הקרנת כותנה גנוטיפים לעמידות בפני ההתנגדות של רנפורם

כאן, פרוטוקול מוצג עבור הקרנה מהירה הלא הרסנית של גנוטיפים כותנה עבור התנגדות נמטודות. הפרוטוקול כולל בדיקה חזותית את השורשים של שתילי כותנה נגועים nematode כדי לקבוע תגובה זיהום. לירות וגטטיבי מכל צמח מופץ אז לשחזר צמחים לייצור זרעים.

שיטה זו יכולה לעזור בפיתוח של זני כותנה עמידים לנמטודה reniform. באמצעות זיהוי גנוטיפים עמידים ממין כותנה אחר והערכת אוכלוסיות רבייה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת שיטה פשוטה ולא הרסנית להקרנה מחדש של נמטודה.

התחל על ידי הצבת כדור כותנה בחלק התחתון של קוטר אחד ארבעה סנטימטר, 21 סיר פלסטיק חרוט גובה מרכזי לכל זרע. וממלאים את הסירים בתערובת אדמה מפוסטרת בקיטור לכ-2 ס"מ מהחלק העליון של הסיר. מניחים יתד פלסטיק לתוך כל סיר מייעד את הגנוטיפ להיות נטועים ולשתול זרע אחד של גנוטיפ כותנה המתאים לתוך כל סיר.

ממלאים כל סיר באדמה נוספת כדי לכסות את הזרעים וממקמים את הסירים בתא צמיחה שנקבע לטמפרטורה קבועה של 28 מעלות צלזיוס עם תקופת צילום פלואורסצנטית ויבון של 16 שעות. לאחר מכן מניחים פולטי מים לתוך כל סיר ולהשתמש במערכת השקיה אוטומטית להשקות את הסירים פעמיים ביום. שבעה ימים לאחר השתלה, ליצור דיכאון קטן באדמה ליד כל צמח ולהוסיף מיליליטר אחד של השעיה nematode reniform לכל דיכאון.

לאחר החיסון, יש לשלוט היטב במים בסיר על מנת למנוע שטיפת נמטודות באזור השורש. 28 ימים לאחר החיסון, להשתמש במספריים כדי להסיר את רוב העלים המורחבים לחלוטין מן הצמחים לפני לסחוט כל סיר מחליק את האדמה החוצה לתוך יד אחת כדי להסיר את הצמחים. בעדינות להתסיס את מערכת השורש במי ברז במיכל 10 ליטר כדי להסיר את הקרקע מן השורשים, ואחריו שטיפה קצרה במיכל של מי ברז נקיים.

השתמש במספריים כדי להסיר את מערכת השורש ניקה מן הצמח כ סנטימטר אחד מתחת לקו הקרקע. מניחים את השורשים לתוך מיכל פלסטיק 120 מיליליטר חד פעמי לא סטרילי. לאחר מכן, לכסות לחלוטין את מערכת השורש עם כ 30 מיליליטר של פתרון צבעי מזון אדום ומניחים את מיכל הדגימה במיקרוגל לחימום של פתרון הכתמים עד שהוא מתחיל לרתיחה.

כאשר המדגם התקרר לטמפרטורת החדר, החלף את פתרון צבעי המזון האדומים ב-100 מיליליטר של מי ברז כדי להסיר כתמים עודפים. לאחר מכן מניחים את הכיסוי על מיכל הדגימה ומאחסנים את המדגם בארבע מעלות צלזיוס עד לניתוח זיהום שורש. כדי לשחזר את הצמחים לייצור זרעים, מניחים כדור כותנה בתחתית סיר פלסטיק חרוטי חדש וממלאים חלקית את הסיר במדיום שתיית טחב כבול.

מניחים מערכת שורש אחת שנקטפה לירות צמחי בסיר ולהוסיף בחוזקה בינוני השתירה כדי למלא את הסיר. מניחים יתד פלסטיק חדש שכותרתו לתוך כל סיר כדי לייעד את גנוטיפ כותנה ולהמקם את מגש הסירים לתוך מיכל פלסטיק של מים. בקצרה להשקות את הצמחים כדי להנחות את מדיום בעציצים ולמקם את הסירים בתא צמיחה להגדיר טמפרטורה קבועה של 28 מעלות צלזיוס ותהוכת צילום 16 שעות.

לאחר כ-30 יום, ממלאים חלקית סיר פלסטיק אחד באורך שישה ליטרים לצמח בעציצים בינוניים. מעבירים כל צמח לסיר של שישה ליטרים, ומוסיפים בחוזקה מדיום לשתייה לכל סיר כאשר כל שתיל נטוע. לאחר מכן מניחים את הצמחים בבית זכוכית ומוסיפים מים כדי להרים את מדיום השתולות.

כדי להעריך את זיהום השורש R.reniformis, הסר דגימת בסיס ממיכל הדגימה. השתמש במיקרוסקופ סטריאו כדי לספור את מספר nematodes הנשי מחובר למערכת השורש תחת הגדלה 20X. זיהום מוצלח במערכת שורש נמטודה יכול להיות מושפע ממספר גורמים, כולל הכדאיות של הנמטודה המשמשת לחיסון וריאציה עונתית, כמו nematodes פעילים פחות בחודשי החורף.

לאחר מכן מניחים את מערכת השורש על מגבות נייר במשך כ 10 דקות כדי להסיר את הלחות העודפת. לשקול את מערכת השורש כדי לקבוע את משקל השורש הטרי. וריאציות בצמיחת השורש נפוצות בין כריתות.

וריאציות אלה, כפי שנמדד על ידי משקל שורש טרי, ניתן לראות גם בין צמחים מאותו גנוטיפ. יחסית פחות נקבות reniform nematodes מסוגלים להקים אתר האכלה עבור גנוטיפ כותנה עמיד לעומת גנוטיפ רגישים. ניתן להשתמש בנתונים הטריים של משקל השורש כדי לחשב את מספר nematodes reniform הנשי לגרם של רקמת השורש עבור כל גנוטיפ.

מספר nematodes reniform הנשי לגרם של שורש עבור גנוטיפים עמידים הוא בדרך כלל פחות מ 10, ואילו genotypes רגישים בדרך כלל יש יותר מ 30 nematodes לגרם של שורש. כאן מוצגת קבוצת משנה של נתונים מאוכלוסיית F2 מפרידה שכללה 300 צמחים. טווחים אלה וריאציה לצמיחת שורש וזיהום nematode של מערכות השורש נצפו בדרך כלל עבור הערכות nematode, הממחיש את היכולת של הליך זה לשמש כדי לסנן מספר רב של צמחים בניסוי אחד, כדי למזער וריאציה זו, כדי להקל על הערכה מדויקת של הגנטיקה של ההתנגדות.

בעקבות הליך זה, ניתן לקבוע את הגנטיקה של עמידות לנמטוד reniform כדי לזהות את סמני ה- DNA הקשורים להתנגדות. סמנים אלה יכולים לשמש לאחר מכן לרבייה בסיוע סמן ולהעברת עמידות נמטודה כותנה במעלה הארץ. לאחר התפתחותה, טכניקה זו סיפקה שיטה לא הרסנית המאפשרת לחוקרים לשחזר צמחים לאחר סינון מחדש של נמטודה כדי לסייע ברביית זני כותנה עמידים.