Name: באמצעות טומוגרפיה אופטית קוהרנטית ותגובה Optokinetic כמו המפרט מבנית ופונקציונליים מערכת הראייה של עכברים וחולדות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-10T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: למד הערכת מבנה ותפקוד רשתית בעכברים וחולדות באמצעות טומוגרפיה אופטית קוהרנטית ותגובה אופטוקינטית. שיטות אלו מאפשרות מחקר לולייני לא פולשני לטיפול במחלות עיניים ונוירולוגיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים של ד ר רוברט Pfleger-קרן Ilselore Luckow-קרן, כמו גם Biogen ואת נוברטיס על אבא איור 1B שוחזר מ "לכל הגוף סימולטורי לפי מיקום עבור הדמיה עינית של מרדימים עכברים וחולדות: מדריך עשה זאת בעצמך. דיטריך, מ., קרוס-Herranz, ת., Yiu, ה, Aktas, O..., ברנדט, א. א, הארטונג, HP., ירוק, א, אלברכט, עיניים פתוחות עמ' BMJ. 1 (1), e000008, 2017" באישור BMJ קבוצת פרסום בע מ

כל ההליכים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות ניסיוני שאושרו על-ידי רשויות אזוריות (המדינה הסוכנות עבור טבע, איכות הסביבה, הגנת הצרכן; הפניה מספר 84-02.04.2014.A059) ו לציית האגודה במחקר חזון והצהרת רפואת עיניים (ארוו) שימוש של החיות לרפואת עיניים, מחקר חזון ואת אירופה הוראת 2010/63/האיחוד האירופי בנושא ההגנה על בעלי חיים משמשים למטרות מדעיות.
1. קונאפוקלית סריקת לייזר טומוגרפיה Ophthalmoscopy-אופטית קוהרנטית
הערה: הפרוטוקול עבור cSLO-אוקטובר מדידה היא יכולת הסתגלות עבור כל זני מעבדה עכברים וחולדות.
<ol><li>ההכנות הדמיה טרום הקמה הערה: לתצורת המערכת של המכשיר OCT בשימוש פרוטוקול זה כבר היה תיאר במקום31.</li>
	<li>
מכרסמים לקראת הרדמה נשימתית
	<ol>
<li>הכנס למכרסמים תא אינדוקציה ולהגדיר את מכשיר אידוי ריכוז איזופלוריין של 2%-2 ל'/דקה O2.</li>
		<li>בדוק אם למכרסמים הינו ומורדמת באמצעות צובט את הזנב, הסר אותו מן החדר, עטוף אותו במגבת נייר כדי לחמם את זה.</li>
		<li>הכנס למכרסמים מותאם אישית מחזיק33 לעשוק את החותכות בלסת העליונה בסרגל ביס משולב של היצירה הפה, מחובר את מכשיר אידוי (2.5% איזופלוריין ב 2 ל'/דקה O2).</li>
		<li>החל טיפה אחת של Phenylephrine 2.5%-Tropicamide 0.5% על כל עין על התרחבות האישון.</li>
		<li>. תנגב את הנוזל העודף של טיפות עיניים לאחר 1 דקות ולסוך את העיניים עם ג'ל אופטלמולוגיות מתיל-תאית מבוססת (למשל, טיפות עיניים 0.3% hypromellose) כדי למנוע ייבוש אאוט, עכירות של הקרנית.</li>
		<li>המקום מותאם אישית עדשות מגע (+4 diopters) על העין העכבר ביד או באמצעות מלקחיים. לכסות את העין עכברוש עם צלחת זכוכית (למשל, סיבוב coverslip זכוכית 12 מ מ קוטר) ללא מאפיינים אופטיים כדי להבטיח משטח המטוס. הערה: צג קצב נשימה במהלך הרדמה. להגדיל או להקטין ריכוז איזופלוריין במידת הצורך.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
מדידה וניתוח הערה: הקפד לבצע ואת הדו ח את המידות OCT בקנה אחד עם המלצות APOSTEL34 ולבצע בקרת איכות על-פי קריטריונים קונצנזוס35אוסקר-ליברות. כמו המלצות אלה פותחו עבור דמויות אנושיות OCT, מספר קריטריונים אינם או רק חלקית הישימים.<ol>
<li>לשיקוף של עין שמאל, הצב בעל כפי שהוצג ב- איור 1A כדי להבטיח כי הנורה עין שמאל של הפנים מכרסם את המצלמה.</li>
		<li>לחץ על לחצן התחל בפינה הימנית בתצוגת לוח הבקרה כדי להפעיל את מצב רכישה.</li>
		<li>הגדר את ידית מסנן R ובחר BR + OCT עבור השתקפות כחול הפונדוס הדמיה ורכישה B-scan בלוח הבקרה.</li>
		<li>מרחק מיקוד מוגדר כ 38 diopters באמצעות הידית להתמקד בצד האחורי של המצלמה, תקריב על הרשתית, עד אוקטובר הסריקה הוא נראה לעין על המסך. הערה: את המדידה הראשונה, ליד הפניה יש להתאים למדידה מכרסמים. להקיש את הצירוף Ctrl + Alt + Shift + O ולהתאים את הערך של הזרוע ההתייחסות בחלון פתוח עד אוקטובר-הסריקה מופיעה על המסך.</li>
		<li>כדי להבטיח נתיב קרן דרך האמצע של התלמיד עם זווית אורתוגונלית ברשתית, כל המטוסים, מקם את התקליטור האופטי במרכז השדה מואר (BR) ולהתאים אופקיים ואנכיים קו B סריקות ברמה אופקית על ידי סיבוב/מפנה המחזיק (איור 1B) או הזזת המצלמה.</li>
		<li>בחר את מצב סריקה של אמצעי האחסון ולהגדיר אותו לסריקות-25 B במצב ברזולוציה גבוהה ב 50 אוטומטי מעקב בזמן אמת אחר (אמנות, עם רסטר מ 50 בממוצע של סריקות) במסך התוכנה.</li>
		<li>מרכז באמצע של הרשת סריקת אמצעי האחסון בדיסק האופטי ולהתחיל רכישה על-ידי הקשת את הידית רגישות שחור ולאחר מכן תתחבר בלוח הבקרה.</li>
		<li>הגדר את ידית מסנן A, בחר Florescence אוטומטי כחול (BAF) בלוח הבקרה ולהתאים בהירות תמונה עם הידית רגישות. הקש את רגישות כפתור ולאחר מכן תתחבר התמונה פלואורסצנט תאים (למשל, EGFP) או פיקדונות פלורסנט אוטומטית.</li>
		<li>למרוח ג'ל אופטלמולוגיות העין של מכרסמים כדי למנוע התייבשות, לשים את החיה בכלוב נפרד עם מקור חום.</li>
		<li>לפקח על מכרסמים עד החלים לחלוטין מן ההרדמה, בכלוב נפרד והוא שוכן בנפרד. כאשר בעל-החיים אמבולטורי, להחזיר אותו לכלוב הביתה.</li>
		<li>לצורך ניתוח של הסריקות אמצעי אחסון, להשתמש את פילוח אוטומטית של התוכנה של המכשיר OCT על-ידי לחיצה ימנית על הסריקה ובחר פילוח אז כל השכבות. ודא כי האיכות של התמונות OCT מספיקה ולהגדיר את המכנסונים איכות עבור כל ערכה של ניסויים, למשל> 20 דציבלים.</li>
		<li>לבצע תיקון ידני של השכבות על-ידי לחיצה כפולה על הסריקה הרצוי, בחר עובי הפרופיל ולחץ על ערוך שכבה Segmentations. בחר שכבה אחת, למשל, הקש ILM עבור הגבלת הממברנה הפנימית, ולתקן, במידת הצורך, הקו הירוק על-ידי הזזת נקודות אדומות על ידי לגרור ולשחרר המיקום הנכון. הערה: ודא כי החוקר מבצע את התיקון ידנית היא מתעוורת עבור הקבוצות ניסיוני.</li>
		<li>בחר את הכרטיסיה עובי מפה ובחרו את הטיפול מוקדם 1, 2, 3 מ מ של רשת המחקר (ETDRS) רטינופתיה סוכרתית. מרכז המעגל הפנימי בדיסק האופטי (איור 2, משמאל).</li>
		<li>חישוב עובי שכבות הרשתית מתוך הערכים עובי שמספקת התוכנה עבור המגזרים רשתית שונות של עניין. כדי לחשב ערכי כלומר עובי האחסון סריקות, השתמש של כל 1, 2, 3 מ מ ETDRS רשת, אשר מכסה זווית של-25°, למעט המעגל הפנימי 1 מ מ, אשר מכיל את התקליטור האופטי (איור 2, נכון).</li>
		<li>לבצע ניתוח סטטיסטי באמצעות תוכנה מתאימה. אם בשתי העיניים של חיה הינם כלולים, שקול מודל סטטיסטי לדעה בתוך הנושא הבין-עין מתאמים (למשל, כללית הערכת משוואות או מעורב מודלים ליניאריים), כמו העיניים של נושא אחד תלויות מבחינה סטטיסטית36 .</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Optokinetic תגובה
הערה: בחלק זה, מסופק המדריך מפורט OKR המידות של עכברים וחולדות, אשר ניתן להתאים לצרכים ספציפיים.
<ol><li>
ההכנות מדידה טרום הקמה
	<ol>
<li>הפעל את המחשב. לאחר יש אתחול המערכת, הפעל המסכים של התא בדיקה כמתואר בפירוט רב יותר במקום אחר37.</li>
		<li>בחר את הפלטפורמה המתאימה עבור המידה של עכברים או חולדות. הערה: גודל פלטפורמה נבחרה בהתבסס על גודל הגוף למכרסמים. בעל החיים צריך להיות מסוגל לשבת כמו שצריך על פלטפורמה ללא היכולת להסתובב.</li>
		<li>פתח בחלון הגדרות מראש על-ידי לחיצה כפולה על התוכנה, בחר קבוצה חדשה ובחר את שם הקבוצה, מספר נושאים, מינים זנים. בחר גירוי משתנה: תדירות מרחבית/זמני, רגישות חדות, מהירות או התמצאות בתפריט הנפתח, והקש ליצור קבוצה חדשה.</li>
		<li>להתמקד על פלטפורמת בכך ששינה את הטבעת המוקד של המצלמה על גבי התא, לכייל את המערכת על ידי יישור (גרור ושחרר) העיגול האדום סביב העיגול השחור על הרציף.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
מדידה וניתוח
	<ol>
<li>במקום החיה על הרציף, תן לו להסתגל לסביבה עבור ~ 5 דקות להרים החיה בחזרה על פלטפורמה לנחיתה (איור 3 א).</li>
		<li>בחר נושא מספר תנאי בפינה הימנית העליונה של המסך תוכנה (איור 3B). גירוי אחד משתנה, הגירויים אחרים נשמרים קבועים. זה אושר על ידי סמל מנעול פתוח או סגור מנעול ליד הגירוי.</li>
		<li>המדידה התחל על-ידי בחירת ◄ כן או ■ לא, אם החיה עוקב אחר או אינה עוקבת אחר, בהתאמה. הערה: מעקב עם כיוון השעון מקביל המעקב נגד כיוון השעון ושמאלה אל העין הימנית. התוכנה משנה באופן אקראי את הכיוון של הרשת נע.</li>
		<li>בחר את גודל שלב הגירוי באופן ידני על-ידי לחיצה על החצים למעלה , למטה ליד הגירוי משתנה או לתת זה להתאים באופן אוטומטי על-ידי התוכנה, אם סף הגירוי מתכנסת.</li>
		<li>לקבלת תוצאות אופטימליות, להנפיש החיה, , למשל על ידי גבוהה שורק נשמע במבלט, על-ידי לחיצה על סימן התיבה שחור או לבן על המסך תוכנה. בצע פעולות אלה שוב ושוב במקרה של מדידות ממושך.</li>
		<li>עבור ניתוח נתונים, בחר את הכרטיסיה סיכום , לחץ על קובץ | ייצוא טבלה/גרף כדי לייצא ערכת הנתונים הרצוי.</li>
		<li>לבצע ניתוח סטטיסטי באמצעות התוכנה הרצויה (ראה גם שלב 1.3.15).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

לא קשור לעבודה. הציגו שהמחברים מצהירים על גילויים הפיננסיים הבאים:
דיטריך מייקל קיבל רמקול honoraria נוברטיס. אנדרס קרוס-Herranz הוא בחור דוקטורט של האגודה לטרשת נפוצה הלאומית. ארי ג'יי ירוק מוגש למועצה המדעית המייעצת של MedImmune, נוברטיס, OCTIMS, ראשית החיים 5 ו Bionure; היא עורכת-משנה לנוירולוגיה ג'אמה; היה חבר מועצת המנהלים העריכה לנוירולוגיה; בעל פטנט על מולקולות remyelination מסלולים; יש להתייעץ עם הקמתה 5 מדעי; המחקר קיבל תמיכה של נוברטיס פארמה OCTIMs הקמתה מדעי ההזמנות, NINDS, ניה, חברה MS לאומית, Sherak קרן, קרן הילטון; מחזיק מניות או אופציות הקמתה 5; שימש כעד מומחה-v Mylan פארמה טבע. הנס פטר הארטונג קיבלה דמי הגשה על ועדות ההיגוי של Biogen איידק, GeNeuro, סאנופי ג'נזיים, מרק, נוברטיס פרמצבטיקה, Octapharma, Opexa הרפוי, טבע, MedImmune, Bayer HealthCare, קדימה פארמה, ו רוש דמי הגשה על לוחות המייעצת Biogen איידק, סאנופי ג'נזיים, מרק, נוברטיס פרמצבטיקה, Octapharma, Opexa הרפוי, במוטורולה, רוש, הרצאה תעריפים מעת Biogen איידק ג'נזיים סאנופי, מרק, נוברטיס פרמצבטיקה , Octapharma, Opexa הרפוי, במוטורולה, MedImmune ורוש. פיליפ אלברכט קיבל פיצוי על ההגשה על גבי לוחות המדעית המייעצת Ipsen, נוברטיס, Biogen; הוא קיבל רמקול honoraria ולנסוע תמיכה נוברטיס, טבע, Biogen, תרופות Merz, Ipsen, Allergan, Bayer Healthcare, איסיי, UCB, גלקסו סמית קליין; הוא קיבל תמיכה במחקר של נוברטיס, Biogen, טבע, Merz תרופות, Ipsen רושה. המחברים אחרים מדווחים אין גילויים.

פרוטוקול זה מספק הוראה המדידות עובי, הבחינה של תפקיד הראייה בחולדות. המפרט חזותיים משמשים יותר ויותר המחקר translational18,26,38,39,40 , המתעכבים בקלות ניסויים קליניים. היתרון המשמעותי של OCT בהשוואה חקירות היסטולוגית בניסויים על בעלי חיים היא ניתוחי האורך עלול לאפשר החקירה של תהליכים פתולוגיים דינאמיים, בעיקר צמצום מידת ההשתנות ואת המספר של בעלי החיים זקוקים לכל מחקר. יתר על כן, אין ויוו הדמיה עם OCT כפוף לא יציבות, חיתוך או צביעת חפצים, אשר עשוי להשפיע על עובי השכבה בחקירות היסטולוגית.
אולם, כיוון אורתוגונלית קרן הלייזר בתוך כל המטוסים ביחס הרשתית הוא שלב קריטי כדי להבטיח את האיכות ואת הפארמצבטית הערכים עובי. זה דורש אימון של החוקר, והוא חובה לפני הרכישה של OCT סריקות. בנוסף, כפי המכשירים מסחרי נבנים עבור יישומים אנושי, איכות התמונות OCT מכרסמים הוא עדיין נחות בהשוואה ל- B-סריקות של בני אדם חולים. בחוויה של המחברים, זה יכול להיות קשה להבחין את רשתית הפנימי שונה שכבות (סיבי עצב ברשתית שכבה, שכבת תאים גנגליון, השכבה הפנימית plexiform) במהלך תיקון ידני. לכן מומלץ ניתוח שכבות אלה כמו הבדיקה מורכב (IRL).
הגדרת הניסוי מספקת אפשרות לקבלת הרדמה נדיפים, למשל, נשימתית איזופלוריין, אשר הוא, מניסיוננו, יותר קל לשלוט מאשר זריקות הרדמה, למשל, קטמין-חריגות השירותים הווטרינריים41,42 , מפחיתה את הסיכון התעוררות מוקדמת של מכרסמים במקרה של רכישה יותר פעמים (למשל, בעת ביצוע הדמיה של תאים עם תוויות ברורות fluorescently). מחקר ראשוני, נפח הסריקות אותרו כמו הפרוטוקולים עם הגבוה ביותר תוקף ומהימנות. מהימנות הבחינה מדרג בין ובדיקה מעולה כאשר נפח סריקות למעט החלק המרכזי המכיל את התקליטור האופטי היו העריך עם ICC ערכים (מקדם המתאם אינטרה-class) מעל 0.85 עבור כל הערכות.
המדד של התגובה optokinetic מבוסס על רפלקס לא רצוני optokinetic, אשר מתרחשת בתגובה שדה נע באופן רציף. בחולדות, בניגוד מינים אחרים, התנועה כרוך לא רק העיניים, אבל הראש הזה, אשר בקלות ניתן לאתרם באמצעות המצלמה.
הבחנה בין "מעקב" או נורמלי תנועות ההתנהגות של בעלי החיים דורש הכשרה של החוקר וזה חשוב להיות עיוור עבור קבוצת הניסוי. בנוסף, בעלי החיים זקוקים שלב התאקלמות כדי להכיל את ההגדרה ניסיוני ובמהלכה מדידה ותיק פרוטוקולים, החיות חייב להיות אנימציה שוב ושוב כדי להבטיח כי "אין מעקב" הוא בשל להגיע לסף OKR ולא על הפחתת תשומת לב. יש גם השתנות המתח משמעותי לגבי הפונקציה חזותי של מעבדה עכברים וחולדות43,44. לכן צריך ניתן להעריך את חדות הראייה של מכרסם לפני שהם נבדקים זנים מסוימים, כגון עכברים SJL, אפילו עשוי להיות לא מתאים מדידות OKR, כפי שהם homozygous עבור אלל Pde6brd1 (ניוון הרשתית 1).
לסיכום, בחינת תפקיד הראייה ומורפולוגיה ברשתית במודלים של בעלי חיים מאפשר החקירות לא פולשנית, האורך של נזק תפקודי מבניים המתרחשים בהקשר של EAE והוא עשוי להיות שימושי במודלים אחרים המערבים את התמונה מערכת, כולל אך לא מוגבל הדגמים של retinopathies או פציעה של עצב הראייה.

הבדיקה של מסלול ויזואלי, כחלק של מערכת העצבים המרכזית, הוכח להיות נקודת מוצא יעיל בטיפול לא רק ophthalmologic1,2,3,4,5 , אבל גם נוירולוגיים6,7,8,9,10,11,12,13,14 ,15,16 שאלות. בשנים האחרונות, OCT ו OKR זוהו כלים אנליטיים, לא פולשנית שימושיים כדי להעריך את מגוון גדול של retinopathies, רשתית ביטויים שונים מכרסמים מודלים17,18,19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25. OCT מאפשר רזולוציה גבוהה ומהירה ויוו ויזואליזציה של מורפולוגיה ברשתית, מבנה עכברים וחולדות, עם תוצאות בהתאם טוב עם מקטעים היסטולוגית של חיות retinae26. OKR מהווה שיטה חזקה ומהירה כדי להעריך באופן כמותי את תפקיד הראייה.
התקנים רבים OCT מאפשרים סימולטני קונאפוקלית סריקת לייזר ophthalmoscopy (cSLO) הדמיה עם אורכי גל שונים, אשר מספק מידע אבחון על פתולוגיות ברשתית, קרי, ויזואליזציה של הפקדות lipofuscin או שינויים של הרשתית פיגמנט אפיתל27. יתר על כן, אין ויוו הדמיה של זריחה מתויג תאים בעלי החיים הטרנסגניים הוא אפשרי28,29,30,31,32. עם זאת, היישום של טכנולוגיה OCT במודלים מכרסמים הוא עדיין מאתגר, בעיקר בשל גודל העין קטן. מספר התקנים זמינים מסחרית דרוש עיבודים, לעיתים קרובות גודל אחר מחזיק נדרשת תמונה החיות של מינים שונים. בנוסף, בעלי חיים לדרוש הרדמה למדידה.
OKR התקנים יכול לשמש כדי להעריך את הפונקציה חזותיים במכרסמים. החיות ממוקמות על פלטפורמה במרכז גליל בפועל או וירטואלי הצגת נע grating, אשר החיות המסלול עם הראש רפלקסיבי ותנועות הצוואר. תגובה optokinetic זו מצומצמת או מסולק במקרה של הפחתת או אובדן התפקוד חזותי.
המטרה של פרוטוקול זה היא להציג את המדריך מדידת עובי הרשתית באמצעות מכשיר OCT זמינים מסחרית עם בעל מותאם אישית במתן הרדמה נשימתית. הפרוטוקול מדגים כיצד לנתח סריקות אמצעי אחסון באמצעות התוכנה המצורפת על ידי היצרן. בדיקה חזותית, המטרה היא לספק הוראות כיצד להשתמש במערכת זמינים מסחרית כדי להעריך את OKR.

<table><tbody><tr><td>מערכת היידלברג ספקטרליס HRA+OCT&nbsp;</td><td>היידלברג הנדסה, גרמניה</td> N<td>/A</td><td>מערכת פלטפורמת הדמיית עיניים</td></tr><tr><td>היידלברג Eye Explorer</td><td>היידלברג הנדסה, גרמניה</td><td>N/A</td><td>גרסה 1.9.10.0</td></tr><tr><td>כחולה 25D ללא מגע</td><td>היידלברג הנדסה, גרמניה</td><td>עדשת N/A</td><td>למדידת מכרסמים</td></tr><tr><td>OptoMotry</td><td>CerebralMechanics Inc., קנדה</td> מערכת <td>N/A</td><td>לניתוח תפקודי ראייה</td></tr><tr><td>תוכנת OptoMorty HD</td><td>CerebralMechanics Inc., קנדה</td><td>N/A</td><td>גרסה 2.1.0</td></tr><tr><td>אינהלציה הרדמה איזופלורן</td><td>פיראמל טיפול קריטי, בית לחם, פנסילבניה, ארה"ב&nbsp;</td><td>803250</td><td>הרדמה בשאיפה</td></tr><tr><td>פנילפרין 2.5%-טרופיקמיד 0.5%&nbsp;</td><td>בית החולים האוניברסיטאי D&uuml; sseldorf, גרמניה</td><td>N/A</td><td>הרחבת אישונים&nbsp;</td></tr><tr><td>Visc-Ophtal</td><td>Dr. Robert Winzer Pharma GmbH, ברלין, גרמניה</td><td>58407</td><td>ג'ל עיניים</td></tr> עיניים <tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad Software Inc, סן דייגו, קליפורניה, ארה"ב</td><td>תוכנת</td><td>ניתוח סטטיסטי, גרסה 5.00</td></tr><tr><td>IBM SPSS Statistics</td><td>IBM Corporation, Armonk, ניו יורק, ארה"ב</td><td>תוכנת</td><td>ניתוח סטטיסטי, גרסה 20</td></tr></tbody></table>

באמצעות טומוגרפיה אופטית קוהרנטית ותגובה optokinetic כמו המפרט מבנית ופונקציונליים מערכת הראייה של עכברים וחולדות

Using Optical Coherence Tomography and Optokinetic Response As Structural and Functional Visual System Readouts in Mice and Rats

טומוגרפיה אופטית קוהרנטית (אוקטובר) היא טכניקה מהירה, לא פולשנית, interferometric ומאפשר הדמיה הרשתית ברזולוציה גבוהה. זה כלי אידיאלי לחקירה של תהליכים הקשורים ניוון מוחיים, neuroprotection, נוירו-תיקון הכוללים מערכת הראייה, כמו אלה correlate לעיתים קרובות עם שינויים ברשתית. כמו את המחוון פונקציונלי תנועות ראש ועין ישימים מבחינה ויזואלית עורר משמשות בדרך כלל ניסיוניות המערבים את הפונקציה חזותי. שילוב של שתי טכניקות מאפשר חקירה ויוו כמותית של מבנה ותפקוד, אשר יכול לשמש כדי לחקור את התנאים פתולוגיים או להעריך את הפוטנציאל של הריפוי. יתרון גדול של טכניקות הציג האפשרות לבצע ניתוחי האורך מאפשר החקירה של תהליכים דינאמיים, הפחתת השתנות, מצמצם את מספר בעלי חיים לצורך הניסויים. הפרוטוקול המתואר שואפת לספק מדריך רכישת וניתוח של סריקות רשתית באיכות גבוהה של עכברים וחולדות באמצעות בעל עלות נמוכה מותאם אישית עם אפשרות לספק הרדמה inhalational. בנוסף, המדריך המוצעת מיועדת כמו חוברת הוראות לחוקרים באמצעות ניתוח התגובה (OKR) optokinetic בחולדות, אשר ניתן להתאים לצרכים הספציפיים ואת האינטרסים שלהם.

באמצעות 3rd דור OCT הדמיה ב המיאלין אוליגודנדרוציטים גליקופרוטאין (ש א) פפטיד המושרה מודלים העכבר ניסיוני אוטואימוניות דלקת המוח וחוט השדרה (EAE), סעיפים מורפולוגי ברזולוציה גבוהה של הרשתית העכבר התקבלו. באמצעות טכנולוגיה זו, היכולות מגן מחומרים שונים היו והפגינו17. הערכים עובי השכבות ברשתית הפנימי (IRL) שהתקבלו הם טובים בהתאם המספרים של תאי גנגליון (מהרשות לשיקום האסיר) מתקבל על ידי צביעת היסטולוגית של הרשתית wholemounts (איור 4).
OKR ניטור מספק פונקציונלי readout הקשורים ניוון מוחיים ראיתי על-ידי OCT. בניסויים אלה, תפקיד הראייה לאומדן כמו תדירות מרחבית OKR, ואת הנזק neuroaxonal העריכו כמו IRL דליל על-ידי OCT, היו קרובים הקורלציה17. יכול להיות מועסק פרוטוקולים שונים כדי לבחון את חדות הראייה על ידי שינוי תדירות מרחבית או הזמנית, רגישות חדות, התמצאות או מהירות של הרשת נע. במודל EAE, זוהה של תדירות מרחבית משופרת של 0.05 מחזורים/תואר (c/d) של בעלי חיים מטופלים עם חומר 1 בהשוואה ל ש א-EAE שלא טופלו עכברים (איור 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58571/58571fig1.jpg"> איור 1: מותאם אישית מחזיק למדידה OCT. (א) OCT הדמיה של עכבר C57BL/6J שימוש מותאם אישית מחזיק33 ו- (B) ציר הסיבוב סביב העין מכרסמים. הוא הפגין סיבוב במטוס רוחבי (משמאל) ולא במישור צירית (מימין). איור זה שונה מדיטריך, מ et al.33. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58571/58571fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58571/58571fig2.jpg"> איור 2: OCT פוסט ניתוח רכישת. "1, 2, 3 מ מ" רשת ETDRS בפרוטוקול 25 B-scan נפח (משמאל). עובי שכבות הרשתית מסופק עבור המגזרים השונים הרשתית על ידי התוכנה (מימין). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58571/58571fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58571/58571fig3.jpg"> איור 3: OKR מדידה של עכברים, גירוי הגדרות. מבט מלמעלה (א) דרך המצלמה ניתוח עכבר C57BL/6J על פלטפורמת בבית הבליעה. (B) ממשק המשתמש ואת ההגדרות של התוכנה OKR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58571/58571fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58571/58571fig4.jpg"> איור 4: C57BL/6J עכברים עם ש א EAE הצג מסלול המחלה הקלוש כאשר מטופלים עם חומר 1 לעומת שולט לא מטופל. (א) התנוונות רשתית לשכבות הפנימיות הוא מופחת (B) ולא במישור הקליני EAE הציון הוא נחלש במהלך הקורס EAE כאשר חומר 1 היה מנוהל. עכברים זכו מדי יום, OCT מדידות בוצעו מדי חודש על פני תקופה של 120 ימים. הגרפים מייצגים את אומר, שגיאת תקן של חיות לפחות עשרה לכל קבוצה. (*p &lt; 0.05, * * *p &lt; 0.001, אזור תחת עקומת מאת אנובה לעומת הבדיקה לאחר הוק של Dunnett). (ג) השינוי עובי IRL הוא בהתאם טוב עם אובדן מהרשות לשיקום האסיר (* * *p &lt; 0.001, מאת אנובה עם הבדיקה לאחר הוק של Dunnett בהשוואה ל ש א לא מטופל עכברים). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58571/58571fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58571/58571fig5.jpg"> איור 5: OKR מדידה של C57BL/6J עכברים עם ש א-EAE. (א) OKR מגלה ראייה משופרת של חיות מטופלים עם חומר 1 בהשוואה שלא טופלו עכברים EAE ש א נמדדת סף בתדר המרחבי בדיקות על פני תקופה של 120 ימים. הגרפים מייצגים את מתכוונת שגיאת תקן של חיות לפחות שש לכל קבוצה (* *p &lt; 0.01, * * *p &lt; 0.001, אזור תחת עקומת מאת אנובה לעומת הבדיקה לאחר הוק של Dunnett). (B) תמונה של עכבר C57BL/6J בחדר הבדיקה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58571/58571fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

פרוטוקול מפורט להערכה של המפרט מבנית וחזותית בחולדות על ידי תגובת טומוגרפיה ו optokinetic אופטית קוהרנטית מוצג. התוצאות מספקים תובנות בעלות ערך מחקר ophthalmologic, כמו גם רגשיות ונוירולוגיות.

באמצעות טומוגרפיה אופטית קוהרנטית ותגובה Optokinetic כמו המפרט מבנית ופונקציונליים מערכת הראייה של עכברים וחולדות

Optical coherence tomography (OCT) is a fast, non-invasive, interferometric technique allowing high-resolution retinal imaging. It is an ideal tool for ...

שיטות אלה יכולות לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הנוירולוגיה ורופאתלמולוגיה, ולעזור להעריך מגוון גדול של רטינופתיות וביטויים ברשתית במודלים שונים של מכרסמים. היתרון העיקרי של טכניקות אלה הוא שניתן לבצע חקירות אורך לא פולשניות, להפחית את השונות ולצמצם את מספר בעלי החיים הדרושים לניסויים. שיטות אלה מאפשרות חקירה כמותית של vivo של מבנה ותפקוד אשר ניתן להשתמש בהם כדי לחקור את התנאים הפתולוגיים, או להעריך את התועלת הפוטנציאלית של טיפולים חדשניים.עם זאת, במיוחד היישום של טכנולוגיית טומוגרפיה קוהרנטית אופטית במודלים מכרסמים הוא עדיין מאתגר, בעיקר בגלל גודל העין הקטנה. הדגמת ההליכים תהיה מייקל דיטריך, דוקטורנט מהמעבדה שלנו. לאחר הרדמה המכרסם, להחיל טיפה אחת של פנילפירין טרופיקמיד על כל עין עבור תדלוח אישונים.לנגב את כל טיפת עיניים עודף רטוב אחרי דקה אחת. ולשמן את העיניים methylcellulose מבוסס ג'ל עיניים כדי למנוע ייבוש העין ויצירת קרנית עגמומי. לאחר מכן השתמש במדפים כדי למקם עדשת מגע מותאמת אישית על העין.לחץ על לחצן התחל בפינה השמאלית של צג לוח הבקרה כדי להפעיל את מצב הרכישה. לאחר מכן, כדי לדמיין את העין השמאלית, מקם את המחזיק כדי להבטיח כי נורת העין השמאלית של המכרסם פונה למצלמה. הגדר את רמת המסנן ל- R ובחר BR ו- OCT עבור הדמיית fundus של השתקפויות כחולות ורכישת סריקת B בתוכנה.לאחר מכן, הגדר את מרחק המיקוד לכ- 38 דיוטרס, באמצעות ידית המיקוד בגב המצלמה. והגדל את הרשתית, עד שסריקת OCT תהיה גלויה על המסך. לאחר מכן, כדי להבטיח נתיב קרן דרך אמצע האישון, עם זווית אורתוגונלית של הרשתית בכל המישורים, מקם את הדיסק האופטי באמצע השדה המואר.ולהתאים את הקו האופקי והאנכי B-סריקות לרמה אופקית על ידי סיבוב המחזיק. במסך התוכנה בחר את מצב סריקת העוצמה והגדר אותו ל- 25 סריקות B במצב רזולוציה גבוהה ב- 50 מעקב אוטומטי בזמן אמת. מרכז את מרכז רשת סריקת אמצעי האחסון בדיסק האופטי והתחל ברכישה על-ידי לחיצה על ידית הרגישות השחורה ולאחר מכן רכוש בלוח הבקרה.לאחר השלמת הרכישה, הגדר את רמת המסנן ל- A.Select Blue Autofluorescence בלוח הבקרה. ולהתאים את בהירות התמונה עם ידית הרגישות. לחץ על ידית הרגישות ולאחר מכן רכוש לתאי פלואורסצנט תמונה או מרבצי שפעת אוטומטית.לניתוח סריקות עוצמת הקול, השתמש בפילוח האוטומטי של התוכנה של התקן OCT על-ידי לחיצה באמצעות לחצן העכבר הימני על הסריקה. ובחר פילוח ולאחר מכן את כל השכבות. בצע תיקון ידני של השכבות על ידי לחיצה כפולה על הסריקה הרצויה.בחר פרופיל עובי. ולחצו על 'עריכת פילוח שכבות'. בחרו שכבה אחת בכל פעם.ואם יש צורך לתקן את הקו הירוק על ידי הזזת הנקודות האדומות על ידי גרירה ושחרור למיקום הנכון. לאחר מכן בחר את הכרטיסיה מפת עובי. בחר את רשת ETDRS 1, 2, 3 מילימטר.מרכז את העיגול הפנימי בדיסק האופטי. לבסוף, לחשב את העובי של שכבות רשתית מתוך ערכי העובי המסופקים על ידי התוכנה עבור מגזרי הרשתית השונים של עניין. כדי לחשב את ערכי העובי העיקריים מסריקות עוצמה, השתמש בכל רשת ETDRS של 1, 2, 3, מילימטר המכסה זווית של כ- 25 מעלות, למעט העיגול הפנימי המילימטר המכיל את הדיסק האופטי.התחל בבחירת פלטפורמה למדידת המכרסמים. פתח את החלון קביעות מוגדרות מראש על-ידי לחיצה כפולה על התוכנה. בחר קבוצה חדשה ובחר את שם הקבוצה, מספר הנבדקים, המינים והזנים.בחר גירוי משתנה, תדר מרחבי, רגישות לניגודיות, מהירות או כיוון בתפריט הנפתח ולחץ על צור קבוצה חדשה. התמקד בפלטפורמה על ידי מניפולציה טבעת המיקוד של המצלמה על גבי התא. וכיול המערכת על ידי יישור העיגול האדום סביב העיגול השחור על הרציף.לאחר מכן, מניחים את המכרסם על הפלטפורמה ולתת לו להסתגל לסביבה במשך כחמש דקות. לאחר מכן התחל את המדידה על-ידי בחירת החץ השמאלי עבור כן או הריבוע עבור לא, אם החיה עוקבת אחר או אינה עוקבת אחר בהתאמה. בחר באופן ידני את גודל הצעד של הגירוי על ידי לחיצה על החצים למעלה ולמטה ליד הגירוי המשתנה.לבסוף, בחר בכרטיסיה סיכום ולחץ על הקובץ, ייצוא טבלה או גרף כדי לייצא את ערכת הנתונים הרצויה. התוצאות מצביעות על כך שהניוון של שכבות הרשתית הפנימית מצטמצם. וציון קליני EAE הוא התמתה במהלך קורס EAE כאשר חומר 1 היה מנוהל.יתר על כן, OKR מגלה חדות ראייה משופרת של בעלי חיים שטופלו בחומר 1 בהשוואה לעכברי MOG EAE לא מטופלים הנמדדים על ידי בדיקות סף תדר מרחבי על פני תקופה של 120 ימים. בעת ביצוע מדידות OCT, צעד קריטי הוא הכיוון האורתוגונאלי של קרן הלייזר בכל המישורים ביחס לרשתית כדי להבטיח את האיכות וההתרבות של ערכי העובי. עבור טכניקת OKR, הבחנה בין מעקב ותנועות התנהגותיות נורמליות של החיה, דורשת הכשרה מסוימת של החוקר.חשוב להיות עיוור עבור קבוצת הניסוי. בעקבות חקירות אלה של נזק מבני ותפקודי המתרחשים בהקשר של אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית, ההליך עשוי גם להיות מועיל במודלים אחרים המערבים את מערכת הראייה, כולל אך לא מוגבל למודלים של רטינופתיות, או פגיעה עצבית אופטית. טכניקות אלה לסלול את הדרך למחקר in vivo בתחומי נוירולוגיה ורופאתלמולוגיה והם ניתנים להעברה בקלות לניסויים קליניים.

using-optical-coherence-tomography-optokinetic-response-as-structural

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

מקור: Jagodzinska, J., et. al., טומוגרפיה קוהרנטית אופטית: הדמיית תאי גנגליון רשתית של עכבר ב-Vivo. J. Vis. Exp. (2017)  בסרטון זה, אנו מדגימים את השימוש בטומוגרפיה קוהרנטית אופטית בתחום ספקטרלי (SD-OCT) כדי לדמות שכבות רשתית ולהעריך שינויים מבניים במודל עכבר מהונדס גנטית עם נוירופתיה אופטית.

הדמיה in vivo של רשתית העכבר באמצעות טומוגרפיה קוהרנטית אופטית

כתב יד זה מתאר פרוטוקול עבור ויוו ההדמיה של הרשתית עכבר עם טומוגרפיה אופטית קוהרנטית בתחום ספקטרלי ברזולוציה גבוהה (SD-אוקטובר). הוא מתמקד תאי גנגליון (מהרשות לשיקום האסיר) באזור peripapillary, עם מספר סריקה וכימות הגישות שתוארו.

טומוגרפיה אופטית קוהרנטית: הדמיה העכבר גנגליון תאים In Vivo

פרוטוקול זה מתאר איך ברזולוציה גבוהה טכניקות הדמיה כגון טומוגרפיה אופטית קוהרנטית בתחום ספקטרלי, סריקת לייזר ophthalmoscopy יכול להיות מנוצל מכרסמים קטנים, באמצעות מערכת פלטפורמה אופטלמולוגיות הדמיה, כדי לקבל מידע על עובי רשתית, microglial תא הפצה, בהתאמה.

אין ויוו הדמיה של עכברים כתב Cx3cr1gfp/gfp עם תחומים הספקטרום טומוגרפיה אופטית קוהרנטית, סריקת לייזר Ophthalmoscopy

, כדי לבחון את ראיית העכבר. ערכנו מבחן מתנשא עכברים הוצבו בזירה מרובעת גדולה עם צג על התקרה שלו. הגירוי החזותי מתנשא בעקביות עורר הקפאת או תגובות הטיסה בעכברים.

באמצעות גירויים חזותיים מתנשא להערכת חזון העכבר

כאן, אנו מתארים את השימוש בטומוגרפיית קוהרנטיות אופטית בתחום ספקטרלי (SD-OCT) כדי לדמיין מבנים ברשתית ובעין in vivo במודלים של ניוון רשתית, גלאוקומה, רטינופתיה סוכרתית וקוצר ראייה.

הערכות מבניות In vivo של מחלות עיניים במודלים של מכרסמים באמצעות טומוגרפיה קוהרנטית אופטית

ניוון עצבי הן בעיניים והן במוח כתוצאה מסוכרת ניתן לראות באמצעות בדיקות התנהגותיות שבוצעו על מכרסמים. מבוך ה-Y, מדד לקוגניציה מרחבית, ותגובת האופטומוטור, מדד לתפקוד חזותי, מספקים תובנה על אבחנות וטיפולים פוטנציאליים.

הערכה התנהגותית של תפקוד חזותי באמצעות תגובת Optomotor ותפקוד קוגניטיבי באמצעות Y-Maze בחולדות סוכרתיות

כאן, אנו מתארים פרוטוקול אופטימלי לחסימת ורידים ברשתית באמצעות ורד בנגלי ומערכת מיקרוסקופ הדמיית רשתית מונחה לייזר עם המלצות למקסם את יכולת השחזור שלה בזנים מהונדסים גנטית.

אופטימיזציה של מודל העכבר לחסימת ורידים ברשתית כדי להגביל את השונות

כאן אנו מתארים טכניקת הדמיה in vivo באמצעות טומוגרפיה קוהרנטית אופטית כדי להקל על האבחון והמדידה הכמותית של רטינופתיה בעכברים.

יישום טומוגרפיה של קוהרנטיות אופטית למודל עכבר של רטינופתיה

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את השלבים ליישור תמונות טומוגרפיה של טומוגרפיה קוהרנטית אופטית באור נראה (vis-OCTF) עם תמונות קונפוקליות ex vivo של אותה רשתית עכבר לצורך אימות המורפולוגיה של צרור האקסון של תאי גנגליון הרשתית שנצפו בתמונות in vivo .

יישור של טומוגרפיית טומוגרפיה קוהרנטית אופטית של אור נראה עם תמונות קונפוקליות של אותה רשתית עכבר

במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול סטנדרטי לכימות הרפלקס האופטוקינטי. הוא משלב גירוי תוף וירטואלי ווידאו-אוקולוגרפיה, ובכך מאפשר הערכה מדויקת של סלקטיביות התכונה של ההתנהגות והפלסטיות האדפטיבית שלה.

כימות סלקטיביות תכונות חזותיות של רפלקס האופטוקינטי בעכברים

למד הערכת מבנה ותפקוד רשתית בעכברים וחולדות באמצעות טומוגרפיה אופטית קוהרנטית ותגובה אופטוקינטית. שיטות אלו מאפשרות מחקר לולייני לא פולשני לטיפול במחלות עיניים ונוירולוגיות.

באמצעות טומוגרפיה אופטית קוהרנטית ותגובה Optokinetic כמו המפרט מבנית ופונקציונליים מערכת הראייה של עכברים וחולדות

גלה סרטונים נוספים