכברים בוגרים

זריקה תוך-מותנית מייצגת דרך מתן רלוונטית לתרגום למתן טיפול גנטי למערכת העצבים המרכזית. פרוטוקול סטנדרטי מקיף זה לזריקות תוך-מותניות בעכברים וחולדות בילודים, צעירים ובוגרים נועד להנחות חוקרים באימוץ טכניקה זו למחקרי ריפוי גנטי פרה-קליניים.

הזרקה תוך-מותנית של וקטורים של ריפוי גנטי למיקוד מערכת העצבים המרכזית בעכברים וחולדות

מתוארת טכניקה חדשה להעברה נרחבת של נגיף הקשור לאדנו, המשתמשת בעירוי וירוס תת-עכבישי. שיטה זו לא רק מבטיחה התמרה נרחבת של נוירונים ניאו-קורטיקליים של עכברים בשכבות שטחיות, אלא גם מביאה לביטוי סלקטיבי של הטרנסגן בנוירונים פירמידליים בשכבה חמש, גם כאשר משתמשים במקדם לא סלקטיבי.

התמרה נרחבת של נוירונים ניאוקורטיקליים של עכברים על ידי הזרקה תת-עכבישית של AAV2

למדו שיטת הזרקה תוך-חוטית ישירה של וירוסים Adeno-הקשורים בעכברים ערים לטיפול ניסיוני במחלות מערכת העצבים המרכזית כמו ALS. השיטה משתמשת בלידוקאין להערכת יעילות ההזרקה.

במחלה ישירה הזרקה של וירוסים Adeno-הקשורים רקומביננטי בעכברים מבוגרים

גלה סרטונים נוספים