Name: לכידת וזיהוי של RNA-מחייב חלבונים באמצעות לחץ בסיוע כימיה RNA-interactome ללכוד אסטרטגיה (CARIC) (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: למדו את שיטת CARIC ללכידת חלבונים המחייבים RNA בקידוד ובלא-קידוד באמצעות כימיה לחיצה. השיטה מסייעת לחקר אינטראקציות RNA-חלבון בתאי HeLa ובהבנת רגולציה לאחר שעתוק.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי נבחרת מדעי הטבע קרן של סין מענקים 91753206, 21425204, ועל 21521003 ועל ידי 2016YFA0501500 פרוייקט פיתוח ומחקר מפתח הלאומית.

<ol><li>Djebali, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Landscape+of+transcription+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Landscape of transcription in human cells.</a> Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).</li>
<li>Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+census+of+human+RNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">A census of human RNA-binding proteins.</a> Nature Reviews Genetics. 15 (12), 829-845 (2014).</li>
<li>Castello, A., Fischer, B., Hentze, M. W., Preiss, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-binding+proteins+in+Mendelian+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">RNA-binding proteins in Mendelian disease.</a> Trends in Genetics. 29 (5), 318-327 (2013).</li>
<li>Nussbacher, J. K., Batra, R., Lagier-Tourenne, C., Yeo, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-binding+proteins+in+neurodegeneration%3A+Seq+and+you+shall+receive%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">RNA-binding proteins in neurodegeneration: Seq and you shall receive.</a> Trends in Neuroscience. 38 (4), 226-236 (2015).</li>
<li>Jazurek, M., Ciesiolka, A., Starega-Roslan, J., Bilinska, K., Krzyzosiak, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+proteins+that+bind+to+specific+RNAs+-+focus+on+simple+repeat+expansion+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Identifying proteins that bind to specific RNAs - focus on simple repeat expansion diseases.</a> Nucleic Acids Research. 44 (19), 9050-9070 (2016).</li>
<li>Hentze, M. W., Castello, A., Schwarzl, T., Preiss, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brave+new+world+of+RNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A brave new world of RNA-binding proteins.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (5), 327-341 (2018).</li>
<li>Castello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+RNA+biology+from+an+atlas+of+mammalian+mRNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins.</a> Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).</li>
<li>Baltz, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mRNA-bound+proteome+and+its+global+occupancy+profile+on+protein-coding+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts.</a> Molecular Cell. 46 (5), 674-690 (2012).</li>
<li>Beckmann, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA-binding+proteomes+from+yeast+to+man+harbour+conserved+enigmRBPs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The RNA-binding proteomes from yeast to man harbour conserved enigmRBPs.</a> Nature Communications. 6, 10127-10135 (2015).</li>
<li>Conrad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+interactome+capture+of+the+human+cell+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Serial interactome capture of the human cell nucleus.</a> Nature Communications. 7, 11212-11222 (2016).</li>
<li>Castello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+identification+of+RNA-binding+domains+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive identification of RNA-binding domains in human cells.</a> Molecular Cell. 63 (4), 696-710 (2016).</li>
<li>Kwon, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA-binding+protein+repertoire+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The RNA-binding protein repertoire of embryonic stem cells.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 20 (9), 1122-1130 (2013).</li>
<li>Liepelt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+RNA-binding+proteins+in+macrophages+by+interactome+capture%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Identification of RNA-binding proteins in macrophages by interactome capture.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 15 (8), 2699-2714 (2016).</li>
<li>Liao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cardiomyocyte+RNA-binding+proteome%3A+Links+to+intermediary+metabolism+and+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The cardiomyocyte RNA-binding proteome: Links to intermediary metabolism and heart disease.</a> Cell Reports. 16 (5), 1456-1469 (2016).</li>
<li>Mitchell, S. F., Jain, S., She, M. P., Parker, R. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/nsmb/journal/v20/n1/abs/nsmb.2468.html">Global analysis of yeast mRNPs.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 20 (1), 127-133 (2013).</li>
<li>Matia-González, A. M., Laing, E. E., Gerber, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+mRNA-binding+proteomes+in+eukaryotic+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Conserved mRNA-binding proteomes in eukaryotic organisms.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 22 (12), 1027-1033 (2015).</li>
<li>Despic, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+RNA-protein+interactions+underlie+the+zebrafish+maternal-to-zygotic+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Dynamic RNA-protein interactions underlie the zebrafish maternal-to-zygotic transition.</a> Genome Research. 27 (7), 1184-1194 (2017).</li>
<li>Wessels, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mRNA-bound+proteome+of+the+early+fly+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">The mRNA-bound proteome of the early fly embryo.</a> Genome Research. 26 (7), 1000-1009 (2016).</li>
<li>Sysoev, V. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+changes+of+the+RNA-bound+proteome+during+the+maternal-to-zygotic+transition+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Global changes of the RNA-bound proteome during the maternal-to-zygotic transition in Drosophila.</a> Nature Communications. 7, 12128(2016).</li>
<li>Reichel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+planta+determination+of+the+mRNA-binding+proteome+of+Arabidopsis+etiolated+seedlings%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">In planta determination of the mRNA-binding proteome of Arabidopsis etiolated seedlings.</a> Plant Cell. 28 (10), 2435-2452 (2016).</li>
<li>Marondedze, C., Thomas, L., Serrano, N. L., Lilley, K. S., Gehring, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA-binding+protein+repertoire+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The RNA-binding protein repertoire of Arabidopsis thaliana.</a> Scientific Reports. 6, 29766-29778 (2016).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UV+crosslinked+mRNA-binding+proteins+captured+from+leaf+mesophyll+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">UV crosslinked mRNA-binding proteins captured from leaf mesophyll protoplasts.</a> Plant Methods. 12, 42-53 (2016).</li>
<li>Bunnik, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mRNA-bound+proteome+of+the+human+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">The mRNA-bound proteome of the human malaria parasite Plasmodium falciparum.</a> Genome Biology. 17, 147-164 (2016).</li>
<li>Lueong, S., Merce, C., Fischer, B., Hoheisel, J. D., Erben, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+regulatory+networks+in+Trypanosoma+brucei%3A+insights+into+the+role+of+the+mRNA-binding+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Gene expression regulatory networks in Trypanosoma brucei: insights into the role of the mRNA-binding proteome.</a> Molecular Microbiology. 100 (3), 457-471 (2016).</li>
<li>Nandan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+identification+of+mRNA-binding+proteins+of+Leishmania+donovani+by+interactome+capture%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comprehensive identification of mRNA-binding proteins of Leishmania donovani by interactome capture.</a> PLoS ONE. 12 (1), e0170068(2017).</li>
<li>Jankowsky, E., Harris, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+and+nonspecificity+in+RNA-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Specificity and nonspecificity in RNA-protein interactions.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (9), 533-544 (2015).</li>
<li>Huang, R., Han, M., Meng, L., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+discovery+of+coding+and+noncoding+RNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide discovery of coding and noncoding RNA-binding proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (17), E3879-E3887 (2018).</li>
<li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-gel+digestion+for+mass+spectrometric+characterization+of+proteins+and+proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes.</a> Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).</li>
<li>Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+peptide+stable+isotope+dimethyl+labeling+for+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics.</a> Nature Protocols. 4 (4), 484-494 (2009).</li>
<li>Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+micro-purification%2C+enrichment%2C+pre-fractionation+and+storage+of+peptides+for+proteomics+using+StageTips%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips.</a> Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).</li>
<li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates%2C+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li>
<li>Ritchie, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((limma+powers+differential+expression+analyses+for+RNA-sequencing+and+microarray+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies.</a> Nucleic Acids Research. 43 (7), e47(2015).</li>
<li>Grammel, M., Hang, H., Conrad, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+reporters+for+monitoring+RNA+synthesis+and+poly%28A%29+tail+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Chemical reporters for monitoring RNA synthesis and poly(A) tail dynamics.</a> ChemBioChem. 13 (8), 1112-1115 (2012).</li>
<li>Curanovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+profiling+of+stimulus-induced+polyadenylation+in+cells+using+a+poly%28A%29+trap%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Global profiling of stimulus-induced polyadenylation in cells using a poly(A) trap.</a> Nature Chemical Biology. 9 (11), 671-673 (2013).</li>
<li>Zheng, Y. X., Beal, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+evaluation+of+an+alkyne-modified+ATP+analog+for+enzymatic+incorporation+into+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+%26+Medicinal+Chemistry+Letters%22%5BJournal%5D)">Synthesis and evaluation of an alkyne-modified ATP analog for enzymatic incorporation into RNA.</a> Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 26 (7), 1799-1802 (2016).</li>
<li>Nainar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+incorporation+of+azide+functionality+into+cellular+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Metabolic incorporation of azide functionality into cellular RNA.</a> ChemBioChem. 17 (22), 2149-2152 (2016).</li>
<li>Bao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+the+interactome+of+newly+transcribed+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Capturing the interactome of newly transcribed RNA.</a> Nature Methods. 15 (3), 213-220 (2018).</li>
<li>Holmqvist, E., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-binding+proteins+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">RNA-binding proteins in bacteria.</a> Nature Reviews Microbiology. , Published online (2018).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

שמירה על תקינות RNA הוגן הוא אחד המפתחות ניסויים CARIC מוצלח. עם ליגנדים המתאים של Cu(I) ותפעול זהיר, השפלה RNA ניתן להפחתה, למרות ההשפלה חלקית נצפתה. יחס החלפה של האיחוד האירופי, 4SU בדגימות ניסיוני הם 1.18% ו- 0.46%, בהתאמה (נתונים לא מוצג). עבור RNAs שלמים באורך של 2,000 nt, ~ 90% של RNAs להכיל אחד לפחות של האיחוד האירופי, 4SU אחד. עבור RNAs מפורק חלקית עם אורך של 1,000 nt, ~ 70% של RNAs להכיל אחד לפחות של האיחוד האירופי, 4SU אחד. לכן, השפלה חלקית של RNAs באופן דרמטי להקטין את היעילות של CARIC, בעוד השפלה חמורה ולא מק...

הגנום האנושי הוא עיבד לתוך סוגים שונים של קידוד ו noncoding RNAs (ncRNAs), כולל mRNAs, rRNAs, tRNAs, RNAs גרעיני קטן (snRNAs), קטן nucleolar RNAs (snoRNAs) ולונג ללא קידוד RNAs (lncRNAs)1. רוב אלה RNAs להחזיק בגדים של RBPs, לתפקד כמו חלקיקים (RNPs) ribonucleoprotein2. לכן, זיהוי מקיף של RBPs היא תנאי הכרחי להבנת הרשת תקינה בין RNAs RBPs, אשר הייתה שם מחלות אנושיות שונות3,4,5.
בשנים האחרונות עדים דחיפה גדולה של RBPs גילה שונים מערכות האיקריוטים2,6, כולל האדם7,8,9,10,11, העכבר12,13,14, שמרים9,15,16, דג זברה17, דרוזופילה melanogaster18,19 , Caenorhabditis elegans16 תודרנית לבנה20,21,22, האדם טפילים23,24,25 . ההתפתחויות הללו יש כבר בהנחייתם של אסטרטגיית לכידת RBP שפותחה על ידי Castello. et al. 7 ו. Baltz et al. 8 ב 2012, המשלב ויוו UV cross-linking של RNA, שמעצבת חלבונים, לכידת oligo(dT) poly(A) RNAs, ושל ספקטרומטר מסה (MS)-מבוסס פרופיל פרוטיאומיה מבנית. עם זאת, בהתחשב בעובדה ש-poly(a) זה קיים בעיקר mRNAs בוגר, אשר חשבון עבור ~ 3% - 5% בלבד של transcriptome האיקריוטים26, האסטרטגיה הנפוצה הזו אינה מסוגלת ללכוד RBPs אינטראקציה עם non-poly(A) RNAs, כולל רוב ncRNAs pre-mRNAs.
כאן, אנו מדווחים על ההליכים מפורט של האסטרטגיה שפותחו לאחרונה ללכידתו transcriptome ברוחב של RBPs הן poly(A) והן non-poly(A)27. כינה CARIC, אסטרטגיה זו משלב ויוו UV cross-linking, תיוג מטבולית של RNAs עם photoactivatable ו- "לחיץ" nucleoside תחליפי (אשר מכילים קבוצה פונקציונלית bioorthogonal יכולים להשתתף תגובת לחץ), 4 - thiouridine (4SU), 5-ethynyluridine (האיחוד האירופי). השלבים הם המפתח להגיע לתוצאות אידיאלי עם האסטרטגיה CARIC הם תיוג מטבולית יעיל, התגובה cross-linking ולחץ UV, שמירה על שלמות RNA. כי Cu(I) משמש הזרז בתגובה לחץ יכול לגרום את הפיצול של RNAs, ליגנד Cu(I) שיכולים להפחית פיצול RNA הוא חיוני. אנו מתארים כיצד לבצע תגובות לחץ יעיל ב תא lysates מבלי לגרום השפלה RNA חמורה.
למרות RBP ללכוד, זיהוי בתאים הלה רק מתואר במסגרת פרוטוקול זה, ניתן ליישם את האסטרטגיה CARIC לסוגי תאים שונים ואולי אף אורגניזמים חיים. חוץ RBP לכידת, פרוטוקול זה מספק גם הליכים צעד אחר צעד יעיל עבור הכנת הדוגמא MS וחלבון וכימות, אשר יכול להיות שימושי עבור אלה שאינם מכירים פרוטיאומיה מבנית ניסויים.

<table><tbody><tr><td>HeLa</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM (מדיום הנשר השונה של Dulbecco)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>FBS (סרום בקר עוברי)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10099141</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין & Streptomycin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>האיחוד האירופי (5-ethynyl uridine)</td><td>Wuhu Huaren Co.</td><td>CAS:69075-42-9</td><td></td></tr><tr><td>4SU (4-thiouridine)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4509</td><td></td></tr><tr><td>10&; PBS (מי מלח חוצץ פוספט)Thermo</td> <td>Fisher Scientific</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>UV cross-linker</td><td>UVP</td><td>CL-1000</td><td>מצויד במנורת UV 365 ננומטר</td></tr><tr><td>DEPC (דיאתיל פירוקרבונט)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5758</td><td>לטיפול במים. רעיל מאוד!</td></tr><tr><td>Tris&middot; HCl, pH 7.5</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15567027</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>62476</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40</td><td>Biodee</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>קוקטייל מעכב פרוטאז ללא EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88265</td><td>טבליה אחת למאגר ליזה של 50 מ"ל.</td></tr><tr><td>LDS (ליתיום דודציל סולפט)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L9781</td><td></td></tr><tr><td>צינור אולטרה-סינון 15 מ"ל (חתך 10 kDa)</td><td></td>צינור אולטרה-סינון <td>Millipore</td> UFC901024 <td></td></tr><tr><td>0.5 מ"ל (חתך 10 kDa)</td>חרוזים מגנטיים <td>של Millipore</td><td>UFC501096</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88816</td><td></td></tr><tr><td>DMSO (דימתיל סולפוקסיד)</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>41639</td><td></td></tr><tr><td>Azide-biotin</td><td>Click Chemistry Tools</td><td>AZ104</td><td></td></tr><tr><td>נחושת (II) סולפט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>C1297</td><td></td></tr><tr><td>THPTA [Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine]</td> <td>סיגמא אולדריץ'</td><td>762342</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אסקורבט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>Azide-CY5</td><td>קליק כלי כימיה</td><td>AZ118</td><td></td></tr><tr><td>מאגר דגימת LDS (4&)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0008</td><td></td></tr><tr><td>10% ביס-טריס ג'ל</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0301BOX</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R6513</td><td></td></tr><tr><td>SDS (נתרן דודציל סולפט)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15525017</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Brij-97 [פוליאוקסיאתילן (20) אתר אוליל]</td><td>J& K</td><td>315442</td><td></td></tr><tr><td>Triethanolamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V900257</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin agarose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20353</td><td></td></tr><tr><td>אוריאה</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>U5378</td><td></td></tr><tr><td>סרקוזיל (N-Lauroylsarcosine salt נתרן)</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>61743</td><td></td></tr><tr><td>ביוטין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>B4501</td><td></td></tr><tr><td>נתרן דאוקסיכולאט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>גרסת MaxQuant</td><td></td><td></td><td>: 1.5.5.1</td></tr></tbody></table>

לכידת וזיהוי של rna-מחייב חלבונים באמצעות לחץ בסיוע כימיה rna-interactome ללכוד אסטרטגיה (caric)

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

מזהה מקיף של RNA-מחייב חלבונים (RBPs) הוא מפתח להבנת הרשת תקינה posttranscriptional בתאים. אסטרטגיה בשימוש נרחב עבור לכידת RBP מנצלת את פוליאדנילציה [poly(A)] של RNAs היעד, אשר מתרחשת בעיקר על האיקריוטים mRNAs בוגר, עוזב את רוב מחייב חלבונים של non-poly(A) RNAs לא מזוהה. כאן נתאר את הליכים מפורטים של שיטת דיווחו לאחרונה כינה לחץ בסיוע כימיה RNA-interactome הלכידה (CARIC), אשר מאפשר לכידת transcriptome-wide RBPs הן poly(A) והן non-poly(A) על ידי שילוב של תיוג מטבולית של RNAs ויוו UV cross-linking, תיוג bioorthogonal.

התוצאות נציג של בקרת איכות הפעולות מוצגים. התוצאות כוללות דמויות של הניתוח בג'ל פלורסצנטיות שמתואר בשלב 2.3.2 (איור 1), הניתוח תספיג שמתואר בשלב 4.1.3 (איור 2 א) הניתוח מכתים כסף שמתואר בשלב 4.2.2 (איור 2B). השלבים בקרת איכות הם קריטיים עבור אופטימיזציה של פרוטוקולים CARIC. תמיד לכלול פקדים איכות הכנת ניסויים בקנה מידה גדול של זיהוי RBP.
<i...

פרוטוקול מפורט להחלת לחץ בסיוע כימיה RNA-interactome הלכידה (CARIC) האסטרטגיה כדי לזהות חלבונים איגוד כדי שני קידוד ו noncoding RNAs מוצג.

לכידת וזיהוי של RNA-מחייב חלבונים באמצעות לחץ בסיוע כימיה RNA-interactome ללכוד אסטרטגיה (CARIC)

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

שיטה זו, CARIC, יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום שלאחר שעתוק של בילוי גנים על ידי מתן מפקד מקיף של חלבונים מחייבי RNA. היתרון העיקרי של CARIC הוא היכולת שלה ללכוד חלבונים הקשורים לסוגים שונים של RNAs כגון mRNAs ו- RNAs שאינם קידוד. שיטה זו יכולה לשמש בסוגים שונים ואת האורגניזם כדי ללמוד את האינטראקציה חלבון RNA בעבודה.ראשית, תאי HeLa תרבותיים ב- DMEM בתוספת ב 37 מעלות צלזיוס באטמוספרה של חמישה אחוזים CO2. כאשר התאים מגיעים כ 80 אחוז confluence להחליף את מדיום התרבות על כל מנה עם 15 מיליליטר של מראש, בינוני טרי. הוסף 15 microliters של 100 מילימולר האיחוד האירופי לכל מנה לריכוז סופי של מילימולר אחד.לדגימות בקרת UV ניסיוניות וללא UV הוסיפו 7.5 מיקרוליטרים של 100 מילימולרים ארבעה SU לכל מנה. מכסים את הכלים בנייר כסף ותרבות התאים במשך 16 שעות באמצעות התנאים הקודמים. לאחר מכן, להוסיף מחצית הסכום הקודם של האיחוד האירופי ו / או ארבעה SU לצלחות המתאימות ולהמשיך culturing במשך שעתיים נוספות.כדי להתחיל בקישור צולב vivo, להסיר את מדיום התרבות ולשטוף כל מנה שלוש פעמים עם PBS באמצעות חמישה מיליליטר של PBS לכל לשטוף. הסר את שאריות PBS ככל האפשר. עבור ניסיוני ולא ארבע דגימות בקרת SU, מניחים את הכלים על קרח עם המכסה הוסר.השתמש UV cross-linker כדי להקרין את התאים עם אור UV ב 365 ננומטר ב שני ז'ול סנטימטר בריבוע. עבור דגימות בקרת UV ללא, מניחים את הכלים על קרח ולהגן עליהם מפני אור. לאחר מכן, מוסיפים מיליליטר אחד של מאגר פרה-סיסה לכל מנה.השתמש מרים תא גומי כדי לגרד את התאים ולאסוף את ההשעיה prelysis בצינור 15 מיליליטר. הוסף חיץ prelysis לצינור המכיל את ההשעיה משתי מנות התאמת הנפח הכולל לשישה מיליליטר. לאחר מכן הוסף אמצעי אחסון שווה של מאגר lysis R.מעבירים את ליסט התא דרך מזרק עם מחט צרה מספר פעמים עד שהליסט ברור והומוגני. הדגירה lysate בארבע מעלות צלזיוס עם סיבוב עדין במשך שעה אחת. לאחר זה לדלל את lysate ב 20 כרכים של חיץ דילול ולחלק אותו 15 שברים מיליליטר ב 15 צינורות untrafiltration מיליליטר, ניתוק מולקולרי של 10 קילודלטונים.באמצעות מסובב דלי מתנדנד, לסובב את הצינורות ב 4000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס במשך כ 15 דקות עד כל שבר מרוכז לנפח פחות ממיליליטר אחד. מוסיפים 14 מיליליטר של חיץ דילול לכל שבר ליט מרוכז וחוזרים על תהליך הריכוז. לאחר מכן לשלב את השברים ולרכז אותם לנפח של שישה מיליליטר באמצעות תהליך הריכוז שתואר קודם לכן.תחילה הכינו את ערבוב התגובות כמתואר בפרוטוקול הטקסט. מוסיפים את תערובת התגובה לשישה מיליליטר של ליט מנוקה מראש ומערבבים היטב. מוסיפים 162.5 מיקרוליטרים להפחתת רהגנט ומערבבים היטב.דגירה בטמפרטורת החדר על שייקר מסלולית ב 800 סל"ד במשך שעתיים. לאחר מכן מרווה את התגובה על ידי הוספת EDTA מילימולר ודגירה על שייקר מסלולית בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. לאחר מכן, לפצל את תערובת התגובה בין שני צינורות 50 מיליליטר, כל אחד מכיל ארבעה כרכים של מתנול מקורר מראש דגירה שלילית 30 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.צנטריפוגה ב 4000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. השליכו את העל-טבעי והוסיפו בין מיליליטר אחד לשני מיליליטר של מתנול מקורר מראש לכדור. Pipet למעלה ולמטה כדי לשבור את גלולה לוודא כי גלולה בסופו של דבר מושעה לחלוטין ללא נתחים גלויים.חזור על תהליך הצנטריפוגה וההפוגה פעמיים. לאחר מכן, בזהירות למשוך את מתנול שיורית ככל האפשר לוודא לא להפריע גלולה. הוסף 10 מיליליטר של חיץ התחדשות צינור למעלה ולמטה כדי להמיס את גלולה.צנטריפוגה ב 4000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. לאחר מכן להעביר את supernatant לצינור חדש הקפד לאסוף 20 microliters של המדגם לבקרת איכות. מעבירים את הדגימה המנוקה והמשוחזרת לתרוזות הסטרפטבידין המוכנות.דגירה בארבע מעלות צלזיוס עם סיבוב עדין לילה. סובב את חרוזים ב 4000 פעמים G במשך חמש דקות. העבר את supernatant לצינור חדש הקפד לאסוף 20 microliters של המדגם לבקרת איכות.לשטוף את חרוזים עם 10 מיליליטר של חיץ לשטוף A.Incubate עם סיבוב עדין ב 12 סל"ד ו בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. ואז לסובב את חרוזים ב 4000 פעמים G במשך חמש דקות. הסר את העל-טבעי וחזור שוב על תהליך הכביסה והצנטריפוגה.חזור על תהליך שטיפה זה עבור מאגר שטיפה B ושטיפת מאגר C כמפורט בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, לשטוף את חרוזים עם 10 מיליליטר של 50 מילימולר טריס הידרוכלוריד. לסובב את חרוזים למטה ב 4000 פעמים G במשך חמש דקות.הסר את העל-טבעי ופצל את חרוזים באופן שווה בין שני צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5. כדי להתחיל לחמק RNPs שנתפסו, להוסיף 400 microliters של מאגר אלוטין ביוטין מוכן 400 microliters של נדנוד, חרוזים מיושבים. דגירה על שייקר מסלולית ב 1500 סל"ד בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות.ואז דגירה על שייקר מסלולית עם בלוק חום ב 1500 סל"ד ו 65 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. צנטריפוגה את חרוזים ב 7800 פעמים G במשך דקה אחת ולאסוף את RNP חמק. מוסיפים 400 מיקרוליטרים של מאגר אלוטין ביוטין טרי לחרוזים.חזור על תהליך הדגירה והצנטריפוגה כדי לאסוף אלוט שני ולשלב את שני elutes בצינור אחד 15 מיליליטר. לאחר מכן, הוסף שלושה אמצעי אחסון של מאגר דילול ל- RNP המשולב כדי להקטין את הריכוז של SDS. באמצעות צינור סינון אולטרה 0.5 מיליליטר, לרכז את המדגם על 40 microliters כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט.הוסף 0.5 מיקרוגרם למיקרוליטר RNase A ודגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים כדי לשחרר RBPs מ RNase מקושר. לאסוף שני microliters של RBPs לבקרת איכות. בעת מיטוב פרוטוקולי CARIC, שלבי בקרת האיכות הם קריטיים.בקרת איכות מייצגת של הדגימות המסותוויות בלחיצה מתבצעת באמצעות ניתוחי פלואורסצנטיות בג'ל. רק המדגם המסומן כפליים מראה רצועת מריחה חזקה במשקל מולקולרי גבוה המייצגת את האות של RNPs מקושרים. אות ה- RNP מבוטל על-ידי השמטת ארבעת ה- SU או האיחוד האירופי. זה יכול גם להיות בוטל על ידי עיכול עם RNase A.In במקרים מסוימים רצועה מרוחה חזקה נצפתה לא ארבע מדגם בקרת SU.רצועה זו מייצגת את RNase לא מקושרים שכותרתו אשר יהיה להשפיל במהלך innaturation החום ברוב המקרים. בקרת איכות של זיקה סקר dataficiency מוערך באמצעות ניתוח כתם מערבי אשר מראה את אותות ביוטין בדגימות הן לפני נסיגה ולאחר נסיגה. ניתוח כתמי כסף של RBPs שנתפסו מגלה כי עבור תאי HeLa, יעילות הלכידה הכוללת הכללית היא בין 0.05 ל -0.1 אחוזים מחלבוני הקלט.בעת ניסיון הליך זה חשוב לזכור כי RNase רגישים ריבונוקלזות. שמור על הסביבה הניסיונית נקייה ככל האפשר כדי להפחית את degredation של RNase. בעקבות הליך זה, זיהוי חלבון almake באמצעות ספקטרומטריית מסה יכול להיות preformed כדי לחשוף את החלבונים ברזל תוחמים.לאחר פיתוחה, טכניקת CARIC תסלול את הדרך להבנה מקיפה יותר של תקנת OT שעתוק הדואר בעבודה.

capture-identification-rna-binding-proteins-using-click-chemistry

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

תעתיקי רנ"א כפופים תקנה posttranscriptional נרחב כי הוא מתווך על ידי מספר רב של טרנס משחק RNA מחייב חלבונים (RBPs). כאן אנו מציגים שיטה להכליל לזהות במדויק בקנה מידה רחב transcriptome האתרים RNA מחייב של RBPs.

PAR-Clip - שיטה לזהות Transcriptome רחב אתרי קישור של חלבונים RNA הכבילה

סרטון זה מדגים בדיקת RNA במבחנה נפתחת לזיהוי חלבונים קושרי RNA (RBPs), אשר מקיימים אינטראקציה עם רצפי היסוד העשיר באדנילט-אורידילאט (ARE) ב-mRNA. RBPs המטרה מליזט התא מעורבבים עם בדיקת RNA כדי ליצור קומפלקסים של RNA-חלבון. הקומפלקסים מבודדים באמצעות טיהור זיקה תוך ניצול הזיקה של תווית הדסתיוביוטין של גשושית הרנ"א לחרוז מגנטי המסומן בסטרפטווידין.

RNA-Protein Pull-Down Assay לבידוד חלבונים קושרי RNA באמצעות מיצוי זיקה

בסרטון זה, אנו מתארים את האבולוציה השיטתית של ליגנדות בשיטת העשרה מעריכית (SELEX) כדי לזהות רצפים ספציפיים קושרי RNA עבור חלבון מטרה מעניין. החלבון מודגר עם מאגר גדול של רצפי RNA אקראיים, ורצפי הרנ"א קושרי החלבון מבודדים, מוגברים ב-PCR ומרוצפים כדי לזהות את אתרי קשירת החלבונים שלהם.

בדיקת קשירת מבחנה מבוססת SELEX לזיהוי אינטראקציות RNA-חלבון

פרוטוקול RNA הנפתח הוא מותאם כאן לגילוי של אינטראקציות בין חלבונים קושרי RNA (RBPs) ו noncoding וכן RNAs קידוד. מקטע RNA מן לקולטן האנדרוגן (AR) שימש כדוגמה כדי להדגים כיצד לאחזר RBP שלה lystate של adipocytes חום ראשוני.

זיהוי של חלבונים קושרי RNA על ידי<em&gt; במבחנה</em&gt; RNA הנפתח ב adipocyte תרבות

אינטראקציות חלבון RNA נמצאות בלב תהליכים תאיים רבים. כאן, אנו מתארים שיטת in vivo לבידוד RNA ספציפי וזיהוי חלבונים חדשים הקשורים אליו. זה יכול לשפוך אור חדש על האופן שבו RNA מווסתים בתא.

RNA מחייב רומן בידוד חלבונים לפי שיטת RAPID

אנו מתארים פרוטוקול כדי לזהות רנ א מחייב חלבונים ולמפות אזורים מחייב RNA שלהם ב תאים חיים באמצעות photocrosslinking בתיווך UV וספקטרומטר מסה.

הכנת הדוגמא לזיהוי מבוססי ספקטרומטר מסה של RNA-איגוד אזורים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להעשיר את אתרי ה-RNA האנדוגניים או "עקבות" של RNA: מכלולי חלבון (RNP) מתאי יונקים. גישה זו כוללת שני immunoprecipitations של RNP תת יחידות, ולכן המכונה RNA immunoprecipitation בטנדם (RIPiT).

זיהוי של טביעות רגליים של RNA: מכלולי חלבון באמצעות RNA Immunoprecipitation בטנדם ואחריו רצף (RIPiT-Seq)

כאן אנו מציגים פרוטוקול קליפ-seq שונה בשם FBIoקליפ-seq עם טיהור דגל-ביוטין טנדם כדי לקבוע את מטרות RNA של חלבונים מחייבים RNA (RBPs) בתאים יונקים.

פרופיל תמלול רחב של אינטראקציות חלבון-RNA על ידי קישור צולב וחיסונים בתיווך על ידי טיהור דגל-ביוטין טנדם

הצלבה קינטית וניתוח של cDNA היא שיטה המאפשרת לחקור את הדינמיקה של אינטראקציות חלבון-RNA בתאים חיים ברזולוציה טמפורלית גבוהה. כאן מתואר בפירוט הפרוטוקול, כולל גידול תאי שמרים, הצלבת UV, קציר, טיהור חלבונים ושלבי הכנת ספריית הריצוף של הדור הבא.

ניטור דינמיקת אינטראקציה חלבון-רנ"א ב-Vivo ברזולוציה טמפורלית גבוהה באמצעות χCRAC

כאן, אנו מציגים שיטה מותאמת במבחנה לחשיפה, כימות ואימות של אינטראקטורים חלבוניים של רצפי RNA ספציפיים, תוך שימוש בתמצית חלבון כוללת מתאים אנושיים, חרוזי סטרפטווידין המצופים ב-RNA ביוטינילציה וניתוח ספקטרומטריית מסות.

ניתוח כמותי אופטימלי של חלבונים קושרי RNA באמצעות RNA קצר ביוטינילציה

למדו את שיטת CARIC ללכידת חלבונים המחייבים RNA בקידוד ובלא-קידוד באמצעות כימיה לחיצה. השיטה מסייעת לחקר אינטראקציות RNA-חלבון בתאי HeLa ובהבנת רגולציה לאחר שעתוק.

לכידת וזיהוי של RNA-מחייב חלבונים באמצעות לחץ בסיוע כימיה RNA-interactome ללכוד אסטרטגיה (CARIC)

גלה סרטונים נוספים