הקרנת כותנה גנוטיפים לעמידות בפני ההתנגדות של רנפורם
2 במאי 2019
כאן, פרוטוקול מוצג עבור הקרנה מהירה הלא הרסנית של גנוטיפים כותנה עבור התנגדות נמטודות. הפרוטוקול כולל בדיקה חזותית את השורשים של שתילי כותנה נגועים nematode כדי לקבוע תגובה זיהום. לירות וגטטיבי מכל צמח מופץ אז לשחזר צמחים לייצור זרעים.
שיטה זו יכולה לעזור בפיתוח של זני כותנה עמידים לנמטודה reniform. באמצעות זיהוי גנוטיפים עמידים ממין כותנה אחר והערכת אוכלוסיות רבייה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת שיטה פשוטה ולא הרסנית להקרנה מחדש של נמטודה.
התחל על ידי הצבת כדור כותנה בחלק התחתון של קוטר אחד ארבעה סנטימטר, 21 סיר פלסטיק חרוט גובה מרכזי לכל זרע. וממלאים את הסירים בתערובת אדמה מפוסטרת בקיטור לכ-2 ס"מ מהחלק העליון של הסיר. מניחים יתד פלסטיק לתוך כל סיר מייעד את הגנוטיפ להיות נטועים ולשתול זרע אחד של גנוטיפ כותנה המתאים לתוך כל סיר.
ממלאים כל סיר באדמה נוספת כדי לכסות את הזרעים וממקמים את הסירים בתא צמיחה שנקבע לטמפרטורה קבועה של 28 מעלות צלזיוס עם תקופת צילום פלואורסצנטית ויבון של 16 שעות. לאחר מכן מניחים פולטי מים לתוך כל סיר ולהשתמש במערכת השקיה אוטומטית להשקות את הסירים פעמיים ביום. שבעה ימים לאחר השתלה, ליצור דיכאון קטן באדמה ליד כל צמח ולהוסיף מיליליטר אחד של השעיה nematode reniform לכל דיכאון.
לאחר החיסון, יש לשלוט היטב במים בסיר על מנת למנוע שטיפת נמטודות באזור השורש. 28 ימים לאחר החיסון, להשתמש במספריים כדי להסיר את רוב העלים המורחבים לחלוטין מן הצמחים לפני לסחוט כל סיר מחליק את האדמה החוצה לתוך יד אחת כדי להסיר את הצמחים. בעדינות להתסיס את מערכת השורש במי ברז במיכל 10 ליטר כדי להסיר את הקרקע מן השורשים, ואחריו שטיפה קצרה במיכל של מי ברז נקיים.
השתמש במספריים כדי להסיר את מערכת השורש ניקה מן הצמח כ סנטימטר אחד מתחת לקו הקרקע. מניחים את השורשים לתוך מיכל פלסטיק 120 מיליליטר חד פעמי לא סטרילי. לאחר מכן, לכסות לחלוטין את מערכת השורש עם כ 30 מיליליטר של פתרון צבעי מזון אדום ומניחים את מיכל הדגימה במיקרוגל לחימום של פתרון הכתמים עד שהוא מתחיל לרתיחה.
כאשר המדגם התקרר לטמפרטורת החדר, החלף את פתרון צבעי המזון האדומים ב-100 מיליליטר של מי ברז כדי להסיר כתמים עודפים. לאחר מכן מניחים את הכיסוי על מיכל הדגימה ומאחסנים את המדגם בארבע מעלות צלזיוס עד לניתוח זיהום שורש. כדי לשחזר את הצמחים לייצור זרעים, מניחים כדור כותנה בתחתית סיר פלסטיק חרוטי חדש וממלאים חלקית את הסיר במדיום שתיית טחב כבול.
מניחים מערכת שורש אחת שנקטפה לירות צמחי בסיר ולהוסיף בחוזקה בינוני השתירה כדי למלא את הסיר. מניחים יתד פלסטיק חדש שכותרתו לתוך כל סיר כדי לייעד את גנוטיפ כותנה ולהמקם את מגש הסירים לתוך מיכל פלסטיק של מים. בקצרה להשקות את הצמחים כדי להנחות את מדיום בעציצים ולמקם את הסירים בתא צמיחה להגדיר טמפרטורה קבועה של 28 מעלות צלזיוס ותהוכת צילום 16 שעות.
לאחר כ-30 יום, ממלאים חלקית סיר פלסטיק אחד באורך שישה ליטרים לצמח בעציצים בינוניים. מעבירים כל צמח לסיר של שישה ליטרים, ומוסיפים בחוזקה מדיום לשתייה לכל סיר כאשר כל שתיל נטוע. לאחר מכן מניחים את הצמחים בבית זכוכית ומוסיפים מים כדי להרים את מדיום השתולות.
כדי להעריך את זיהום השורש R.reniformis, הסר דגימת בסיס ממיכל הדגימה. השתמש במיקרוסקופ סטריאו כדי לספור את מספר nematodes הנשי מחובר למערכת השורש תחת הגדלה 20X. זיהום מוצלח במערכת שורש נמטודה יכול להיות מושפע ממספר גורמים, כולל הכדאיות של הנמטודה המשמשת לחיסון וריאציה עונתית, כמו nematodes פעילים פחות בחודשי החורף.
לאחר מכן מניחים את מערכת השורש על מגבות נייר במשך כ 10 דקות כדי להסיר את הלחות העודפת. לשקול את מערכת השורש כדי לקבוע את משקל השורש הטרי. וריאציות בצמיחת השורש נפוצות בין כריתות.
וריאציות אלה, כפי שנמדד על ידי משקל שורש טרי, ניתן לראות גם בין צמחים מאותו גנוטיפ. יחסית פחות נקבות reniform nematodes מסוגלים להקים אתר האכלה עבור גנוטיפ כותנה עמיד לעומת גנוטיפ רגישים. ניתן להשתמש בנתונים הטריים של משקל השורש כדי לחשב את מספר nematodes reniform הנשי לגרם של רקמת השורש עבור כל גנוטיפ.
מספר nematodes reniform הנשי לגרם של שורש עבור גנוטיפים עמידים הוא בדרך כלל פחות מ 10, ואילו genotypes רגישים בדרך כלל יש יותר מ 30 nematodes לגרם של שורש. כאן מוצגת קבוצת משנה של נתונים מאוכלוסיית F2 מפרידה שכללה 300 צמחים. טווחים אלה וריאציה לצמיחת שורש וזיהום nematode של מערכות השורש נצפו בדרך כלל עבור הערכות nematode, הממחיש את היכולת של הליך זה לשמש כדי לסנן מספר רב של צמחים בניסוי אחד, כדי למזער וריאציה זו, כדי להקל על הערכה מדויקת של הגנטיקה של ההתנגדות.
בעקבות הליך זה, ניתן לקבוע את הגנטיקה של עמידות לנמטוד reniform כדי לזהות את סמני ה- DNA הקשורים להתנגדות. סמנים אלה יכולים לשמש לאחר מכן לרבייה בסיוע סמן ולהעברת עמידות נמטודה כותנה במעלה הארץ. לאחר התפתחותה, טכניקה זו סיפקה שיטה לא הרסנית המאפשרת לחוקרים לשחזר צמחים לאחר סינון מחדש של נמטודה כדי לסייע ברביית זני כותנה עמידים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול מהיר ולא פולשני לסריקת גנוטיפים של כותנה (Gossypium hirsutum) כדי לבדוק עמידות לנמטודה הרניפורמית (Rotylenchulus reniformis). השיטה מאפשרת הערכה יעילה של אוכלוסיות רבייה גדולות באמצעות הערכה חזותית של זיהום נמטודות בשורשים, ומאפשרת את התאוששות הצמחים והמשך רבייה לאחר הסריקה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- פתולוגיה של צמחים
- נמטולוגיה
- רבייה של צמחים
רקע
- נמטודת הכליה (Reniform nematode) היא מזיק משמעותי המשפיע על ייצור הכותנה.
- שיטות סינון מסורתיות לעמידות לנמטודות הן גוזלות זמן והרסניות.
- קיים צורך בפרוטוקולי סינון מהירים, ניתנים להרחבה ולא הרסניים כדי לתמוך בטיפוח לעמידות.
- הערכה ויזואלית של זיהום נמטודות בשורשים מציעה חלופה פוטנציאלית.
מטרת המחקר
- פיתוח ותיאור של פרוטוקול מהיר ולא הרסני לסריקת גנוטיפים של כותנה לעמידות לנמטודות רניפורמיות (reniform nematodes).
- מתן אפשרות להערכה של מספר רב של צמחים בתוכניות רבייה.
- סיוע בהשבה של צמחים שנסרקו לצורך המשך רבייה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- זרעי כותנה נשתלים באדמה שעברה פסטוריזציה בקיטור בעציצים קוניים ומגודלים בתנאים מבוקרים.
- שבעה ימים לאחר השתילה, השתילים מוחדרים בסוספנזיה של נמטודות בצורת כליה (reniform nematodes).
- עשרים ושמונה ימים לאחר ההחדרה, השורשים נאספים, נצבעים בצבע מאכל אדום ונבדקים להדבקה בנמטודות.
- מספר הנמטודות הנקביות הנצמדות לשורשים נספר תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי ומנורמל לגרם של משקל שורש טרי.
- נבטים צמחיים נשתלים מחדש כדי לאפשר התאוששות של הצמח לצורך רבייה עתידית.
תוצאות עיקריות
- הפרוטוקול מאפשר סריקה מהירה ויעילה של אוכלוסיות גדולות (למשל, מעל 300 פרטים).
- גנוטיפים עמידים מאופיינים בדרך כלל בפחות מ-10 נמטודות נקביות לגרם שורש, בעוד שגנוטיפים רגישים מאופיינים ביותר מ-30.
- נצפית שונות בהדבקה ובצמיחת השורשים בין גנוטיפים ובתוכם, מה שמחייב שימוש בגנוטיפי ביקורת.
- מעל 95% מהנבטים הצמחיים מפתחים בהצלחה מערכות שורשים חדשות לאחר השתלה מחדש.
מסקנות
- פרוטוקול זה מספק שיטה פשוטה, מהירה ולא הורסת לסריקת כותנה לצורך זיהוי עמידות לנמטודות רניפורמיות (reniform nematodes).
- השיטה מאפשרת השבה של צמחים לצורך השבחה נוספת, ובכך תומכת בתוכניות להבאת עמידות בגידול.
- השיטה יעילה לזיהוי גנוטיפים עמידים ולהערכת הגנטיקה של העמידות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
סריקה יעילה של גנוטיפים של כותנה לעמידות לנמטודות רניפורמיות (reniform nematode) היא קריטית להאצת טיפוח העמידות ולצמצום הפסדי היבולים. פרוטוקול מהיר ולא הרסני זה מאפשר הערכה בתפוקה גבוהה ותומך בזיהוי קווים עמידים לשילוב בתהליכי טיפוח. גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי בבחירת הגנוטיפים ומייעלת את קבלת ההחלטות בנוגע לקידום פורט폴יו בביוטכנולוגיה חקלאית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה ישירה של אינטראקציות בין מאחס לפתוגן להבהרת מנגנוני עמידות.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של תכונות עמידות בגנוטיפים מגוונים של כותנה.
- מסייע בביטחון חיזוי בבחירת מועמדים לטיפוח עמידות.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מספק בדיקה כמותית סטנדרטית לזיהום בנמטודות באוכלוסיות גדולות.
- מספק תוצאות הדירות על ידי נרמול של ספירת הנמטודות למשקל השורש.
- מאפשר תהליכי סריקה הניתנים להרחבה המתאימים לתוכניות טיפוח ולהערכת קרמי הגנטיים (germplasm).
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה בין סריקה פנוטיפית לבין אסטרטגיות של ברירה מסייעת באמצעות סמנים (marker-assisted selection) בשלבים מאוחרים יותר.
- תומך ברציפות, החל מזיהוי מוקדם של עמידות ועד למיפוי גנטי והחדרת תכונות (introgression).
- מפחית את הסיכון הביולוגי על ידי מתן אפשרות להערכה חסונה של הורשת עמידות באוכלוסיות מסגרגות.
שילוב בקו התהליך ובזרימת העבודה
פרוטוקול זה ממוקם בנקודת המפגש בין שלבי הגילוי המוקדמים, סריקה פנוטיפית וקדם-רבייה, ובכך הוא מהווה גשר לברירה באמצעות סמנים ולפריסה של תכונות.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבחינת השערות לגבי מנגנוני עמידות וביצועי גנוטיפים.
- סקר (Screening): מספק נתוני הדבקה כמותיים הניתנים לשחזור לצורך השוואה מהימנה בין גנוטיפים.
- אנליטיקה: מאפשר ניתוח סטטיסטי של שיעורי הדבקה וספי עמידות באוכלוסיות שונות.
- מחקר תרגומי: מקל על מיפוי גנטי ותיקוף סמנים לתכונות עמידות.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פרוטוקול ניתן לשימוש חוזר וניתן להרחבה, שניתן להתאימו למטרות רבייה מגוונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בבחירת תכונות עמידות ומפחית עמימות מכניסטית.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של הסינון, משפר את השחזוריות ותומך ביכולת הרחבה לסריקה בעלת תפוקה גבוהה.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת לגבי המשך או הפסקת התהליך (go/no-go) ומבצע אופטימיזציה של הקצאת משאבים בקווי רבייה.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים ובקידום של גנוטיפים עמידים.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בנמטולוגיה, פתולוגיה של צמחים ופנוטיפיקה כמותית.
- נדרשות סביבת גידול מבוקרת ותשתית מיקרוסקופיה להערכת הזיהום.
- נדרשת סטנדרטיזציה בין-צוותית לצורך נרמול נתונים ומעקב אחר גנוטיפים.
- ניתן להתאימה למגוון של גרמפלזם של כותנה ולאוכלוסיות רבייה.
- שונות בשיעורי הזיהום מחייבת הכללה של גנוטיפי ביקורת לצורך ניתוח איתן.
שאלות נפוצות בתחום הביופארמה
Chapters in this video
0:04
Title
0:24
Cotton Genotype Planting for R. reniformis Resistance Evaluation and Nematode Inoculation
1:42
Root Sample Preparation
2:53
Vegetative Propagation for Recovered Plant Seed Production and R. reniformis Root Infection Evaluation
4:36
Results: Representative Variations in Reniform Nematode Infection Responses
5:54
Conclusion
