Name: מבנה גבישי של N-מסוף תחום של Ryanodine הקולטן של Plutella xylostella (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-30T14:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: חקור קריסטלוגרפיית קרני X לקביעת מבנה התחום ה-N-טרמינלי של קולטן Ryanodine ב-Plutella xylostella. השיטה חושפת מנגנוני פתיחת ערוץ ומספקת תבנית לפיתוח חומרי הדברה ספציפיים לסוג.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מימון עבור מחקר זה נמסר על ידי: המחקר מפתח הלאומי, פיתוח תוכנית של סין (2017YFD0201400, 2017YFD0201403) הלאומי הטבע מדעי היסוד של סין (31320103922, 31230061), תוכנית פרוייקט של נבחרת מחקר בסיסי (973) סין (2015CB856500, 2015CB856504). אנחנו אסירי תודה לצוות על הפרעות לקרן החלקיקים BL17U1-מתקן קרינה סינכרוטרון שנגחאי (SSRF)

1. ג'ין שיבוט, ביטוי חלבונים וטיהור
<ol><li>PCR להגביר את הדנ א המתאים חלבון עניין (1-205 שאריות DBM RyR, Genbank בדיקת. לא. AFW97408) ולשכפל לתוך pET-28a-HMT וקטורי מצדו שאינו תלוי שיבוט בעצימות25. וקטור זה מכיל תג היסטידין, תג MBP, אתר המחשוף פרוטאז אס-אמיני15-
	<ol>
<li>עיצוב תחל LIC עבור הגברה של היעד גנים עם LIC תואמי 5' הרחבות: LIC פריימר לפנים: 5' TACTTCCAATCCAATGCAATGGCGGAAGCGGAAGGGG 3' הפוך LIC פריימר: 5' TTATCCACTTCCAATGTTATTATATGCCGGTCCCGTACGGC 3'</li>
		<li>שילוב הרכיבים התגובה (50 μL): μL 1 של ה-DNA תבניות (100 ng/μL), μL 1 של פריימר לפנים (10 μM), μL 1 של פריימר הפוכה (10 μM), 0.5 μL של ה-DNA פולימראז (נב), 5 μL של תגובה 10 x מאגר, μL 1 של dNTP (25 מ מ) , 40.5 μL של RNase חינם ddH2O.<ol>
<li>מניחים את תערובת התגובה במכונת ה-PCR ולהפעיל את התוכנית הבאה.</li>
			<li>דגירה ב 95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות ולאחר מכן הפעל 30 מחזורי (95 ° C ל 30 s, 58 ° C 15 s, 72 מעלות צלזיוס במשך 1 דקה). דגירה ב-72 מעלות למשך 5 דקות ולאחר מכן החזק ב 4 º C.</li>
			<li>להפעיל את תערובת התגובה כולה (50 μL) על 2% agarose ג'ל ולחלץ בעזרת ערכת חילוץ ג'ל. פעלתי לפי הנהלים של היצרן</li>
		</ol>
</li>
		<li>מצדו תלויית שיבוט (LIC)<ol>
<li>לבצע SspI עיכול (60 μL): 20 μL של וקטור דנ א (50 ng/μL), μL 6 של 10 x תגובת מאגר, μL 4 של SspI ו 30 μL של ddH2O. Incubate ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 ח' להפעיל את התגובה כולה לערבב על 1% agarose ג'ל, לחלץ עם ערכת חילוץ ג'ל. פעלתי לפי הנהלים של היצרן</li>
			<li>לבצע טיפול T4 DNA פולימראז של וקטור והכנס את הדנ א. לשלב הבא: 5 μL של ה-DNA וקטוריים או הוספה (50 ng/μL), μL 2 10 מאגר ה-DNA פולימראז x T4, 1 μL של dGTP (25 מ מ) עבור וקטור או 1 μL של dCTP (25 מ מ) הוספת ה-dna μL 1 של DTT (100 מ מ), 0.4 μL של T4 DNA פולימראז (מוסמך LIC) , ו- 9.6 μL של ddH2O. Incubate תגובות בטמפרטורת החדר במשך 40 דקות חום-בטל אנזים ב 75 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. הערה: וקטור LIC והוספה DNA יש לטפל בתגובות נפרדים.</li>
			<li>לבצע את LIC חישול התגובה. לשלב הבא: 2 μL של הוספה שטופלו T4 DNA, 2 μL של T4 שטופלו LIC וקטור הדנ א. דגירה התגובה בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>להפוך את BL21 (DE3) e. coli תאים עם זה פלסמיד רקומביננטי.<ol>
<li>הפשרת המוסמכת תאים (50 μL בצינור מיקרו-צנטריפוגה) על קרח.</li>
		<li>להוסיף כ- 1 μL (50 ng) של פלסמיד לתוך הצינור. מערבבים את התאים ואת ה-DNA על ידי מצליף בעדינות את הצינור 2 – 3 פעמים. מניחים את הצינורית על קרח למשך 20 דקות.</li>
		<li>מחממים את ההלם 42 ° C למקום ס' 40 את הצינורית על הקרח שוב על 2 דק להוסיף 1 מ"ל של מדיה בטמפרטורת החדר LB הצינור.</li>
		<li>המקום הצינור תערובת שייקר 250 סל"ד ב 37 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות מורחים µL 150-200 של התערובת על הלוחות הבחירה. הפוך את הצלחת, דגירה בין לילה ב 37 º C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לבחור שמושבה בודדת ותרבות התאים במדיום 2YT 100 מ ל, המכיל 50 µg/mL kanamycin ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת בבוקר, לחסן בינוני 2YT 1 ליטר המכיל 50 kanamycin µg/mL עם 10 מ"ל של תרבות לילה, דגירה של 37 ° C שייקר אינקובטור ב 250 סל"ד, עד ה OD600 מגיע ~ 0.6. לאחר מכן זירוז התרבות עם IPTG כדי ריכוז סופי של 0.4 מ מ ולגדול על עוד 5 שעות ב- 30 ° C.</li>
	<li>לקצור את התאים על ידי צנטריפוגה ב x 8000 g 10 דקות ב 4 ° C, לאסוף את התאים, resuspend כל התאים 10 גרם במאגר פירוק 40 מ ל (10 מ מ HEPES pH 7.4, 250 מ מ אשלגן כלורי, β-mercaptoethanol 10 מ מ, 25 μg/mL ליזוזים, 25 μg/mL DNase 1 מ PMSF).<ol>
<li>לפרק. את זה על ידי sonication-משרעת 65% למשך 8 דקות עם 1 s s על ו- 1 הנחה. להסיר את שאריות תאים על ידי צנטריפוגה ב x 40,000 g למשך 30 דקות ב 4 º C. לסנן את תגובת שיקוע על ידי עובר דרך מסנן μm 0.22, לטעון אותה לתוך הלולאה הדגימה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לטהר את חלבון כימרי, קליב את התג, מחדש לטהר את חלבון המטרה.<ol>
<li>לטהר את חלבון כימרי באמצעות העמודה Ni-נ (איגוד מאגר: 10 מ מ HEPES pH 7.4, 250 מ מ אשלגן כלורי; • תנאי מאגר: 10 מ מ HEPES pH 7.4, 250 מ מ אשלגן כלורי, 500 מ מ imidazole) ולטהר על-ידי מערכת טיהור, עם שיפוע ליניארי של 20 – 250 מ מ imidazole.</li>
		<li>קליב את חלבון המטרה eluted עם אס פרוטאז (1:50 יחס) לילה ב 4 º C.</li>
		<li>לטהר את תערובת התגובה המחשוף באמצעות עמילוז שרף עמודה (איגוד מאגר: 10 מ מ HEPES pH 7.4, 250 מ מ אשלגן כלורי; • תנאי מאגר: 10 מ מ HEPES pH 7.4, 250 מ מ אשלגן כלורי, מלטוז 10 מ מ) ועמודה Ni-נ להסיר את התג ואת אס פרוטאז. החלבון היעד יהיה השבר זרימה דרך של שתי העמודות.</li>
		<li>Dialyze את הדגימות מאגר דיאליזה (10 מ מ טריס-HCl pH 8.8, 50 מ מ אשלגן כלורי, 10 מ מ β-mercaptoethanol כדי להפחית את ריכוז המלחים. לטהר את הדגימה על עמודה exchange אניון (איגוד מאגר: 10 מ מ טריס-HCl pH 8.8, 10 מ מ β-mercaptoethanol; • תנאי מאגר: 10 מ מ טריס-HCl pH 8.8, 1 מ' אשלגן כלורי, 10 מ מ β-mercaptoethanol) על ידי מעבר צבע ליניארי של 20 – 500 מ מ אשלגן כלורי במאגר • תנאי.</li>
		<li>כשלב האחרון בתהליך טיהור, להתרכז החלבון באמצעות רכז צנטריפוגליות (10 kDa MWCO) ולהזריק לתוך עמודה ג'ל-סינון Superdex 200 26/600 כדי לבדוק את אחידות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לבחון את הטוהר של החלבון על ידי פועל זה מרחביות 15% דף. הערה: כל העמודות פועלים על מערכת טיהור חלבון עם קצב זרימה איגוד של 2 mL/min, שיעור זרימת • תנאי של 4 mL/min. חוץ ג'ל-סינון-1 mL/min.</li>
</ol>2. חלבון הכנה וגיבוש
<ol><li>לרכז את הדגימה חלבון מטוהרים כדי 10 מ"ג/מ"ל באמצעות רכז צנטריפוגליות (10 kDa MWCO) ומאגר exchange למאגר התגבשות לפני אחסון ב- 80 ° c</li>
	<li>לבצע סינון התגבשות (יחס 1:1, 200 nL של חלבונים, 200 nL מאגר המאגר) על ידי הישיבה ירידה אדי דיפוזיה שיטה ב K 295 עם מספר ערכות התגבשות באמצעות נוזל אוטומטיות של טיפול במערכת רובוטית בתבנית 96-ובכן. הערה: השתמשנו ערכות ממדים מולקולרית ומחקר המפטון, Gryphon אוטומטי מערכת טיפול בנוזלים.</li>
	<li>חותם את הצלחת 96-ובכן התגבשות כדי למנוע אידוי ולאפשר את equilibration הירידה חלבון עם המאגר המאגר. אז שמור את הצלחות בחממה קריסטל-18 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>בדוק את הצלחות 96-ובכן מעת לעת באמצעות מיקרוסקופ אור כדי לפקח קריסטל היווצרות וצמיחה.</li>
	<li>כדי להבדיל חלבון קריסטלים גבישי מלח, השתמש צבע חלבון. להוסיף 1 µL של צבע הירידה היעד. המתן כ 1 h ולאחר להתבונן במיקרוסקופ. הקריסטלים חלבון יהפוך כחול.</li>
	<li>להשתמש בתנאי התגבשות חיובי (1.5 M אמוניום סולפט, 0.1 M טריס pH 8.0) נוספת לייעל את הקריסטלים באמצעות תלוי לקפוץ שיטת אדי דיפוזיה. ובכן 24 צלחות.<ol>
<li>מיטוב pH מ- 7.0 ל 8.5 עם 0.5 מרווח יחידת ה-pH בכל שלב. מיטוב ריכוז של אמוניום סולפט מ- 1.2 מ' עד 1.7 מ' עם מרווח 0.1 M בכל שלב. (במקרה שלנו המצב הטוב ביותר לייצר גבישים גדולים בצורת צלחת היה 0.1 M HEPES pH 7.0 ו- 1.6 מ' אמוניום סולפט)</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. קריסטל הרכבה, איסוף נתונים רנטגן ונחישות מבנה
<ol><li>הר גבישים cryoloop ו- flash-cool בבאמצעות פתרון מאגר המכיל 20% גליצרול כמו הקפאה-תרכובת חנקן נוזלי. הניחו את הקריסטלים ב- unipuck עבור אחסון והובלה.</li>
	<li>מראש מסך קריסטלים חלבון באמצעות diffractor רנטגן שבאתר של Rigaku. לבחור את הטובים ביותר עם הרזולוציות הגבוה ביותר עבור אוסף נתוני במתקני סינכרוטרון (dataset שלנו נאסף מן BL17U1 במתקן קרינה סינכרוטרון שנגחאי).<ol>
<li>השתמש בתוכנת שליטה של הפרעות לקרן החלקיקים BluIce26 כדי לעלות על מרכז את הקריסטלים על-ידי פונקציית מרכוז אוטומטי או ידני. לבצע חשיפות מבחן כדי לקבוע את האסטרטגיה אוסף נתונים, כולל החל זווית, זמן החשיפה, גלאי מרחק, מסגרת רוחב ומספרים.</li>
		<li>איסוף הנתונים (dataset) בהתאם (שאספנו מסגרות 180 עם זמן החשיפה ' s 1 ', רוחב מסגרת 1°, המרחק גלאי של 350 מ"מ).</li>
	</ol>
</li>
	<li>אינדקס, לשלב ולשנות את קנה המידה של הנתונים (dataset) באמצעות סוויטת HKL200027. לבצע קודם את פונקציית החיפוש שיא כדי למצוא את הנקודות עקיפה, ולאחר מכן ליצור אינדקס המקומות ובחר הקבוצה המרחב הנכון. לאחר שיא אינטגרציה, קנה מידה את ערכת הנתונים עם המודל הנכון שגיאה ולשמור קובץ .sca הפלט.</li>
	<li>לפתור את הבעיה שלב על ידי החלפת מולקולרית באמצעות הפייזר28 ב- PHENIX29.<ol>
<li>לחשב את עותק ניתן מספר מולקולות חלבון ביחידה אסימטרי מאת Xtriage30.</li>
		<li>לחפש את התבניות מבנה תקין עם דמיון זהות מבניים רצף גבוה כמו החלבון היעד באמצעות מבנים ידועים בספרות או הדגמים שנוצרו על-ידי שרת חיזוי מבנה Phyre231 (השתמשנו ארנב RyR1 NTD כמו חיפוש מודל, 2XOA מזהה PDB).</li>
		<li>הפעל את הפייזר באמצעות קובץ הנתונים עקיפה, קובץ מבנה תבנית הקובץ רצף חלבונים כדי למצוא הפתרון.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ביצוע AutoBuild32 PHENIX29 כדי לייצר את הדגם הראשוני בעזרת קובץ הפלט מ הפייזר והקובץ רצף של החלבון היעד.</li>
	<li>באופן ידני את המבנה לתוך צפיפות אלקטרונים ניסיוני ששונתה באמצעות הנרגן33 ושיפורו באמצעות phenix.refine34 מחזורים איטרטיביים.</li>
	<li>לאמת את הדגם הסופי באמצעות כלי אימות ב- PHENIX18.</li>
</ol>

<ol><li>Giannini, G., Sorrentino, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+structure+and+tissue+distribution+of+ryanodine+receptors+calcium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Medicinal+Research+Reviews%22%5BJournal%5D)">Molecular structure and tissue distribution of ryanodine receptors calcium channels.</a> Medicinal Research Reviews. 15 (4), 313-323 (1995).</li>
<li>Takeshima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+a+gene+for+a+ryanodine+receptor%2Fcalcium+release+channel+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of a gene for a ryanodine receptor/calcium release channel in Drosophila melanogaster.</a> FEBS Letters. 337 (1), 81-87 (1994).</li>
<li>Sattelle, D. B., Cordova, D., Cheek, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+ryanodine+receptors%3A+molecular+targets+for+novel+pest+control+chemicals%5BTitle%5D)+AND+%22Invertebrate+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Insect ryanodine receptors: molecular targets for novel pest control chemicals.</a> Invertebrate Neuroscience. 8 (3), 107-119 (2008).</li>
<li>Steinbach, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geographic+spread%2C+genetics+and+functional+characteristics+of+ryanodine+receptor+based+target-site+resistance+to+diamide+insecticides+in+diamondback+moth%2C+Plutella+xylostella%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Geographic spread, genetics and functional characteristics of ryanodine receptor based target-site resistance to diamide insecticides in diamondback moth, Plutella xylostella.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 63, 14-22 (2015).</li>
<li>Wang, X., Khakame, S. K., Ye, C., Yang, Y., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+field-evolved+resistance+to+chlorantraniliprole+in+the+diamondback+moth%2C+Plutella+xylostella%2C+from+China%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Management+Science%22%5BJournal%5D)">Characterisation of field-evolved resistance to chlorantraniliprole in the diamondback moth, Plutella xylostella, from China.</a> Pest Management Science. 69 (5), 661-665 (2013).</li>
<li>Liu, X., Wang, H. Y., Ning, Y. B., Qiao, K., Wang, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+Selection+and+Characterization+of+Chlorantraniliprole+Resistance+in+Plutella+xylostella+%28Lepidoptera%3A+Plutellidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Economic+Entomology%22%5BJournal%5D)">Resistance Selection and Characterization of Chlorantraniliprole Resistance in Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae).</a> Journal of Economic Entomology. 108 (4), 1978-1985 (2015).</li>
<li>Guo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+a+point+mutation+in+the+ryanodine+receptor+of+Plutella+xylostella+%28L.%29+associated+with+resistance+to+chlorantraniliprole%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Management+Science%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of a point mutation in the ryanodine receptor of Plutella xylostella (L.) associated with resistance to chlorantraniliprole.</a> Pest Management Science. 70 (7), 1083-1089 (2014).</li>
<li>Troczka, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+to+diamide+insecticides+in+diamondback+moth%2C+Plutella+xylostella+%28Lepidoptera%3A+Plutellidae%29+is+associated+with+a+mutation+in+the+membrane-spanning+domain+of+the+ryanodine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Resistance to diamide insecticides in diamondback moth, Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae) is associated with a mutation in the membrane-spanning domain of the ryanodine receptor.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 42 (11), 873-880 (2012).</li>
<li>Roditakis, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ryanodine+receptor+point+mutations+confer+diamide+insecticide+resistance+in+tomato+leafminer%2C+Tuta+absoluta+%28Lepidoptera%3A+Gelechiidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Ryanodine receptor point mutations confer diamide insecticide resistance in tomato leafminer, Tuta absoluta (Lepidoptera: Gelechiidae).</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 80, 11-20 (2017).</li>
<li>Borko, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+the+human+RyR2+N-terminal+region+involved+in+cardiac+arrhythmias%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%22%5BJournal%5D)">Structural insights into the human RyR2 N-terminal region involved in cardiac arrhythmias.</a> Acta Crystallographica Section D. 70 (Pt 11), 2897-2912 (2014).</li>
<li>Sharma, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+determination+of+the+phosphorylation+domain+of+the+ryanodine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Structural determination of the phosphorylation domain of the ryanodine receptor.</a> FEBS Journal. 279 (20), 3952-3964 (2012).</li>
<li>Kimlicka, L., Lau, K., Tung, C. C., Van Petegem, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+mutations+in+the+ryanodine+receptor+N-terminal+region+couple+to+a+mobile+intersubunit+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Disease mutations in the ryanodine receptor N-terminal region couple to a mobile intersubunit interface.</a> Nature Communications. 4, 1506(2013).</li>
<li>Lau, K., Van Petegem, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structures+of+wild+type+and+disease+mutant+forms+of+the+ryanodine+receptor+SPRY2+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Crystal structures of wild type and disease mutant forms of the ryanodine receptor SPRY2 domain.</a> Nature Communications. 5, 5397(2014).</li>
<li>Amador, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+type+I+ryanodine+receptor+amino-terminal+beta-trefoil+domain+reveals+a+disease-associated+mutation+%26%2334%3Bhot+spot%26%2334%3B+loop%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of type I ryanodine receptor amino-terminal beta-trefoil domain reveals a disease-associated mutation &#34;hot spot&#34; loop.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (27), 11040-11044 (2009).</li>
<li>Lobo, P. A., Van Petegem, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structures+of+the+N-terminal+domains+of+cardiac+and+skeletal+muscle+ryanodine+receptors%3A+insights+into+disease+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Crystal structures of the N-terminal domains of cardiac and skeletal muscle ryanodine receptors: insights into disease mutations.</a> Structure. 17 (11), 1505-1514 (2009).</li>
<li>des Georges, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Basis+for+Gating+and+Activation+of+RyR1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structural Basis for Gating and Activation of RyR1.</a> Cell. 167 (1), 145-157 (2016).</li>
<li>Efremov, R. G., Leitner, A., Aebersold, R., Raunser, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+and+conformational+switch+mechanism+of+the+ryanodine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Architecture and conformational switch mechanism of the ryanodine receptor.</a> Nature. 517 (7532), 39-43 (2015).</li>
<li>Peng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+the+gating+mechanism+of+the+type+2+ryanodine+receptor+RyR2%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural basis for the gating mechanism of the type 2 ryanodine receptor RyR2.</a> Science. 354 (6310), (2016).</li>
<li>Wei, R. S., et al. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/cr201699">Structural insights into Ca2+-activated long-range allosteric channel gating of RyR1.</a> Cell Research. 26 (9), 977-994 (2016).</li>
<li>Yan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+rabbit+ryanodine+receptor+RyR1+at+near-atomic+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the rabbit ryanodine receptor RyR1 at near-atomic resolution.</a> Nature. 517 (7532), 50-55 (2015).</li>
<li>Zalk, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+mammalian+ryanodine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of a mammalian ryanodine receptor.</a> Nature. 517 (7532), 44-49 (2015).</li>
<li>Furlong, M. J., Wright, D. J., Dosdall, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diamondback+moth+ecology+and+management%3A+problems%2C+progress%2C+and+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">Diamondback moth ecology and management: problems, progress, and prospects.</a> Annual Review of Entomology. 58, 517-541 (2013).</li>
<li>Amador, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+type+I+ryanodine+receptor+amino-terminal+beta-trefoil+domain+reveals+a+disease-associated+mutation+%26%2334%3Bhot+spot%26%2334%3B+loop%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of type I ryanodine receptor amino-terminal beta-trefoil domain reveals a disease-associated mutation &#34;hot spot&#34; loop.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (27), 11040-11044 (2009).</li>
<li>Lobo, P. A., Van Petegem, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+Structures+of+the+N-Terminal+Domains+of+Cardiac+and+Skeletal+Muscle+Ryanodine+Receptors%3A+Insights+into+Disease+Mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Crystal Structures of the N-Terminal Domains of Cardiac and Skeletal Muscle Ryanodine Receptors: Insights into Disease Mutations.</a> Structure. 17 (11), 1505-1514 (2009).</li>
<li>Aslanidis, C., de Jong, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligation-independent+cloning+of+PCR+products+%28LIC-PCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR).</a> Nucleic Acids Research. 18 (20), 6069-6074 (1990).</li>
<li>Stepanov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JBluIce-EPICS+control+system+for+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%22%5BJournal%5D)">JBluIce-EPICS control system for macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D. 67 (3), 176-188 (2011).</li>
<li>Minor, W., Cymborowski, M., Otwinowski, Z., Chruszcz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HKL-3000%3A+the+integration+of+data+reduction+and+structure+solution--from+diffraction+images+to+an+initial+model+in+minutes%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%22%5BJournal%5D)">HKL-3000: the integration of data reduction and structure solution--from diffraction images to an initial model in minutes.</a> Acta Crystallographica Section D. 62 (Pt 8), 859-866 (2006).</li>
<li>McCoy, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phaser+crystallographic+software%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Phaser crystallographic software.</a> Journal of Applied Crystallography. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).</li>
<li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PHENIX%3A+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%22%5BJournal%5D)">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallographica Section D. 66 (Pt 2), 213-221 (2010).</li>
<li>Zwart, P. H., Gross-Kunstleve, R. W., Adams, P. D. <a target="_blank" href="http://citeseerx.ist.psu.edu/viewdoc/download?doi=10.1.1.378.2281&rep=rep1&type=pdf">Xtriage and Fest: Automatic assessment of X-ray data and substructure structure factor estimation.</a> CCP4 Newsletter. (43), 27-35 (2005).</li>
<li>Kelley, L. A., Mezulis, S., Yates, C. M., Wass, M. N., Sternberg, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Phyre2+web+portal+for+protein+modeling%2C+prediction+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction and analysis.</a> Nature Protocols. 10 (6), 845-858 (2015).</li>
<li>Terwilliger, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iterative+model+building%2C+structure+refinement+and+density+modification+with+the+PHENIX+AutoBuild+wizard%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%22%5BJournal%5D)">Iterative model building, structure refinement and density modification with the PHENIX AutoBuild wizard.</a> Acta Crystallographica Section D. 64 (Pt 1), 61-69 (2008).</li>
<li>Emsley, P., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coot%3A+model-building+tools+for+molecular+graphics%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%22%5BJournal%5D)">Coot: model-building tools for molecular graphics.</a> Acta Crystallographica Section D. 60, 2126-2132 (2004).</li>
<li>Afonine, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+automated+crystallographic+structure+refinement+with+phenix.refine%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%22%5BJournal%5D)">Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine.</a> Acta Crystallographica Section D. 68 (Pt 4), 352-367 (2012).</li>
<li>Lin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+ryanodine+receptor+N-terminal+domain+from+Plutella+xylostella+reveals+two+potential+species-specific+insecticide-targeting+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of ryanodine receptor N-terminal domain from Plutella xylostella reveals two potential species-specific insecticide-targeting sites.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 92, 73-83 (2018).</li>
<li>Qi, S., Casida, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species+differences+in+chlorantraniliprole+and+flubendiamide+insecticide+binding+sites+in+the+ryanodine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Pesticide+Biochemistry+and+Physiology%22%5BJournal%5D)">Species differences in chlorantraniliprole and flubendiamide insecticide binding sites in the ryanodine receptor.</a> Pesticide Biochemistry and Physiology. 107 (3), 321-326 (2013).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

בנייר זה, אנו מתארים את ההליך כדי recombinantly express, לטהר, מתגבשים, לקבוע את המבנה של DBM RyR NTD. על התגבשות, דרישה חיונית הוא לקבל חלבונים עם מסיסות גבוהה, טוהר, הומוגניות. בפרוטוקול שלנו, בחרנו להשתמש וקטור pET-28a-HMT כפי שהוא מכיל hexahistidine תג ותג MBP, אשר שניהם יכול להיות מנוצל עבור טיהור להשיג טוהר קיפול גבוה יותר. בנוסף, של MBP תג העזרים, המסיסות החלבון היעד. אנחנו טהור החלבון על ידי חמישה שלבים עוקבים אשר הניב חלבון זה היה טהור מאוד ומתאים התגבשות. התגבשות ההקרנה בוצעה באמצעות נוזל אוטומטיות טיפול המערכת...

קולטנים Ryanodine (RyRs) הם תעלות יונים וברצפטורים ספציפיים, אשר לתווך על הסתננות של Ca2 + יונים על-פני הממברנות sarcoplasmic רשת (SR) בתאי השריר. לכן, הם לשחק תפקיד חשוב להתכווצות עירור צימוד תהליך. בצורתו פונקציונלי, RyR מרכיב כמו הומו-tetramer עם מסה מולקולרית של > מד א 2, עם כל יחידה משנית הכוללת של שאריות חומצה אמינית ~ 5000. ביונקים, ישנם שלושה איזופורמים: RyR1 מסוג שרירי השלד, שריר הלב סוג RyR2 - ו RyR3-ubiquitously לידי ביטוי ברקמות שונות1.
חרקים יש רק סוג אחד של RyR, הבאה לידי ביטוי רקמות שרירים, עצבים2. RyR חרקים הוא דומה יותר RyR2 בתרבית של זהות רצף כ- 47%3. הדברה Diamide מיקוד RyR של פרפראים הזבוביים וקשיי יש כבר פותחו ומשווקים על ידי חברות גדולות כמו באייר (flubendiamide), דופונט (chlorantraniliprole) והפריבט (cyantraniliprole). מאז השקתה יחסית לאחרונה, הדברה diamide הפכו להיות אחד של המעמד הצמיחה המהירה של קוטלי חרקים. נכון לעכשיו, המכירות של אלה של שלושה קוטלי חרקים מדי שנה חצו 2 מיליארד דולר ארה עם קצב גידול של למעלה מ-50% מאז 2009 (Agranova).
מחקרים שנעשו לאחרונה דיווחו על ההתפתחות של עמידות חרקים לאחר כמה דורות של השימוש האלה קוטלי חרקים4,5,-6,-7,-8. ההתנגדות מוטציות בתחום transmembrane של RyRs העש diamondback (DBM), Plutella xylostella (G4946E, I4790M), את עמדות המקביל האילוח עגבניות, Tuta absoluta (G4903E, I4746M) מראים כי האזור יכול להיות מעורב diamide קוטל חרקים מחייב כמו אזור זה ידוע להיות קריטי עבור gating של ערוץ4,8,9. למרות מחקר מקיף בתחום זה, המנגנונים המולקולריים המדויק של קוטלי חרקים diamide נשארים חמקמקים. יתר על כן, לא ברור מוטציות עמידות להשפיע את האינטראקציות עם diamides ישירות או allosterically.
מחקרים מוקדמים יותר דיווחו על המבנה של מספר תחומים RyR של יונקים ואת המבנה של RyR1 יונקים באורך מלא, RyR2 על ידי קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן ואלקטרון הקפאה-, בהתאמה10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . אבל עד כה, אין מבנה של חרק RyR דווחה, אשר אוסרת עלינו. הבנת המורכבות מולקולרית של הפונקציה קולטן וכן את המנגנונים המולקולריים של פעולה בקוטלי חרקים, התפתחות של עמידות חרקים.
כתב יד זה, אנו מציגים עבור אפיון מבניים N-מסוף תחום β-trefoil של קולטן ryanodine מ- diamondback העש, נודניק הרסני מדביק המצליבים יבולים ברחבי העולם22פרוטוקול מוכללת. הבונה עוצבה בהתאם את הארנב שפורסם RyR1 NTD קריסטל מבנים23,24ו של הקפאה-EM מודלים מבניים16,17,18,19, 20 , 21. זה המבנה ברזולוציה גבוהה הראשון שדווחו עבור חרקים RyR, אשר חושף את המנגנון עבור ערוץ gating מספק תבנית חשוב לפיתוח חומרי הדברה תלויי מין באמצעות עיצוב מבוסס על מבנה סמים. עבור מבנה הבהרה, אנחנו מועסקים קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן, אשר נחשב "תקן הזהב' לקביעת מבנה החלבון-ליד ברזולוציה אטומית. למרות תהליך התגבשות הוא צפוי ועבודה אינטנסיבית, פרוטוקול שלב אחר שלב זה תסייע לחוקרים אקספרס, לטהר ולאפיין תחומים אחרים של חרק RyR או כל לחלבונים אחרים באופן כללי.

<table><tbody><tr>וקטור <td></td><td></td><td>pET-28a-HMT</td><td>וקטור pET שונה זה מכיל תג הקסהיסטידין, חלבון היתוך MBP ואתר מחשוף פרוטאז TEV בקצה ה-N (Lobo and Van Petegem, 2009)</td></tr><tr><td>E. coli BL21 (DE3) strain</td><td>Novagen</td><td>69450-3CN</td><td></td></tr><tr><td>HisTrapעמודת HP (5 מ"ל)</td><td>GE Healthcare</td><td>45-000-325</td><td></td></tr><tr><td>עמוד שרף עמילוז</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>E8021S</td><td></td></tr><tr><td>Q Sepharose טור ביצועים גבוהים&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1154-01</td><td></td></tr><tr><td>רכזי Amicon (10 kDa MWCO)</td><td>Millipore</td><td>UFC901008</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 עמודת סינון ג'ל 26/600&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9893-36</td><td></td></tr><tr><td>מערכת רובוטית אוטומטית לטיפול בנוזלים&nbsp;</td><td>ארט רובינס מכשירים</td><td>גריפון</td><td></td></tr><tr><td>96 באר קריסטל Quick</td><td>Greiner bio-one</td><td>82050-494</td><td></td></tr><tr><td>Uni-Puck</td><td>מידות מולקולריות</td><td>MD7-601</td><td></td></tr><tr><td>CryoLoop רכוב - 20 מיקרון</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-955</td><td></td></tr><tr><td>CryoWand</td><td>מידות מולקולריות</td><td>MD7-411</td><td></td></tr><tr><td>כלי טעינת פאק דיואר</td><td>מולקולרי מידות</td><td>MD7-607</td><td></td></tr><tr><td>ננו טיפה</td><td>תרמו מדעי</td><td>NanoDrop חממת</td> קריסטל אחת <td></td></tr><tr><td></td><td>מידות מולקולריות</td><td>MD5-605</td><td></td></tr><tr><td>דיפרקטור רנטגן</td><td>Rigaku</td><td>FRX</td><td></td></tr><tr><td>PCR מכונת</td><td>אפנדורף</td><td>נקסוס GX2</td><td></td></tr><tr><td>ערכת מיני הכנה פלסמיד</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>מיצוי ג'ל ערכה</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>SspI הגבלת אנדונוקלאז</td><td>NEB</td><td>R0132S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA פולימראז</td><td>Novagen</td><td>2868713</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Scientific Chemical</td><td>25389940</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Genview</td><td>367931</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Genview</td><td>7365459</td><td></td></tr><tr><td>&-mercaptoethanol</td><td>Genview</td><td>60242</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>תרמו מדעית</td><td>סורוול LYNX 6000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sonnicator</td><td>Scientz</td><td>II-D</td><td></td></tr><tr><td>מערכת טיהור חלבון</td><td>GE Healthcare</td><td>Akta מיקרוסקופ אור טהור</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td></td></tr><tr><td>IzIt צבע קריסטל</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-710</td><td></td></tr><tr><td>יחידת אלקטרופורזה</td><td>Bio-Rad</td><td>1658005EDU</td><td></td></tr><tr><td>חממת שייקר</td><td>Zhicheng</td><td>ZWYR-D2401</td><td></td></tr><tr><td>מסך קריסטל אינדקס</td><td>המפטון מחקר</td><td>HR2-144</td><td></td></tr><tr><td>מבנה מסך קריסטל</td><td>מידות מולקולריות</td><td>MD1-01</td><td></td></tr><tr><td>מסך קריסטל ProPlex</td><td>מידות מולקולריות</td><td>MD1-38</td><td></td></tr><tr><td>מסך קריסטל פרמייר PACT</td><td>מידות מולקולריות</td><td>MD1-29</td><td></td></tr><tr><td>JCSG-plus מסך קריסטל</td><td>מולקולרי מידות</td><td>MD1-37</td><td></td></tr></tbody></table>

מבנה גבישי של n-מסוף תחום של ryanodine הקולטן של plutella xylostella

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

פיתוח חומרי הדברה חזק ויעיל מיקוד קולטנים ryanodine חרקים (RyRs) היה עניין רב בתחום הדברה חקלאיים. נכון להיום, מספר קוטלי חרקים diamide מיקוד המזיק שחייב להיות ממוסחר RyRs, אשר מפיקים הכנסות שנתיות של 2 מיליארד דולר. אבל הבנה של מצב הפעולה של פילוח RyR קוטלי חרקים הוא מוגבל על ידי חוסר של מבני מידע לגבי חרקים RyR. זה בתורו מגבילה את ההבנה של ההתפתחות של עמידות חרקים מזיקים. העש diamondback (DBM) הוא נודניק הרסנית השמדת יבולים המצליבים ברחבי העולם, אשר דווחה גם להראות התנגדות הדברה diamide. לכן חשיבות מעשית רבה לפתח הדברה חדשניים מיקוד RyR DBM, במיוחד לעבר אזור שונים מתוך אתר איגוד diamide המסורתי. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לאפיין מבחינה מבנית המחשבים N-מסוף של RyR מ DBM. המבנה נפתרה על-ידי החלפת מולקולרית ברזולוציה של 2.84, אשר מציגה את מוטיב מתקפלים בטא-trefoil, סליל אלפא איגוף. פרוטוקול זה ניתן להתאים את הביטוי, טיהור, אפיון מבניים של קבוצות מחשבים או חלבונים אחרים באופן כללי.

טיהור
N-מסוף בתחום DBM RyR בא לידי ביטוי כמו חלבון פיוז'ן עם תג hexahistidine, תג MBP אתר אס פרוטאז המחשוף. עקבנו אסטרטגיה טיהור חמישה צעדים כדי להשיג חלבון טהור מאוד, מתאים למטרה התגבשות. בהתחלה חלבון כימרי היה טהור מן השבר מסיסים של תא lysate לפי עמודה Ni-נ (HisTrap HP). בשלב הבא, חלבון כימרי היה נתון אס פרוטאז המחשוף, moiety hexahistidine-MBP הוסר על-ידי עמילוז שרף עמודה ואחריו עמודה Ni-נ. ת. יתר על כן, החלבון היה לטהר לפי עמודה...

במאמר זה, אנו מתארים את הפרוטוקולים של נחישות ביטוי, טיהור, התגבשות ומבנה חלבון של התחום N-מסוף של קולטן ryanodine מ- diamondback עש (Plutella xylostella).

מבנה גבישי של N-מסוף תחום של Ryanodine הקולטן של Plutella xylostella

Development of potent and efficient insecticides targeting insect ryanodine receptors (RyRs) has been of great interest in the area of agricultural pest ...

פתרון המבנה של תחום קולטן ריאנודין יכול לעזור בהבנתנו את המנגנון המולקולרי של תפקוד החלבון, פעולת קוטלי חרקים והתפתחות עמידות קוטלי חרקים. מדד זה מרמז על שימוש בקריסטלוגרפיה של קרני רנטגן להמחשה של מבנה, הנחשבת לסטנדרט זהב לקביעת מבנה החלבון ברזולוציה כמעט אטומית. מבנה ברזולוציה גבוהה זה של תחום קולטן החרקים ריאנודין חושף את מנגנון התעלות ומספק תבנית חשובה להתפתחות קוטלי חרקים ספציפיים למינים באמצעות גישות עיצוב תרופות מבוססות מבנה.בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו, כי קריסטלוגרפים חלבון פוטנציאלי חייב להיות מיומן ביוכימיה, ביופיזיקה, מדעי המחשב, ומתמטיקה. התחל על ידי הגברת ה- DNA המתאים לחלבון המעניין על ידי תגובת שרשרת פולימראז. בסוף התגובה, להפעיל את כל 50 microliters של תערובת התגובה על 2% ג'ל agarose, ולחלץ את ה-DNA עם ערכת מיצוי ג'ל על פי פרוטוקולים סטנדרטיים.לאחר מכן, ליניארי את ה-DNA וקטור LIC על ידי ערבוב 20 microliters של ה-DNA וקטור עם 6 microliters של חיץ תגובה 10X ו 4 microliters של אנזים הגבלת SspI ב 30 microliters של מים מזוקקים כפולים. הדגירה תערובת תגובה זו במשך שלוש שעות ב 37 מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, להפעיל את כל תערובת התגובה על ג'ל 1%agarose, ואחריו החילוץ של DNA וקטור ליניארי עם ערכת מיצוי ג'ל על פי הוראות היצרן.לאחר מכן, לבצע טיפולים נפרדים T4 DNA פולימראז על 5 microliters של DNA וקטור ליניארי ו PCR מוגברת להוסיף DNA, על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. דגירה במשך 40 דקות בטמפרטורת החדר, ואחריו 20 דקות של איון חום אנזים ב 75 מעלות צלזיוס. בצע את תגובת חישול שיבוט עצמאית קשירה על ידי שילוב של 2 microliters של T4 מטופלים להוסיף DNA עם 2 microliters של T4 מטופלים LIC וקטור DNA עבור דגירה 10 דקות בטמפרטורת החדר.כדי להפוך BL21(DE3)E. קולי תאים עם פלסמיד רקומביננטי, להפשיר 50 microliters של תאים מוכשרים על קרח, ולהוסיף כ 1 microliter של פלסמיד annealed לצינור. בעדינות להעיף את הצינור פעמיים עד שלוש פעמים כדי לערבב את התאים ואת ה-DNA, ולה מניחים את הצינור בחזרה על הקרח במשך 20 דקות.בסוף הדגירה, הלם חום התאים ב 42 מעלות צלזיוס במשך 40 שניות, ואחריו שתי דקות בחזרה על הקרח. לאחר מכן, מוסיפים מיליליטר אחד של מדיום LB בטמפרטורת החדר לצינור, ומ מניחים את התאים על שייקר 250 סל"ד במשך 45 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה הרועדה, צלחת 150 עד 200 microliters של תערובת זו על צלחות הבחירה, ולהפוך את הצלחות לילה ב 37 מעלות צלזיוס.למחרת, תרבות מושבה אחת ב 100 מיליליטר של מדיום 2-YT, בתוספת קאנאמיצין, באינקובטור שייקר ב 37 מעלות צלזיוס לילה. למחרת בבוקר, לחסן ליטר אחד של 2-YT בינוני, בתוספת kanamycin, עם 10 מיליליטר של תרבות הלילה, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס עם רועד עד קריאת OD600 מגיע כ 0.6. לאחר מכן, לגרום לתרבות עם IPTG לריכוז סופי של 0.4 מילימולאר, ולגדל את התאים במשך חמש שעות ב 30 מעלות צלזיוס.בסוף הדגירה, לקצור את התאים על ידי צנטריפוגה, ולהשעות מחדש את גלולה ל 10 גרם של חיידקים לכל 40 מיליליטר של ריכוז מאגר תמוגה. לשבש את קירות התא על ידי sonication ב משרעת 65%, ושנייה אחת על שנייה אחת את, במשך שמונה דקות. הסר את פסולת התא על ידי צנטריפוגה.לאחר מכן, סנן את העל-טבעי למרות מסנן של 22 מיקרומטר וטען את הפתרון בלולאה לדוגמה. כדי לטהר את חלבון ההיתוך, להזריק את supernatant מסונן מן לולאת המדגם לתוך עמודה ניקל-nitrolotriacetic חמישה מיליליטר על מערכת טיהור עם שיפוע ליניארי של 20 כדי 250 imidazole מילימולרית. Cleave חלבון היעד eluted עם פרוטאז וירוס תחריט טבק, ביחס של 1 עד 50, לילה ב 4 מעלות צלזיוס, ולטהר את תערובת תגובת המחשוף על עמודת שדון amylose, וטור ניקל-nitrolotriacetic, כדי להסיר את התג ואת פרוטאז נגיף תחריט טבק.דיאליזה לזרום דרך מן העמוד ניקל ניטרולטריאקטי נגד חיץ דיאליזה כדי להפחית את ריכוז המלח, ולטהר את המדגם על עמוד חילופי אניון על ידי שיפוע ליניארי של 20 כדי 500 מילימולר אשלגן כלורי במאגר אלוטיון. לאחר מכן, לרכז את החלבון במרכז צנטריפוגלי. הזרק את החלבון המרוכז לעמודת סינון ג'ל Superdex 200 26/600 כדי לבדוק את ההומוגניות, ולהעריך את טוהר החלבון ב-15%SDS-PAGE.כדי להכין את החלבון להתגבשות, לרכז את דגימת החלבון המטוהר ל 10 מיליגרם למיליליטר במרכז הצנטריפוגלי, ואת חילופי חיץ כדי לגבש חיץ לפני 80 מעלות צלזיוס אחסון. כדי לבצע סינון התגבשות, השתמש בשיטת דיפוזיה של אדי טיפת ישיבה ב- 295 קלווין, עם מספר ערכות התגבשות, ובמערכת אוטומטית לטיפול בנוזלים בפורמט של 96 בארות. בסוף הגדרת הירידה, לאטום את צלחת התגבשות 96 היטב כדי למנוע אידוי, ולאפשר את שיווי המשקל של טיפת החלבון בתוך מאגר המאגר.מניחים את הצלחות באינקובטור קריסטל ב 18 מעלות צלזיוס. בדוק את הצלחות מעת לעת תחת מיקרוסקופ אור כדי לפקח על היווצרות הקריסטל וצמיחתו. כדי להבדיל את גבישי החלבון מקריסטלי המלח, הוסיפו מיקרוליטר אחד של צבע גביש חלבון לירידה למטרה, והתבוננו בגבישים מתחת למיקרוסקופ לאחר שעה.גבישי החלבון יופיעו כחולים. כדי לייעל עוד יותר את הגבישים, השתמש בתנאי ההתגבשות החיוביים ובשיטת דיפוזיה של אדי טיפה תלויים בצלחות 24 בארות, ואחריהן דגירה באינקובטור הגבישים בטמפרטורה של 18 מעלות צלזיוס. כדי לקבוע את מבנה החלבון, הר את הגבישים על קרילופ תחת מיקרוסקופ אור לקירור הבזק בחנקן נוזלי, והצב את הגבישים בחוסר מזל לאחסון ולהובלה.סנן מראש את הגבישים במפזר קרני רנטגן, תוך שימוש בפונקציית הריווח הידנית כדי להרכיב ולרכז את הגבישים. לאחר מכן, השתמש בתוכנת דיפוזיה של קרני רנטגן כדי לאסוף את הנתונים. כדי ליצור אינדקס, לשלב את ערכת הנתונים וקנה המידה שלה, באמצעות חבילת HKL-2000, בחר תחילה את הגלאי וטען את ערכת הנתונים.לאחר מכן, בצע את פונקציית החיפוש שיא כדי למצוא את כתמי ההתפזרות. צור אינדקס עבור הנקודות, בחר את קבוצת הרווחים הנכונה ובצע שילוב שיא. לאחר מכן, שנה את קנה המידה של ערכת הנתונים.התאם שוב את מודל השגיאה וקנה המידה. שמור את קובץ sca של הפלט. כדי לקבוע את המבנה באמצעות חבילת התוכנה של Phenix, צור פרוייקט חדש.ראשית, הפעל Extriage עם קובץ sca כדי לחשב את מספר העותק האפשרי של מולקולות חלבון ביחידה האסימטרית. לאחר מכן, כדי לפתור את בעיית הפאזה על ידי החלפה מולקולרית, הפעל את Phaser, באמצעות קובץ נתוני ההפרדה, קובץ מבנה התבנית עם זהות רצף גבוה ודמיון מבני כמו חלבון היעד, ואת קובץ רצף החלבון, כדי למצוא את הפתרון. בצע בנייה אוטומטית בפניקס כדי ליצור את הדגם הראשוני, באמצעות קובץ הפלט של Phaser וקובץ הרצף מחלבון היעד.בנה ידנית את המבנה לתוך צפיפות האלקטרונים הניסיונית ששונתה באמצעות COOT, ומקד באמצעות פיניקס עידון במחזורים איטרטיביים. אמת את המודל הסופי באמצעות כלי האימות ב- Phenix. בניסוי מייצג זה, טיהור תחום מסוף הקצה של חלבון קולטן עש היהלומים ריאנודין, כפי שהוכח, הניב רצועה אחת בערך 21 קילודלטון על ידי ניתוח STS-PAGE.נפח האלוטיון מעמוד סינון הג'ל אישר את תחום מסוף הקצה של קולטן ריאנודין המטוהר כמונומר. עבור התגבשות, התנאים האופטימליים ביותר שבהם נוצרו גבישים בצורת צלחת באיכות גבוהה היו בנוכחות 1 HEPES טוחן של pH של 7, ו 1.6 אמוניום גופרתי טוחן. קביעת מבנה החלבון מתוך ערכת נתוני דיפירציה ניצול תוכנות כפי שהודגם חשף את התחום קצה מסוף קולטן עש diamondback ryanodine מכסה שאריות 1 עד 205.חלבונים עם הפרעה גדולה, אזורים גמישים, או עם זיקה חלשה מאתגרים להתגבש. בתרחישים אלה, אסטרטגיות הנדסת חלבון כגון הפחתת אנטרופיה פני השטח, חיתוך לולאה, וקישור צולב, עשוי להגדיל את הסבירות של קבלת גבישי חלבון טובים יותר. בנוסף לחשיפת מבני חלבון ברזולוציה גבוהה, קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן עשויה לשמש גם לחקר אינטראקציות של חומרי הדברה חלבונים, אשר יכולות לסייע בתכנון חומרי הדברה מבוססי מבנה.

crystal-structure-n-terminal-domain-ryanodine-receptor-from-plutella

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

מאמר זה מתאר את מתודולוגיית המיקרוסקופיה הקריו-אלקטרונית, המשמשת להשגת תמונות מיקרוסקופיות באיכות גבוהה של מקרומולקולות במצבן הכמעט טבעי. השיטה מניבה תמונות המתאימות לעיבוד ממוחשב נוסף בגישת החלקיק הבודד, שתוכננה ליצירת שחזור תלת מימדי של מקרומולקולה.

עשה ואל תעשה של מיקרוסקופ אלקטרוני cryo-: פריימר על הכנת דוגמאות וגבוהה איסוף נתונים איכות לשיקום Macromolecular 3D

β חלבוני ממברנה חיצונית (OMPs) משרתים פונקציות רבות בתוך הממברנות החיצוניות של חיידקים גראם-שליליים, מיטוכונדריה וכלורופלסטים. כאן, אנו מקווים להקל על צוואר בקבוק ידוע במחקרים מבניים על ידי הצגת פרוטוקולים לייצור OMPs של β חביות בכמויות מספיקות לקביעת מבנה על ידי קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן או ספקטרוסקופיה NMR.

מתוך בונה קריסטלים - לקראת מבנה קביעת β-חבית החיצון ממברנה חלבונים

כאן, אנו מתארים שיטה להביע ולטהר norovirus באיכות גבוהה בולטות (P) תחומים ב E. coli לשימוש במחקרים קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על תחומי P calicivirus אחרים, כמו גם חלבונים הלא מבניים, כלומר., הגנום צמוד חלבונים נגיפיים (VPG), פרוטאז, ו RNA רפליקאז (RdRp).

הפקה של דומיינים בולטים norovirus אדם<em&gt; E. coli</em&gt; עבור רנטגן קריסטלוגרפיה

אוליגומריזציה של קולטן הריאנודין, תעלת יונים הומו-טטרמרי המתווכת שחרור Ca2+ ממאגרים תוך-תאיים, היא קריטית להתכווצות שרירי השלד והלב. כאן, אנו מציגים שיטות משלימות in vivo ו-in vitro לאיתור אסוציאציה עצמית של חלבון וקביעת סטוכיומטריה של הומו-אוליגומר.

גישות גנטיות ביוכימיים עבור<em&gt; In vivo</em&gt; ו<em&gt; במבחנה</em&gt; הערכת oligomerization חלבון: מקרה המבחן קולטן Ryanodine

פרולין-פרולין אנדופפטידאז-1 (PPEP-1) הוא מטאלופרוטיאז מופרש ויעד תרופה מבטיח מהפתוגן האנושי קלוסטרידיום דיפיצילה. כאן אנו מתארים את כל השיטות הדרושות לייצור וקביעת המבנה של חלבון זה.

הפקה, התגבשות וקביעת מבנה<em&gt; C. difficile</em&gt; PPEP-1 באמצעות Microseeding ואבץ-SAD

פרוטוקול זה מתאר טכניקות המשמשות לקביעת יון ערוץ מבנים על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים הקפאה, כולל מערכת baculovirus שנועדה להביע ביעילות גנים בתאים בתרבית של מינימום מאמץ, רעילות, חלבון החילוץ, טיהור, בדיקת איכות, הכנת הדוגמא רשת ו ההקרנה, כמו גם איסוף נתונים, עיבוד.

הביטוי ולטיהור TRPC3 האדם רגיש השומנים הקטיון ערוץ לקביעת מבניים על-ידי הקפאה יחיד-חלקיקים-מיקרוסקופ

אנו מתארים פרוטוקולים עבור קביעת המבנה של התחום המחייב של IKK של נמו על ידי קריסטלוגרפיה רנטגן. השיטות כוללות ביטוי חלבונים, טיהור ואפיון, כמו גם אסטרטגיות למיטוב מוצלח של גביש וקביעת מבנה של החלבון בצורתו הלא מאוגדת.

הפקה, התגבשות וקביעת מבנה של התחום המחייב של ה-IKK של נמו

פרוטוקול זה פותח כדי ללמוד את המעבר dimer-dodecamer של TmPep1050, M42 aminopeptidase, ברמה המבנית. זהו צינור פשוט החל מטיהור חלבונים לעיבוד נתוני רנטגן. Crystallogenesis, אינדקס סט נתונים, והחלפה מולקולרית הודגמו באמצעות מקרה של מחקר, TmPep1050H60A H307A משתנה.

קריסטלוגרפיה רנטגן כדי ללמוד את המעבר המדינה אוליגומרית של Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

כאן שיטות המשמשות כדי ללמוד את ההשפעה התפקודית של מוטציות RYR1 בא לידי ביטוי אנדוגני וירוס אפשטיין בר מונצח B-לימפוציטים, ביופסיה שריר נגזר תאי לווין המובחנים myotubes מתוארים.

אפיון פונקציונלי של גרסאות RYR1 אנושיות מבוטאות אנדוגניות

פרוטוקול זה מציג את הכלים הזמינים למידול ליגנדות של מולקולות קטנות במפות cryoEM של מקרומולקולות.

מידול ליגנדות למפות הנגזרות מקריומיקרוסקופ אלקטרונים

חקור קריסטלוגרפיית קרני X לקביעת מבנה התחום ה-N-טרמינלי של קולטן Ryanodine ב-Plutella xylostella. השיטה חושפת מנגנוני פתיחת ערוץ ומספקת תבנית לפיתוח חומרי הדברה ספציפיים לסוג.

מבנה גבישי של N-מסוף תחום של Ryanodine הקולטן של Plutella xylostella

גלה סרטונים נוספים