Name: CRISPR-Cas9 מבוססי הגנום הנדסה ליצירת מודלים Jurkat כתב להידבקות ב- HIV-1 עם אתרים שנבחרו אינטגרציה Proviral (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-14T13:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 27 s
Description: למדו הנדסת גנום מבוססת CRISPR-Cas9 ליצירת מודלים של HIV-1 בתאי Jurkat עם אינטגרציה פרוביראלית באתרים ספציפיים. שיטה זו מאפשרת חקר השפעת האינטגרציה על ביטוי גנים ומנגנוני הדבקה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים ברטה Weseloh והבל בטינה לקבלת סיוע טכני. אנו מודים גם ארן Düsedau ו- Hennesen יאנה (לזרום cytometry בפלטפורמת הטכנולוגיה, היינריך Pette אינסטיטוט) לקבלת תמיכה טכנית.

<ol><li>Hughes, S. H., Coffin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+Integration+Sites+Tell+Us+about+HIV+Persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+and+Microbe%22%5BJournal%5D)">What Integration Sites Tell Us about HIV Persistence.</a> Cell Host and Microbe. 19 (5), 588-598 (2016).</li>
<li>Marini, B., Kertesz-Farkas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+architecture+dictates+HIV-1+integration+site+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nuclear architecture dictates HIV-1 integration site selection.</a> Nature. 521 (7551), 227-231 (2015).</li>
<li>Cesana, D., Santoni de Sio, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1-mediated+insertional+activation+of+STAT5B+and+BACH2+trigger+viral+reservoir+in+T+regulatory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">HIV-1-mediated insertional activation of STAT5B and BACH2 trigger viral reservoir in T regulatory cells.</a> Nature Communications. 8 (1), 498(2017).</li>
<li>Cohn, L. B., Silva, I. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+Integration+Landscape+during+Latent+and+Active+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">HIV-1 Integration Landscape during Latent and Active Infection.</a> Cell. 160 (3), 420-432 (2015).</li>
<li>Han, Y., Lassen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resting+CD4%2B+T+cells+from+human+immunodeficiency+virus+type+1+%28HIV-1%29-infected+individuals+carry+integrated+HIV-1+genomes+within+actively+transcribed+host+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Resting CD4+ T cells from human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-infected individuals carry integrated HIV-1 genomes within actively transcribed host genes.</a> Journal of Virology. 78 (12), 6122-6133 (2004).</li>
<li>Ikeda, T., Shibata, J., Yoshimura, K., Koito, A., Matsushita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+HIV-1+integration+at+the+BACH2+locus+in+resting+CD4%2B+T+cell+populations+during+effective+highly+active+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Recurrent HIV-1 integration at the BACH2 locus in resting CD4+ T cell populations during effective highly active antiretroviral therapy.</a> The Journal of Infectious Diseases. 195 (5), 716-725 (2007).</li>
<li>Wagner, T. A., Mclaughlin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+of+cells+with+HIV+integrated+into+cancer+genes+contributes+to+persistent+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Proliferation of cells with HIV integrated into cancer genes contributes to persistent infection.</a> Science. 345 (6196), 570-573 (2014).</li>
<li>Maldarelli, F., Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+HIV+integration+sites+are+linked+to+clonal+expansion+and+persistence+of+infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Specific HIV integration sites are linked to clonal expansion and persistence of infected cells.</a> Science. 345 (6193), 179-183 (2014).</li>
<li>Jordan, A., Bisgrove, D., Verdin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+reproducibly+establishes+a+latent+infection+after+acute+infection+of+T+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">HIV reproducibly establishes a latent infection after acute infection of T cells in vitro.</a> The EMBO Journal. 22 (8), 1868-1877 (2003).</li>
<li>Mack, K. D., Jin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+insertions+within+and+proximal+to+host+cell+genes+are+a+common+finding+in+tissues+containing+high+levels+of+HIV+DNA+and+macrophage-associated+p24+antigen+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Acquired+Immune+Deficiency+Syndromes%22%5BJournal%5D)">HIV insertions within and proximal to host cell genes are a common finding in tissues containing high levels of HIV DNA and macrophage-associated p24 antigen expression.</a> Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 33 (3), 308-320 (2003).</li>
<li>Byrne, S. M., Ortiz, L., Mali, P., Aach, J., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-kilobase+homozygous+targeted+gene+replacement+in+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Multi-kilobase homozygous targeted gene replacement in human induced pluripotent stem cells.</a> Nucleic Acids Research. 43 (3), 1-12 (2014).</li>
<li>ZhangLab. CRISPR Genome Engineering Toolbox: Target Sequence Cloning Protocol. Addgene website. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/static/cms/filer_public/e6/5a/e65a9ef8-c8ac-4f88-98da-3b7d7960394c/zhang-lab-general-cloning-protocol.pdf">https://www.addgene.org/static/cms/filer_public/e6/5a/e65a9ef8-c8ac-4f88-98da-3b7d7960394c/zhang-lab-general-cloning-protocol.pdf</a> (2013).</li>
<li>Moser, F. Addgene. Gibson Assembly Protocol. Addgene website. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/protocols/gibson-assembly/">https://www.addgene.org/protocols/gibson-assembly/</a> (2009).</li>
<li>Addgene Plasmid Cloning by PCR. Addgene website. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/protocols/pcr-cloning/">https://www.addgene.org/protocols/pcr-cloning/</a> (2014).</li>
<li>Addgene Plasmid Cloning by Restriction Enzyme Digest (aka Subcloning). Addgene website. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/protocols/subcloning/ ">https://www.addgene.org/protocols/subcloning/ </a> (2013).</li>
<li>Stemmer, M., Thumberger, T., Del Sol Keyer, M., Wittbrodt, J., Mateo, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCTop%3A+An+intuitive%2C+flexible+and+reliable+CRISPR-Cas9+target+prediction+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Library+of+Science+%28PLoS%29+ONE%22%5BJournal%5D)">CCTop: An intuitive, flexible and reliable CRISPR-Cas9 target prediction tool.</a> Public Library of Science (PLoS) ONE. 10 (4), (2015).</li>
<li>Lange, U. C., Bialek, J. K., Walther, T., Hauber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pinpointing+recurrent+proviral+integration+sites+in+new+models+for+latent+HIV-1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Research%22%5BJournal%5D)">Pinpointing recurrent proviral integration sites in new models for latent HIV-1 infection.</a> Virus Research. 249, (2018).</li>
<li>Bialek, J. K., Dunay, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+HIV-1+Latency+Reversal+Using+CRISPR-Cas9-Derived+Transcriptional+Activator+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">Targeted HIV-1 Latency Reversal Using CRISPR-Cas9-Derived Transcriptional Activator Systems.</a> PloS ONE. 11 (6), e0158294(2016).</li>
<li>Lee, C. M., Davis, T. H., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+CRISPR-Cas9+design+tools+and+the+effect+of+target+site+accessibility+on+Cas9+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Physiology%22%5BJournal%5D)">Examination of CRISPR-Cas9 design tools and the effect of target site accessibility on Cas9 activity.</a> Experimental Physiology. 103 (4), 456-460 (2018).</li>
<li>Jensen, K. T., Fløe, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+accessibility+and+guide+sequence+secondary+structure+affect+CRISPR-Cas9+gene+editing+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Chromatin accessibility and guide sequence secondary structure affect CRISPR-Cas9 gene editing efficiency.</a> FEBS Letters. 591 (13), 1892-1901 (2017).</li>
<li>Simonetti, F. R., Sobolewski, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonally+expanded+CD4+%2B+T+cells+can+produce+infectious+HIV-1+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Clonally expanded CD4 + T cells can produce infectious HIV-1 in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (7), 1883-1888 (2016).</li>
<li>Chen, H. C., Martinez, J. P., Zorita, E., Meyerhans, A., Filion, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Position+effects+influence+HIV+latency+reversal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Position effects influence HIV latency reversal.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 24 (1), 47-54 (2017).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול ליצירת מודלים לכתבת HIV-1-נגזר Jurkat עם האתרים שבחרת שילוב proviral החלת בהנדסת הגנום המבוססות על CRISPR-Cas9.
מספר נקודות של הפרוטוקול דורשים תשומת לב רבה במהלך שלב התכנון. ראשית, מיקומה כדי להיות ממוקד יש לבחור בקפידה, כמו לוקוסים מסוימים ייתכן שיהיה קל יותר למטרה יותר מאחרים (למשל, בהתאם למצב כרומטין האזור לבין המטרה רצף עצמה). רצפים חוזרים הם הקשה. לשבט לתוך הווקטור מיקוד, והם לעתים קרובות לא ייחודי בתוך הגנום. מחוזות כרומטין דכאניים שקשה היעד עם<sup c...

שילוב של proviral ה-DNA הגנום המארח בעת זיהום הוא שלב קריטי במחזור החיים של וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV). בעקבות שילוב, HIV נמשכת על-ידי יצירת השהיה של קבוצות משנה תאי CD4 + T חיים ארוכים כגון זיכרון CD4 + T תאים. HIV שילוב שנראה שאינן אקראיות1,2. מספר נקודות חמות גנומית עם ה-DNA proviral משולב שהדו-שיח זוהתה במספר מחקרים באמצעות הרצף של שילוב אתרים אנשים נגועים בחריפות, באופן כרוני2,3,4 ,5,-6,-7,-8. מעניין, על שילוב אתרים מסויימים, מיקומה באותו זוהה שבר גדול של תאים נגועים, שמוביל הרעיון כי אינטגרציה באתרים חוזרים ונשנים עלול להשפיע באופן חיובי משובט הרחבה1.
כדי לקדם את ההבנה שלנו של המשמעות של שילוב חוזר ונשנה אתרים, שילוב proviral אתר הבחירה חייב להיחקר. עם זאת, מספר היבטים טכניים ה"בלתי אינטגרציה HIV לימוד באתר הבחירה ואת ההשלכות. בשימוש רחב תא תרבות מודלים של השהיה HIV, כמו שורות תאים JLat אינן משקפות את שילוב חוזר ונשנה הרלוונטית קלינית אתרי9. מחקרים על תאים נגזר החולה הראשי, מצד אחד, מאפשרים תיאור של שילוב האתר נוף על ידי רצף אך אינם מאפשרים ניתוחים פונקציונליים. ידיעתנו אין דגם ניסיוני נאותה זמין לנתח אתרים נבחרים הרלוונטית קלינית אינטגרציה פונקציונלית.
כאן אנו מציגים נתונים היסטוריים זרימת עבודה כדי ליצור מודלים חדשניים הידבקות ב- HIV באמצעות טכנולוגיית ההנדסה הגנום המבוססות על CRISPR-Cas9. זרימת העבודה המתוארת במסמך זה יכול לשמש כדי ליצור קווים תא תא T-derived כתב דגם הידבקות ב- HIV, נושא כתב proviral genomically משולב באתר שבחרת שילוב. הם משרתים וכך גם כלים חדשים לחקור איך האתר אינטגרציה proviral יכולים להשפיע ביולוגיה HIV ואת איך provirus מגיבה אסטרטגיות טיפול שונה (למשל, inducibility על ידי סוכנים היפוך השהיה). השיטה שלנו משתמשת את היתרונות של הגנום CRISPR-Cas9 מבוססי הנדסה, בשילוב אשר כתב רצף מאת רקומבינציה הומולוגית בהנחייתם של Cas9 הנוצרות על-ידי נוקלאז כפול-strand הפסקה באתר היעד. אתרי היעד עבור שילוב נבחרו על פי קרבה לאתרים שילוב חוזר ונשנה שתואר ממחקרים על אנשים נגועים ב- HIV ואת נוכחותם של מוטיבים מתאימים פאם הגנום בתיווך Cas9 הנדסה.
התוצאות המופת שלנו, אנחנו התמקדו מיקומה ג'ין BACH2, אשר הקודים המתקן תעתיק BTB ו CNC הומולוגיה 2. אצל אנשים באופן כרוני נגוע ב- HIV על טיפול תרופתי, BACH2 הוא אחד לוקוסים מציג העשרה משולב HIV-1 רצפים של3,6,7,8,10. בחרנו עיתונאי HIV-derived מינימלי של HIV-1-derived זמן מסוף חוזר (משמאל לימין), רצף קידוד tdTomato, הורמון גדילה (BGH) הסימן פוליאדנילציה (PA), אשר בוחר לשני אתרים ספציפיים באינטרון BACH2 5. פרוטוקול הציג ממוטב Jurkat תאים, אנושי CD4 + תא T-derived ההשעיה תא קו, אבל תא שני קווים עשוי לשמש, פרוטוקול הותאם בהתאם. אנו מציגים זרימת עבודה מפורט באתר היעד, בניית היעד וקטור בזרועות הומולוגיה, CRISPR Cas9-בתיווך פילוח של הכתב לתוך האתר גנומית שבחרת, הדור ואת הבחירה של קווי המשובטים, ומקיף מבחר אימות של שורות תאים הכתב החדש שנוצר, ממוקד.

<table><tbody><tr><td>pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9</td><td>Addgene</td><td>42230</td><td>וקטור לביטוי של SpCas9 ו-gRNA</td></tr><tr><td>pMK</td><td>וקטור ביטוי יונקים GeneArt</td><td></td><td></td> לשיבוט</tr><tr><td>cDNA3.1</td><td>Invitrogen</td><td>V79020</td><td>וקטור ביטוי יונקים לשיבוט</td></tr><tr><td>BbsI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0539S</td><td>אנזים הגבלה</td></tr><tr><td>NEBuilder Hifi DNA ערכת שיבוט הרכבה</td><td>New England Biolabs</td><td>E5520S</td><td>ערכת שיבוט הרכבה המשמשת ליצירת וקטור יעד</td></tr><tr><td>TaqPlus Precision PCR System</td><td>Agilent Technologies</td><td>600210</td><td>DNA פולימראז עם פעילות הגהה המשמשת להגברה של זרועות הומולוגיה (שלב 1.2.2.2), אימות אתר האינטגרציה ורצף המדווח (שלב 3.3.3 ו-3.3.5), יצירת בדיקה גנומית לכתם דרומי (שלב 3.4.1.5) וניתוח אירועים מחוץ למטרה (שלב 3.5.4)</td></tr><tr><td>צלחת תרבית רקמות 96 בארות (תחתית עגולה)</td> <td>TPP</td><td>92097</td><td>לוחות תרבית רקמות לציפוי דילול</td></tr><tr><td>פולימראז DNA בנאמנות גבוהה ניו</td><td>אינגלנד Biolabs</td><td>M0530 L</td><td>DNA פולימראז המשמש לזיהוי אירועי מיקוד (שלב 2.4.2) ויצירת בדיקה ספציפית למדווח עבור כתם דרומי (שלב 3.4.1.4)</td></tr> <tr><td>דימתיל סולפוקסיד (DMSO)</td> <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D9170</td><td>דימתיל סולפוקסיד כ-PCR תוסף</td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד (MgCl2) תמיסת</td><td>New England Biolabs</td><td>B9021S</td><td>MgCl2 כתוסף PCR</td></tr><tr><td>Deoxynucleotide (dNTP) תערובת תמיסות</td> New <td>England Biolabs</td><td>N0447S</td><td>dNTP עם 10 מ"מ מכל nt לתגובות PCR</td></tr><tr><td>5PRIME HotMasterMix</td><td>5PRIME</td><td>2200400</td><td>תערובת PCR מוכנה לשימוש המשמשת לבדיקת PCR (שלב 3.2.11)</td></tr><tr><td>ערכת מיני דם QIAamp DNA</td><td>Qiagen</td><td>51106</td><td>ערכת בידוד וטיהור DNA</td></tr><tr><td>ערכת טיהור PCR QIAquick</td> ערכת טיהור PCR <td>Qiagen</td><td>28106</td><td>ערכת טיהור PCR</td></tr><tr><td>RPMI 1640 ללא גלוטמין</td><td>Lonza</td><td>BE12-167F</td><td>מדיום תרבית תאים</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי דרום אפריקה Charge</td><td>PAN Biotech</td><td>P123002</td><td>תוסף</td></tr> <tr><td>תרבית תאים בינוניL-גלוטמין</td><td>Biochrom</td><td>K 0282</td><td>תוסף תרבית תאים בינוני</td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין 10.000 U/mL/ 10.000 ומיקרו; גרם/מ"ל</td><td>Biochrom</td><td>A 2212</td><td>תוסף מדיום תרבית תאים</td></tr><tr><td>Gibco Opti-MEM מדיית סרום מופחתת</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>31985062 מדיום תרבית תאים עם ריכוז סרום מופחת המותאם לטרנספקציה</td></tr><tr><td>TransIT-Jurkat</td><td>Mirus Bio</td><td>MIR2125</td><td>מגיב טרנספקציה</td></tr><tr><td>פורבול 12-מיריסטאט 13-אצטט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P8139-1MG</td><td>תרבית תאים מגיב</td></tr><tr><td>Ionomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0634-1MG</td><td>מגיב תרבית תאים</td></tr><tr><td>יחידת סינון מונעת מזרק, קרום PES, 0,22 ומיקרו; m</td><td>Millex</td><td>SLGP033RB</td><td>יחידת סינון לסינון סטרילי</td></tr><tr><td>חממת Heracell 150i</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51026280</td><td>חממת תרביות רקמות</td></tr><tr><td>Amershan Hybond-N +</td> <td>GE Healthcare</td><td></td><td>RPN1520B קרום ניילון טעון חיובית לכתמי DNA ו-RNA</td></tr><tr><td>Stratalinker 1800</td><td>Stratagene</td><td>400072</td><td>UV crosslinker</td></tr><tr><td>High Prime</td><td></td> ערכת <td>Roche 11585592001</td><td>לתיוג DNA עם dCTP רדיואקטיבי באמצעות אוליגונוקלאוטידים אקראיים כפריימרים</td></tr><tr><td>אילוסטרה ProbeQuant G-50 Micro Columns</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9034-08</td><td>עמודות ספין כרומטוגרפיה לטיהור DNA מסומן</td></tr></tbody></table>

crispr-cas9 מבוססי הגנום הנדסה ליצירת מודלים jurkat כתב להידבקות ב- hiv-1 עם אתרים שנבחרו אינטגרציה proviral

CRISPR-Cas9-based Genome Engineering to Generate Jurkat Reporter Models for HIV-1 Infection with Selected Proviral Integration Sites

וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV) משלב ה-DNA שלו proviral שאינה אקראית לתוך הגנום התא המארח-חוזרים ונשנים אתרים ונקודות גנומית. כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור הדור של הרומן מודלים במבחנה הידבקות ב- HIV עם אתרי אינטגרציה הגנומי שבחרת באמצעות טכנולוגיית ההנדסה הגנום המבוססות על CRISPR-Cas9. בשיטה זו, כתב רצף של הבחירה שניתן לשלב לוקוס גנומית יישוב, שבחרת, המשקף הרלוונטית קלינית שילוב אתרים.
בפרוטוקול, מתוארים העיצוב של הכתב HIV-derived ובחירה של רצף באתר, gRNA היעד. וקטור מיקוד בזרועות הומולוגיה נבנה, transfected לתוך תאי Jurkat T. הרצף כתב לאוכלוסייה אתר גנומית שנבחר על ידי רקומבינציה הומולוגית בהנחייתם של הפסקה כפולה-strand בתיווך Cas9 באתר היעד. תא בודד שיבוטים שנוצר, הוקרן הכוונת האירועים על ידי cytometry זרימה ו- PCR. שיבוטים שנבחרו ואז מורחבות, פילוח נכון מאומתת על ידי ה-PCR, רצף סופג הדרומי. ניתוח אירועים פוטנציאליים את המטרה של הגנום CRISPR Cas9-בתיווך הנדסה.
באמצעות פרוטוקול, מערכות התרבות התא הרומן הזה ניתן להפיק את הידבקות ב- HIV דגם באתרים אינטגרציה הרלוונטית קלינית. למרות הדור של תא בודד שיבוטים ואימות של שילוב רצף כתב הנכונה היא גוזלת זמן, הקווים המשובטים וכתוצאה מכך הם כלים רבי-עוצמה לנתח באופן פונקציונלי אינטגרציה proviral אתר הבחירה.

בניסוי זה נציג בחרנו להתמקד עיתונאי HIV-1-derived מינימלי המורכב LTR, tdTomato-קידוד רצף, תיקים עשויים. האות רצף מנחלת שני באינטרון 5 של ג'ין BACH217. לוקוסים עבור המיקוד נבחרו על פי קרבה לאתרי שילוב חוזר ונשנה שפורסמו שנמצאו במחקרים שונים על ראשי T תאים נגועים ב- HIV2,4,5,6, 7,<sup class="xr...

אנו מציגים הגנום הנדסה זרימת עבודה עבור הדור של הדגמים החדשים במבחנה להידבקות ב- HIV-1 זה מסכם את הדברים proviral אינטגרציה באתרים גנומית שנבחרו. פילוח של עיתונאים HIV-derived בהנחייתם של מניפולציה הגנום CRISPR Cas9-בתיווך, הספציפיות-לאתר. פרוטוקולים מפורט דור שיבוט תא בודד, הקרנה של אימות המטרה הנכונה הינם מסופקים.

CRISPR-Cas9 מבוססי הגנום הנדסה ליצירת מודלים Jurkat כתב להידבקות ב- HIV-1 עם אתרים שנבחרו אינטגרציה Proviral

Human immunodeficiency virus (HIV) integrates its proviral DNA non-randomly into the host cell genome at recurrent sites and genomic hotspots. Here we ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על השאלה כיצד אינטגרציה של נגיף האיידס משפיעה על ביטוי גנים אנדרוגיניים, ומדוע אתרי אינטגרציה גנומיים מסוימים נבחרים לאחרונה בתאים נגועים ב- HIV. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לייצר מודלים במבחנה לזיהום HIV, הנושאים כתבים פרו-ויראליים המיועדים לאתרי אינטגרציה נבחרים באמצעות הנדסת גנום מבוססת CRISPR/Cas9. הדגימו את ההליך יהיו תומאס ולטר, דוקטורנט, וג'וליה ביאלק, פוסט-דוקטורט מהמעבדה שלי.התחל על ידי שימוש בדפדפן הגנום UCSC כדי in-silico-לחלץ את הרצף הגנומי של לוקוס הגנומי הרצוי להיות ממוקד. כדי לבחור RNAs מנחים של 20 נוקלאוטידים לפילוח של הלוקוס הגנומי שנבחר, השתמש בכלי האינטרנט E-CRISP. לאחר מכן בחר, הומו ספיינס גנום הפניה קונסורציום הגנום האנושי:לבנות 38.התייחסות הגנום כמו האורגניזם קלט 2, 000 זוגות הבסיס של הרצף הגנומי, מכסה את לוקוס הגנומי הרצוי שחולץ בעבר. התחל חיפוש מדריך-RNA באמצעות הגדרות יישום בינוני עם כל PAM, כל בסיס חמישה ראשים, מחוץ ליעדים לסבול אי התאמות ולא נכללו introns ואיי CPG. מהרשימה עם עיצובים RNA מדריך אפשרי שמופיע, בחר RNA מדריך עם ציון גבוה עבור ספציפיות ויעילות, אשר קרוב ככל האפשר לוקוס הגנומי הרצוי להיות ממוקד.פתח את דפדפן NCBI Blast כדי לפוצץ את רצף המדריך-RNA שנבחר נגד גנום הייחוס. כדי לבדוק את הייחודיות של אתר איגוד ה- Guide-RNA שנבחר, בחר תחילה את האדם כגנום ולאחר מכן הזן את רצף ה- RNA של המדריך כרצף השאילתה. לאחר מכן בחר רצפים דומים מאוד או פיצוץ מגה כתוכנית כדי לוודא כי רצף RNA המדריך הוא ייחודי.לאחר מכן, בחר ב-silico 1, 000 זוגות בסיס, במעלה הזרם ובמורד הזרם של רצף Guide-RNA מהרצף הגנומי שחולץ בהתחלה. השתמש ב-1,000 זוגות בסיסים נבחרים אלה, במעלה הזרם ובמורד הזרם כזרועות הומולוגיה של חמישה ראשים ושלושה ראשים כדי להתמקד בבנייה וקטורית וברצף הכתבים הסמוך כדי להיות ממוקדים. 24 שעות לפני ההמרה של תאי T jurkat, להכין צלחת אחת שלמה 6 באר של התאים לניסוי מיקוד יחיד.כדי להתחיל, צלחת 1, 250, 000 תאים ב 2.5 מיליליטר של RPMI 1640 עם תוספי מזון וללא אנטיביוטיקה, לגם. ביום שלמחר, להוסיף מיקרוגרם של וקטור מיקוד עגול ושני מיקרוגרם של Cas9 ו plasmid ביטוי מדריך-RNA ל הבאר, כדי 250 microliters של מדיום RPMI מסחרי אופטימיזציה עבור transfection, בצינור תגובה לערבב היטב על ידי מערבולת. ואז לאט להוסיף 12 microliters של סוכן transfection למדיום ה-DNA מבלי לגעת בקיר של הצינור.מצליפים בצינור ומטגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. מוסיפים את התערובת dropwise ל באר אחת של תאים. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני.ו-72 שעות לאחר ההתמזגות, משוך את התאים המותבים, ספור אותם והתכונן להעשרה על ידי FACS. לאחר אישור אירועי המיקוד באוכלוסיית התאים הממוקדים המעורבים, התחל לייצר שיבוטים של תאים בודדים על ידי הכנת מדיום ממוזג מראש, על ידי איסוף RPMI עם אנטיביוטיקה מתאי T בריאים ולא מטופלים. צנטריפוגה הצינורות במשך 5 דקות ב 300 G, ולסנן את supernatant עם מזרק 25 מיליליטר, באמצעות מסנן מיקרומטר 0.22 לתוך חדש, 50 צינורות חרוט מיליליטר.לספור את התאים הממוקדים שהועשרו בעבר על ידי FACS, 10 עד 14 ימים לאחר ההתפשטות, ולאחר מכן לדלל אותם RPMI עם אנטיביוטיקה לריכוז של 100, 000 תאים למיליליטר. לדלל 100 microliters של דילול תא זה עם 9.9 מיליליטר של בינוני כדי להשיג 1, 000 תאים למיליליטר. ואז לדלל מיליליטר אחד של דילול זה עם תשעה מיליליטר של בינוני לריכוז של 100 תאים למיליליטר.כדי צלחת 96 צלחות גם להכיל תא אחד ל הבאר, בעדינות לערבב מיליליטר אחד של תותב 100 תאים למיליליטר עם חמישה מיליליטר של בינוני מצב וארבעה מיליליטר של בינוני טרי, במאגר בריאגנט סטרילי. לאחר מכן, השתמש פיפטה רב ערוצית כדי להוסיף 100 microliters של דילול התא המתאים ל הבאר של 96 גם צלחות תחתונות עגולות 96 היטב כדי להשיג אחד ושני תאים לדילול היטב. עורמים את 96 צלחות באר ומכסים כל ערימה עם צלחת שש בארות המכילה שלושה מיליליטר של PBS לגם.דגירה הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח עם 5% פחמן דו חמצני, במשך שלושה שבועות. לאחר הדגירה הושלמה, חזותית לאשר את נוכחותם של מושבות גדל באמצעות מיקרוסקופ אור עם הגדלה ארבע פעמים, ולסמן את בארות עם מושבות גדל. בעדינות resuspend תאים של אחד מסומן היטב על ידי צינורות.העבר 100 microliters של מתלה תא זה לתוך באר אחת של צלחת תחתונה עגולה 96 היטב מוכן טרי עם 100 microliters של RPMI עם אנטיביוטיקה, ל הבאר ולחזור על כל הבארים המסומנים, לערבב בעדינות על ידי pipetting. כדי לשכפל את הצלחת, להעביר 100 microliters של ההשעיה תא זה לתוך צלחת שנייה ריקה, 96 גם עגול התחתון ולחזור על תהליך זה עבור כל בארות מסומנות. לבסוף, למלא את בארות ריקות עם 200 microliters של RPMI עם אנטיביוטיקה.הדגירה את הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. לאחר הצלחת הכפולה יש דגירה במשך 24 עד 48 שעות לשכפל אותו שוב על ידי הוספת 100 microliters של RPMI עם אנטיביוטיקה לכל באר. השתמשו בפיפיטה רב-ערוצית כדי לערבב בעדינות ולהעביר 100 מיקרוליטרים לכל באר של צלחת חדשה עם 96 בארים.שים אחת משתי הצלחות הכפולות האלה באינקובטור. השתמש השני של הלוחות הכפולים החדשים עבור cytometry זרימה, על ידי הוספת תחילה חמישה microliters של PMA / Ionomycin מאסטר לערבב ל הבאר, כדי לעורר את התאים. דגירה במשך 24 שעות ולהכין את התאים עבור cytometry זרימה כמתואר בטקסט.שער כל תא יחיד קיימא המבוסס על גודל פיזור קדימה וצד. לנתח ביטוי גנים כתב פלואורסצנטי על ידי ציטומטריה זרימה. כדי להקרין שיבוטים חד-תאיים על-ידי PCR, עצבו פריימרים P5 ו- P6 להקרנת PCR בהתבסס על רצף הכתבים שנבחר, כדי להגביר 500 עד 800 זוגות בסיס של רצף הכתבים.לשליטה חיובית ב-PCR, תכנן פריימרים P7 ו-P8 שמגבירים 630 זוגות בסיסים של לוקוס גנומי פראי ולא ממוקד. תכנן זוג פריימר שלישי המגבר 500 עד 600 זוגות בסיסים של עמוד השדרה של מיקוד וקטור כפקד לשילוב לא ספציפי של רצפי עמוד שדרה של מיקוד וקטור. לאחר השיבוטים בצלחת הכפולה השנייה גדלו מספיק, להכין אותם הקרנת PCR על ידי צנטריפוגה הראשונה את הצלחת במשך 10 דקות ב 300-G בטמפרטורת החדר.בזהירות להוריד את supernatant, הקפדה לא להפריע את גלולת התא. לשטוף את התאים עם 100 microliters של PBS על ידי צינורות עדינים, צנטריפוגה הצלחת במשך חמש דקות ב 300 G בטמפרטורת החדר. הסר את ה- PBS והוסף 200 מיקרוליטרים של מאגר תיזה לכל באר.פיפטה בעדינות לערבב, ולהעביר את ההשעיה לצלחת PCR חדשה. לאטום את הצלחת עם סרט פרפין דגירה במשך שעה אחת ב 55 מעלות צלזיוס בתרמוצ'יקלר. לאחר צנטריפוגה למטה פסולת התא במהירות המרבית במשך 10 דקות, להעביר את supernatant לצלחת PCR חדשה.הוסף 10 microliters של תא זה lysate לכל באר של צלחת PCR 96-well מלא 110 microliters של H2O מזוקק, ל הבאר. ואז דגירה במשך 10 דקות ב 99 מעלות צלזיוס בתרמוצ'יקלר, כדי להשבית proteinase K.Use 2 microliters של תא זה ללקט כתבנית ולהשתמש בתערובת ראשית PCR מסחרית להקרנה, בקרה ו- PCR עמוד השדרה. הפעל PCR במשך 38 עד 40 מחזורים של הגברה PCR בפורמט 96 באר.השתמש חמישה microliters של מוצרי PCR ולהפעיל אותם על 1.5% agarose TAE ג'ל לנתח ולשלב את ציטומטריית זרימה ותוצאות PCR, כדי לאשר שיבוטים תא יחיד. ביטוי גנים כתב לאחר אינדוקציה PMA / Ionomycin אושרה על ידי שני ציטומטריה זרימה PCR בארבעה עד 12% של תאים, בהתאם לאתר האינטגרציה. ניתוח PCR של דנ"א גנומי באמצעות פריימרים לצומת אינטגרציה של חמישה ראשים ושלושה ראשים, מאשרים כי אירועי מיקוד התרחשו.לאחר ההקרנה של שיבוטים תא יחיד עבור מיקוד נכון על ידי cytometry זרימה, שיבוטים עם גבוה, נמוך ולא ביטוי גנים כתב פלואורסצנטי נצפו. שיבוטים תא יחיד אושרו גם על ידי PCR באמצעות פריימרים ספציפיים לכתב פריימרים שליטה. שיבוטים אישרו חיובי בהקרנת PCR הוצאו ונותחו עוד יותר עבור מיקוד נכון על ידי כתם דרומי, באמצעות בדיקה ספציפית לכתב ו מחייב בדיקה גנומי מחוץ לכתב.רק חלק הראו גדלי הלהקה הנכונים בניתוח הכתמים הדרומיים ושלבו את הכתב בצורה הטרוזית, מה שמראה שחשוב לאמת את תוצאות PCR על ידי כתם דרומי. שיבוטים נותחו גם על ידי רצף כדי לאשר עוד יותר שיבוטים חד-תאיים חיוביים. רצף של אתר היעד: אלל הומולוגי, אם הכתב לא השתלב, חשף מוטציות הנגרמות על ידי Cas9.לאחר השליטה, הדור של איידס כתב שורות ניתן להשיג בחודשיים עד שלושה חודשים. לפני הפילוח, חשוב להשקיע מספיק זמן בבחירת אתר אינטגרציה אצל כתב מתאים, בהתאם לשאלת המחקר שאתה רוצה להתמודד איתה. כתבים יכולים למשל, לכלול אלמנטים רגולטוריים שונים HIV אם תרצה.בעקבות הליך זה, קווי תאים יכולים לשמש לדוגמה כדי לבדוק את ההשפעה של סוכנים עולים השהיה שונים על פעילות שעתוק של הכתב LTR, בהתאם לאתר האינטגרציה שלה. לאחר צפייה בסרטון זה אתה צריך הבנה טובה של איך ליצור אינטגרציה-אתר ספציפי HIV כתב קווים לעיצוב מדריך RNAs ומיקוד וקטור, ביצוע הנדסת גנום מבוסס CRISPR /Cas9 בתאי jurkat, הפקת שיבוטים תא יחיד ובחירה שיבוטים ממוקדים כראוי על ידי FACS ו PCR הקרנה. אל תשכח, שאם תבחר לעבוד עם כתב HIV מוסמך שכפול, אתה צריך לעבוד תחת תנאי בטיחות BSL3.

crispr-cas9-based-genome-engineering-to-generate-jurkat-reporter

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

נוכחי HIV-1 אסטרטגיות לפעול כדי לדכא את מחזור החיים של נגיפי אבל לא יעיל למיגור זיהום. כאן, אנו מראים כי recombinase מהונדסים יכולים הבלו ביעילות משולב DNA HIV-1 proviral מן הגנום של תאים נגועים.

ראיון: HIV-1-DNA כריתה Proviral שימוש recombinase התפתח

כלי עריכת גנום כגון מערכת CRISPR (Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated) שיפרו מאוד את יעילות מיקוד הגנים בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים (hiPSCs). כתב יד זה מתאר פרוטוקול ליצירת מדווח hiPSC ספציפי לשושלת באמצעות רקומבינציה הומולוגית בסיוע מערכת CRISPR/Cas.

דור יעיל של כתבים במכות ספציפיים Lineage hiPSC עצבי באמצעות CRISPR / Cas9 ומערכת Nickase זוגי Cas9

מערכת CRISPR / Cas9 מציעה את הפוטנציאל להפוך הגנום ממוקד עריכה נגישה ובמחיר סביר לקהילה המדעית. פרוטוקול זה נועד להדגים כיצד ליצור וירוסים אשר מפסיד יוצאים גן של עניין באמצעות מערכת CRISPR / Cas9, ואז מזריקים אותם stereotaxically לתוך מוח העכבר הבוגר.

תכנון, אריזה, משלוח של רטרו CRISPR כייל גבוה ו Lentiviruses באמצעות Stereotaxic הזרקת

אנו מתארים פרוטוקול להגברת אתרי אינטגרציה רטרו-ויראלית מה-DNA הגנומי של תאים נגועים, ריצוף הצמתים המוגברים של הווירוס-מארח ולאחר מכן מיפוי רצפים אלה לגנום ייחוס. אנו מתארים גם טכניקות לכימות התפלגות אתרי האינטגרציה ביחס להערות גנומיות שונות באמצעות BEDTools.

הגברה, רצף הדור הבא, ואת הגנום מיפוי ה- DNA של אתרי אינטגרצית retroviral

באופן קבוע באשכולות interspaced חלבון קצר palindromic חזרה/CRISPR הקשורים 9 (CRISPR/Cas9) מערכת מספקת כלי מבטיח עבור הנדסה גנטית, ופותחת לו את האפשרות של שילוב יישוב של transgenes. אנו מתארים קצה בתיווך הומולוגיה להצטרף (HMEJ)-המבוססת על אסטרטגיה עבור DNA יעיל ממוקד אינטגרציה ויוו , ממוקד ג'ין טיפולים באמצעות CRISPR/Cas9.

CRISPR/Cas9-מתווכת אינטגרציה יישוב In Vivo באמצעות אסטרטגיה מבוסס על הצטרפות סוף בתיווך הומולוגיה

אנו מתארים את האסטרטגיה הייצור של וקטורים lentiviral חשוכת-integrase (IDLVs) בתור כלי רכב להעברת CRISPR/Cas9 לתאים. עם היכולת לתווך ג'ין מהיר וחזק עריכה בתאים, IDLVs להציג דרך בטוחה יותר, פלטפורמה וקטור יעיל באותה מידה המסירה הגן לעומת integrase-המוסמכת וקטורים.

פרוטוקול עבור הייצור של וקטורים Lentiviral חשוכת-Integrase עבור CRISPR/Cas9-מתווכת נוקאאוט גנטי חלוקת תאים

אנו מתארים וזמינותו מבוססת תא לדווח על HIV-1 היתוך באמצעות הביטוי של חלבון פלואורסצנטי ירוק לזיהוי על ידי מיקרוסקופ לזרום cytometry או קרינה פלואורסצנטית. זה יכול לשמש כדי לבדוק את מעכבי נגיפי כניסה (במיוחד בשלב fusion) במערכות זיהום תא ולתא.

Cre-עצלן תפוקה גבוהה מופעל ממברנה ויראלי Assay פיוז'ן לזהות מעכבי של היתוך ממברנה נגיפי HIV-1

לפלח epigenome DNA עריכה מייצג גישה טיפולית רב-עוצמה. פרוטוקול זה מתאר את הייצור, טיהור, הריכוז של ה-all-in-one וקטורים lentiviral מסתירים את transgene CRISPR-dCas9-DNMT3A עבור יישומים לעריכת epigenome בתא גזע pluripotent המושרה אנושי (hiPSC)-נגזר נוירונים.

וקטור lentiviral פלטפורמה למסירה יעיל של כלי עריכת Epigenome לתוך האדם המושרה מודלים המחלה נגזר תאי גזע Pluripotent

תיאר הם פרוטוקולים עבור עריכת הגנום יעיל מאוד של גזע המטפאות מורקיים ומחולל קדמון (HSPC) על ידי מערכת CRISPR/Cas9 כדי לפתח במהירות מערכות מודל העכבר עם המטפאות ספציפיים שינויים גנים.

לנטינגיו CRISPR/Cas9 בתיווך הגנום עריכה לחקר התאים המטפאות במודלים למחלות

כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט, צעד אחר צעד להנדסת גנום מבוסס CRISPR / Cas9 של תאי B אנושיים ראשוניים לנוקאאוט גנים (KO) ו knock-in (KI) כדי לחקור פונקציות ביולוגיות של גנים בתאי B ופיתוח של טיפולי B-cell.

הנדסת גנום של תאי B אנושיים ראשוניים באמצעות CRISPR/Cas9

אנו מציגים פרוטוקול להתמרה רטרו-ויראלית של RNA מנחה לתאי T ראשוניים מעכברים טרנסגניים Cas9, המספקים חלופה יעילה לעריכת גנים בחקר התמיינות Th17.

מיקוד גנים רטרו-ויראלי בתיווך CRISPR/Cas9 לחקר התמיינות Th17 במבחנה

למדו הנדסת גנום מבוססת CRISPR-Cas9 ליצירת מודלים של HIV-1 בתאי Jurkat עם אינטגרציה פרוביראלית באתרים ספציפיים. שיטה זו מאפשרת חקר השפעת האינטגרציה על ביטוי גנים ומנגנוני הדבקה.

CRISPR-Cas9 מבוססי הגנום הנדסה ליצירת מודלים Jurkat כתב להידבקות ב- HIV-1 עם אתרים שנבחרו אינטגרציה Proviral

גלה סרטונים נוספים