במבחנה שיטת לימוד הצבירה של חלבון טאו, והתרופות הקרנה

קיפול שגוי של חלבון טאו בהרכבה העצמית שלו לסילים סלליים מזווגים הוא סימן היכר פתולוגי של מחלת אלצהיימר וטאאופתיות אחרות. כאן אנו מציגים תדהמה חזקה של צבירת טאו שיכולה לעזור להבהר את תהליך הפתוגנזה של טאו. ההמרה עוקבת אחר כל השלבים של תהליך פולימריזציה תלוי גרעין והוא מאוד לשכפל, המאפשר הקרנת סמים בפורמט קפדני יותר כי פגש את רמת OBSI עד כה.

איכותם של חברי ההנהלה היא קריטית. טאו הרקומביננטי צריך להיות טהור מאוד ונוטה אגרגטים ושברים. הפעל תחילה את המחשב ואת קורא המיקרו-לוחות מרובי המודים.

לאחר מתן אפשרות לציוד להתייצב, הפעל את התוכנה ובחר פרוטוקול רגיל כסוג הפרוטוקול. הגדר את הטמפרטורה ל 37 מעלות צלזיוס ובחר חום מראש לפני שתמשיך את הפרוטוקול. לאחר מכן, הגדר את זמן הריצה הקינטי ל- 50 שעות ואת מרווח המדידה ל- 15 דקות.

הגדר את רעידת המסלול ל 425 מחזורים לדקה במצב רציף. לאחר מכן, בחר את שיטת הקריאה כנקודת קצה קינטית של נקודת קצה פלואורסצנטית. הגדר את אורך גל העירור ל-440 ננומטר ואת אורך גל הפליטה ל-485 ננומטר, את מיקום האופטיקה למעלה ואת הרווח ל-80.

בחר מהירות קריאה רגילה והגדר את גובה הקריאה ל- 4.50 מילימטרים. לאחר מכן אמת ושמור את הפרוטוקול. התחל את הריצה באמצעות הפרוטוקול שנוצר.

תן שם לניסוי, בחר את היעד של הקובץ החדש שנוצר ואפשר למכשיר לצייד מראש לטמפרטורה הרצויה. לניסוי המרת טאו רקומביננטי ספונטני, הכינו דגימת תגובה של 1,000 מיקרוליטר עם 800 מיקרוליטרים עבור פלואורסצנטיות תיופלבין-T, ו-130 מיקרוליטר לניתוח SEC-MALS על ידי ערבוב ראשון של החלבון עם מאגר התגובה בצינור 1.5 מיליליטר. לאחר מכן מוסיפים הפרין ו thioflavin-T ומערבבים היטב על ידי צינור למעלה ולמטה חמש פעמים.

חשוב לבצע את הפרוטוקול בדיוק כדי להבטיח רבייה גבוהה, לערבב reagents באותו סדר, ולשמור בתוך מסגרות זמן. לסובב את המדגם ב 12, 000 x גרם ו 25 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות כדי לחסל בועות אוויר. בעקבות צנטריפוגה לוותר 200 microliters של מדגם תגובה ל הבאר microplate 96-well, הימנעות היווצרות של בועות אוויר.

ואז לאטום את המיקרופלסטיק כדי למנוע אידוי. מקם את המיקרופלאט ב קורא מיקרופלסטיק רב-דוגמתי. בחרו לוח מלא, או אם הצלחת אינה מלאה, בחרו בארות לקריאה והתחלו את המדידה.

יצא את הנתונים לתוכנה לעיבוד נתונים. לאחר מכן הסר את המיקרופלסטיק מהציוד. לאחר מכן, הסר את האיטום מהמיקרופלסטיק.

מערבבים את המדגם המצטבר בארות על ידי צינור למעלה ולמטה פעמיים, ולאסוף את השכפולים השונים בצינורות 1.5 מיליליטר. מערבבים כל דגימה ביסודיות על ידי צינור למעלה ולמטה חמש פעמים, ולחלק 10 עד 20 microliters על משטח נציץ לניתוח אגרגטים על ידי מיקרוסקופ כוח אטומי. לאחר מכן, לקצור את הצבירה על ידי ספינינג כל צינור אחד 1.5 מיליליטר ב 20, 000 x g ו 4 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת.

נתח את העל-טבעי על-ידי SEC-MALS כדי לאשר את היעדר טאו מונומרית המדגם, המציין המרה מוצלחת לתוך אגרגטים. לאחר מכן, להסיר את כל supernatant הנותרים תווית הצינור 1.5 מיליליטר המכיל את הצבירה הנותרת עם ריכוז חלבון טאו רקומביננטי הראשוני ונפח מדגם. הצמד להקפיא את אגרגטים ולאחסן ב 80 מעלות צלזיוס.

לניסוי זרעים, הסירו את אגרגטי טאו הרקומביננטיים מהמקפיא, הוסיפו את נפח מאגר התגובות המצוין על התווית, ואפשרו לצינור להתייצב לטמפרטורת החדר. ואז להשתמש שוב את הצבירה על ידי צינור למעלה ולמטה חמש עד שמונה פעמים. Sonicate מדגם 200 מיקרוליטר מצטבר על קרח באמצעות 1/8 אינץ מיקרוטיפ לתקופה כוללת של 15 שניות עם פולסים של שנייה אחת על ושתי שניות את ב 30 אחוז משרעת.

לאחר מכן, הכינו דגימת תגובה של 800 מיקרוליטר על ידי ערבוב ראשון של החלבון עם מאגר התגובה בצינור של 1.5 מיליליטר. לאחר מכן מוסיפים הפרין ו thioflavin-T ומערבבים היטב על ידי צינור למעלה ולמטה חמש פעמים. לסובב את הדגימות ב 12, 000 x גרם ו 25 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות כדי לחסל בועות אוויר.

לאחר צנטריפוגה, לוותר 198 microliters של מדגם תגובה ל הבאר microplate 96-well, הימנעות היווצרות של בועות אוויר. הומוגניזציה של הדגימה הפיבראלית שנוצרה מראש על ידי צינור למעלה ולמטה שלוש פעמים. מוסיפים את הכמות המתאימה לאחוז הרצוי של זרעים לכל באר ומערבבים על ידי צינור למעלה ולמטה שלוש פעמים.

ואז לאטום את המיקרופלסטיק כדי למנוע אידוי. הנח את המיקרופלסטיק ב קורא המיקרו-לוחיות מרובה המודים והתחל את המדידה. לאחר השלמת הניסוי, הסר את המיקרופלסטיק מהציוד.

לאחר מכן יצא את הנתונים לגיליון אלקטרוני. רקומביננטי טאו המכיל את המוטציות C291A ו C322A ו n מסוף שלו ו c מסוף c תגים טהורים מאוד כפי שמדמיין בדף SDS וכמעט 100 אחוז מונומרי כפי שהוערך על ידי SEC-MALS. צבירת טאו רקומביננטי המושרה הפרין ואחריו פלואורסצנטיות thioflavin-T באמצעות אורך גל העירור של 440 ננומטר ואורך גל פליטה של 485 ננומטר.

הבדיקה ניתנת לשחזור מאוד עם תוצאות מ -10 בארות בודדות להיות כמעט בלתי ניתן להבחנה. אגרגטים טאו רקומביננטי הם תערובת הומוגנית של מבנים fibular באורכים שונים, בדומה דיווח מורפולוגיות לשעבר vivo. תערובת התגובה הסופית אינה מכילה מונומר, מה שמרמז על המרה מלאה לצבירות, כפי שמוצג על ידי מדידות SEC-MALS.

הקינטיקה של צבירת טאו רקומביננטית במהלכי ניסוי עצמאיים דומה, כפי שהודגש על ידי עקומות סיגמואידליות דומות שלבי השהיה וצמיחה בלתי ניתנים להבחנה. הרמה הגבוהה של רבייה נשמרת כאשר קבוצות שונות של חלבון משמשים. אגרגטים רקומביננטיים מראש טאו יעילים בגיוס מונומר טאו ו גרימת היווצרות אגרגטים דה נובו טאו, ואת היעילות של התהליך הוא פרופורציונלי ישירות עם אחוז הזרעים.

כמויות נמוכות כמו 0.0025 אחוזים של אגרגטים טאו מעוצב מראש לידי ביטוי בנפח מסוגלים לעקוף את הגרעין טאו רקומביננטי ולהפעיל דה נובו דור פיבראלי. הבדיקה הנוכחית מחקה את מה שנחשב ל-in vivo misfolding and aggregation של טאו ומאפשרת מחקרים מכניים שיכולים לשפוך אור על תהליך הפתוגנזה ומהווה כלי רב ערך להקרנת סמים ולחקר התערבותם של מועמדים לסמים בשלבים שונים של התהליך. הרבייה הגבוהה של ההתרשמות תאפשר למדענים ליישם אותה בקלות יחסית במעבדה.

למרות שההתמדה הנוכחית מתמקדת רק באיסופורם טאו הארוך ביותר, טאו-441 אנושי, ניתן להתאים את היישום ללימוד גרסאות טאו שונות. ואל תשכחו, בחירת reagents החלבון הנכון ולייצר אותם בסטנדרטים באיכות גבוהה חיוניים בהקמת מוסט חזק מאוד להתרבות.