Name: כיצד ניתן לכמת את השבר של Photoactivated פלורסנט חלבונים בכמות גדולה, תאים חיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: למדו פרוטוקול לכימות יעילות הפעלת אור של חלבונים פלורסנטיים בתאים חיים באמצעות שילוב גנטי של חלבונים ספקטרליים שונים. השיטה מאפשרת השוואת מצבי הפעלה שונים ושיפור מחקרים בנוירומדע וביולוגיה תאית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות המעבדה Dorigo והשירות מדעי המוח הדמיה בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת סטנפורד על מתן שטח וציוד עבור פרוייקט זה.

1. פלסמיד בנייה
<ol><li>צור שני צבעים פיוז'ן הגששים. השתמש וקטור ביטוי בתרבית של תאים (ראה טבלה של חומרים), אילו mCherry112 , PA-mCherry113 נוספו עם ההגבלה באתרי AgeI ו BsrGI.
</li>
	<li>סדר מותאם אישית oligo-נוקלאוטידים כדי להגביר את monomeric וריאציות של eGFP ו- PA-eGFP המכילות את המוטציה A206K, קרי, mEGFP ואת הרשות הפלסטינית-mEGFP14 ללא stop codon בתור קטע סאלי-BamHI . השתמש ומהצמיגים N-מסוף 5'-AAT TAA חטיבתי TCG ACG ATG חברתנו AGC AAG GGC איסור פרסום G 3' ו- C-מסוף פריימר 5'-AAT אתא TGG ATC CCG CTT GTA חטיבתי CTC GTC החתול GC 3' והכנס הזה שבר סאלי-BamHI לתוך האתר שיבוט מרובים של הווקטור הביטוי. פעולה זו תיצור את מקשר חומצת אמינו חמש RNPPV בין חלבון פלואורסצנטי ירוק ואדום. נתייחס כימרות fluorophore כמו GFP – דובדבן, הרשות הפלסטינית-GFP – דובדבן, GFP — הרשות הפלסטינית-שרי למשך שאר מאמר זה. הערה: את צימוד של fluorophores ויצירה של שליטים פנימי כדי להעריך את יעילות photoactivation ניתן לעשות עם כל זוג fluorophore spectrally שונות, למשל superfolder הרשות הפלסטינית-GFP 15/ PA-TagRFP 16, וכו '. רבים מן החלבונים פלורסנט photoactivatable נגזרות GFP. לפיכך, הרצף פריימר הכלול לעיל ניתן הרבה חלבונים פלורסנט לבנות שימרה fluorophore ב וקטור ביטוי בתרבית של תאים.</li>
</ol>2. התא תרבות, תרביות תאים
<ol><li>השתמש גם קו תא סטנדרטי כלשהו כגון הלה, NRK, כי-7 או קו תא מסוים שישמש עבור ניסויים photoactivation ספציפיים. DMEM (בתוספת 10% סרום שור עוברית, גלוטמין 2 מ מ) ולהשתמש טריפסין ללא פנול אדום (ראה טבלה של חומרים) כדי להפחית את רקע זריחה.</li>
	<li>לנתק את התאים של תרבות confluent עם טריפסין, לספור את מספר התאים ההשעיה התא באמצעות תא נויבאואר, ותאי זרע 5000 – 10,000 לכל טוב. לחלופין, השתמש טיפה 1 מ פיפטה 2-mL של השעיה 10-mL תא מתרבות תא confluent גדל בבקבוקון תרבות 25-תא T או 3 טיפות של השעיה 5-mL תא מתרבות confluent גדל בבקבוקון תרבות 12.5-תא T.</li>
	<li>לגדל תאים בתאי 8-ובכן עם מכסה #1.0 זכוכית (ראה טבלה של חומרים) על ידי קרינה פלואורסצנטית לחיות תאים במיקרוסקופ.</li>
	<li>Transfect תאים 24 שעות לאחר ציפוי שימוש מסחרי ריאגנטים (ראה טבלה של חומרים) לכל הפרוטוקול של מפיצים עם GFP – דובדבן, הרשות הפלסטינית-GFP – דובדבן, GFP — כימרות הרשות הפלסטינית-שרי.</li>
	<li>התמונה תאים לאחר סך של 20 h לפרסם תקנים כדי לאפשר ביטוי חלבון, קיפול של התבגרות.</li>
</ol>3. הדמיה ו- Photoactivation
<ol><li>התמונה תאים בתוך תא humidified ומחוממים סביבתי-37 מעלות צלזיוס. מאגר המדיה הנייד ב- pH פיזיולוגיים, להפוך אותה CO2-עצמאית, להוסיף 20 מ מ HEPES או גז CO2 מוגדר כ- 5% זרימה.</li>
	<li>תמונה ראשונה, התאים לבטא את ה-GFP – לבנות דובדבן. להגדיר פרמטרים המגדירים את עוצמת לייזר משולב-זמן לכל פיקסל תמונת וידאו, קרי, פיקסל להתעכב זמן במיקרו, מסנן tunable אקוסטו אופטי (AOTF) שידור אחוזים, זום דיגיטלי. הערה: שימוש מטרה 60 x, זום דיגיטלי של 3 x מאפשר הדמיה של תא בשלמותו תוך מתן ההגדלה מספיקות. הגדר פיקסל להתעכב זמן 2-4 μs ושידור AOTF הלייזר 488 ננומטר, 561-nm כך תמונות להראות יחס אות לרעש טוב בלי שום הלבנה, פיקסלים המציין רוויה עוצמת קרינה פלואורסצנטית.</li>
	<li>תמונה, באמצעות עוצמת הלייזר קבע, AOTF שידור, זמן להתעכב פיקסל זום דיגיטלי, 15-20 תאים המבטאים GFP – דובדבן.</li>
	<li>לאחר מכן, תמונה עם אותו כוח לייזר קבע, פיקסל להתעכב זמן, שידור AOTF זום דיגיטלי תאים המבטאים GFP – הרשות הפלסטינית-שרי והרשות הפלסטינית-GFP — דובדבן. חיפוש לביטוי תאים ערוץ ירוק או אדום ערוץ, בהתאמה. למנוע חשיפה ארוכה של התאים במהלך החיפוש לביטוי תאים כדי לא להלבין את החלבונים פלורסנט.</li>
	<li>לקבוע סדרה זמן מיני עם תמונה קדם-הפעלה אחת, שלוש תמונות אחר-הפעלה. הדימויים שלאחר הפעלת תסייע לזהות פוטנציאל מצבי כהה ארעי עקב החשיפה לאור-UV. הערה: בידיים שלנו, שינויים בעוצמת פלורסצנטיות שזוהו עקב הברית כהה ארעי היו < 1% יכול להיות מוזנח, אבל מדינות כהה וצריך להעריך עבור כל הגדרת ניסיוני.</li>
	<li>כדי לקבוע יעילות photoactivation, קרי, השבר של הרשות הפלסטינית-FPs אשר פעילה להיות פלורסנט, בניסויים photoactivation ספציפי זה כבר הוקמו, להחיל את אותן הגדרות photoactivation 15-20 תאים זה הם ביטוי השליטים פנימית הציג כאן ולהמשיך עם ניתוח תמונות (סעיף 4). אם להתחיל להגדיר photoactivation ניסויים, למצוא כאן כמה הגדרות שונות בהתבסס על נסיוננו ניסיוני עם הרשות הפלסטינית-GFP, הרשות הפלסטינית-שרי; לשנות לפי הצורך.<ol>
<li>עבור photoactivation מיידי של הרשות הפלסטינית-GFP, הרשות הפלסטינית-שרי באמצעות לייזר קונפוקלי סורק מיקרוסקופ (CLSM), החל μW 90 של 405 ננומטר לייזר אור ב- 3 או 5 חזרות, בהתאמה. הערה: עם הגדרת מיקרוסקופיים שלנו, באמצעות שידור AOTM 38% וזמן להתעכב 2 μs פיקסל, מדדנו את הכוח 405 ננומטר לייזר הזה במצב קו-scan בעדשה המטרה. עם הגדרות אלו, כ- 8% ו-16% של הרשות הפלסטינית-GFP, הרשות הפלסטינית-שרי הביע יכול להיות photoactivated יהיה פלורסנט. הסדרה כולה טיטור שימוש CLSM photoactivation מיידי כבר פורסם בעבר17.</li>
		<li>אם חלק גבוה יותר של fluorophores הרשות הפלסטינית-GFP, הרשות הפלסטינית-שרי photoactivated הוא יתרון למשל כדי להשיג יחס אות לרעש גבוה יותר, photoactivation לא חייב להיות מיידי, החל μW 40 של 405 ננומטר לייזר אור עם 6% ואינטרנט μs פיקסל להתעכב זמן 2 AOTF שידור עבור 450 חזרות. לאחר מכן, photoactivation תימשך עד 4 דקות ולא רק 1-2 שניות, אך photoactivation יעילות עבור הרשות הפלסטינית-GFP יהיה 29% במקום 8%, המאפשרות יחס אות לרעש גבוה יותר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>אם מערכת תאורה דיגיטלית פסיפס המכילה מראה מיקרו מערכים ב- פני מאפנן אור מרחבי זמין, אור 405 ננומטר לייזר יכול לשמש עבור widefield-photoactivation. דבר זה מאפשר photoactivation יעיל בתוך אלפיות השנייה. הערה: עם 1.6 מגה-וואט עוצמת הלייזר כפי שנמדד על העדשה מטרה וזמן חשיפה של 250 ms, 29% של הרשות הפלסטינית-GFP ניתן photoactivated להיות פלורסנט.</li>
	<li>תמונה עם פרמטרים קבועים photoactivation 15-20 תאים המבטאים הרשות הפלסטינית-GFP – דובדבן ו- GFP – הרשות הפלסטינית-שרי, בהתאמה.</li>
	<li>מאז ה-pH, מינים חמצן תגובתי וגורמים סביבתיים אחרים עשויים להשפיע על יעילות photoactivation, זה עשוי להיות חשוב להעריך את היעילות photoactivation של הרשות הפלסטינית-FPs ב micromilieu subcellular בהתאמה איפה החלבון עניין מלון. על ידי צימוד כימרות fluorophore את החלבון של עניין, כמו המחברים עשו עם קרום פלזמה חלבונים VSVG 18, יעילות photoactivation יכול להיות מוערך בתא subcellular ספציפית עניין.</li>
</ol>4. בתמונה ניתוח האלגוריתם על רציומטרי המבוסס על עוצמת כימות של יעילות Photoactivation
<ol><li>ניתוח תמונות יכול להיעשות עם התמונה קוד פתוח עיבוד פלטפורמות ImageJ או פיג'י. קבע את עוצמת קרינה פלואורסצנטית רקע בתאים שאינם transfected גרין (B1), הערוץ האדום (ב2). להימנע perinuclear או אזורים מציג אוטומטית מוגבר-זריחה.</li>
	<li>כדי לקבוע את עוצמת קרינה פלואורסצנטית בתא transfected, חלוקה לרמות בגוף התא בעזרת הכלי בחירות חופשיות. שוב, להימנע perinuclear או בתחומים אחרים מציג אוטומטית-זריחה.</li>
	<li>להחסיר את הרקע של עוצמת קרינה פלואורסצנטית שנמדד בכל ערוץ. אניG = אניGreen_measured – B1 אניR = אניRed_measured – B2
</li>
	<li>להשתמש את GFP – לבנות דובדבן כדי לחשב את יחס אדום-כדי-ירוק (RtoGr) ולתקן להרוות תורם עקב העברת האנרגיה של תהודה קרינה פלואורסצנטית (סריג). היעילות סריג E היה נחוש בדעתו להיות 0.3 בניסויים הקודמים עבור GFP – דובדבן לבנות באמצעות את אותו חומצת אמינו מקשר בין שני fluorophores18. RtoGr = (אניRed_measured – B2) / (אניGreen_measured – B1) RtoGrקור = RtoGr * (1-E) הערה: בגישה זו בעוצמה-מבוסס, התורם שכבתה עבור mEGFP ו- PA-mGFP עשוי להיות שונה ניתנה אפשרי תכונות ספקטרליות ברורים אשר לא אפיינו. הקצב של קשת/קשתית (kET) ואת המרחק פרסטר (R0) תלוי התשואה קוונטית של התורם אשר טרם נקבע עבור mEGFP ו- PA-mGFP.</li>
	<li>להשתמש את GFP – הרשות הפלסטינית-שרי לבנות כדי להעריך את השבר של photoactivated הרשות הפלסטינית-שרי. לקבוע את עוצמת קרינה פלואורסצנטית הצפוי של הרשות הפלסטינית-שרי על-ידי הכפלת את עוצמת נמדד פלורסצנטיות ירוק הפצועות GFP-הרשות הפלסטינית-שרי לבנות מוקדמת כדי photoactivation עם המתוקן האדום-כדי-הירוק-היחס (RtoGrקור ). אניRed_expected = (IGreen_measured – B1) * RtoGrקור הערה: כפי שצוין לעיל, בהירות המולקולרי תמיד ב- FP, את photoactivatable FP יהיה שונה. לקבלת מידע נוסף כיצד להסביר הבדלים אלה, ראה דיון.</li>
	<li>לחשב את היעילות photoactivation הרשות הפלסטינית-שרי כשבר של פלואורסצנטי אדום נמדד בעוצמה photoactivation לאחר לבין עוצמת קרינה פלואורסצנטית הצפוי ב ערוץ הצבע האדום. (Fהרשות הפלסטינית-שרי) = (אניRed_measured – B2) / אניRed_expected
</li>
	<li>להשתמש את הרשות הפלסטינית-GFP – לבנות דובדבן כדי להעריך את השבר של photoactivated הרשות הפלסטינית-GFP. לקבוע את עוצמת קרינה פלואורסצנטית הצפוי של הרשות הפלסטינית-GFP על-ידי חלוקת העוצמה נמדד פלואורסצנטי אדום של הרשות הפלסטינית-GFP – דובדבן לבנות מוקדמת כדי photoactivation על ידי האדום-כדי-הירוק-היחס (RtoGr). . הנה, RtoGr אינו צריך יתוקן עבור התורם שכבתה, כי ה-GFP, הרשות הפלסטינית-GFP כפופים התורם להרוות את אותה כמות. אניGreen_expected = (אניRed_measured – B2) / RtoGr</li>
	<li>לחשב את היעילות photoactivation הרשות הפלסטינית-GFP כשבר של זריחה ירוק נמדד בעוצמה photoactivation לאחר לבין עוצמת קרינה פלואורסצנטית הצפוי לערוץ הצבע הירוק. (Fהרשות הפלסטינית-GFP) = (אניGreen_measured – B1) / אניGreen_expected
</li>
</ol>

<ol><li>Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photoactivatable+GFP+for+selective+photolabeling+of+proteins+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells.</a> Science. 297 (5588), 1873-1877 (2002).</li>
<li>Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optical+marker+based+on+the+UV-induced+green-to-red+photoconversion+of+a+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (20), 12651-12656 (2002).</li>
<li>Renz, M., Lippincott-Schwartz, J. Ch. 9. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRenz%2C+M+%22The+Fluorescent+Protein+Revolution+Series+in+Cellular+and+Clinical+Imaging%22">The Fluorescent Protein Revolution Series in Cellular and Clinical Imaging</a>. Day, R. N., Davidson, M. W. , CRC Press. 201-228 (2014).</li>
<li>Shcherbakova, D. M., Sengupta, P., Lippincott-Schwartz, J., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photocontrollable+fluorescent+proteins+for+superresolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Photocontrollable fluorescent proteins for superresolution imaging.</a> Annual Review of Biophysics. , 303-329 (2014).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li>
<li>Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophysical Journal. 91 (11), 4258-4272 (2006).</li>
<li>Henderson, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+mechanism+of+the+photoactivatable+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Structure and mechanism of the photoactivatable green fluorescent protein.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (12), 4176-4177 (2009).</li>
<li>Subach, F. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivation+mechanism+of+PAmCherry+based+on+crystal+structures+of+the+protein+in+the+dark+and+fluorescent+states%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Photoactivation mechanism of PAmCherry based on crystal structures of the protein in the dark and fluorescent states.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21097-21102 (2009).</li>
<li>Wiedenmann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EosFP%2C+a+fluorescent+marker+protein+with+UV-inducible+green-to-red+fluorescence+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (45), 15905-15910 (2004).</li>
<li>Habuchi, S., Tsutsui, H., Kochaniak, A. B., Miyawaki, A., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mKikGR%2C+a+monomeric+photoswitchable+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein.</a> PLoS One. 3 (12), e3944(2008).</li>
<li>McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bright+and+photostable+photoconvertible+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein.</a> Nature Methods. 6 (2), 131-133 (2009).</li>
<li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+monomeric+red%2C+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).</li>
<li>Subach, F. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivatable+mCherry+for+high-resolution+two-color+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy.</a> Nature Methods. 6 (2), 153-159 (2009).</li>
<li>Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partitioning+of+lipid-modified+monomeric+GFPs+into+membrane+microdomains+of+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells.</a> Science. 296 (5569), 913-916 (2002).</li>
<li>Slocum, J. D., Webb, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Double+Decarboxylation+in+Superfolder+Green+Fluorescent+Protein+Leads+to+High+Contrast+Photoactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physical+Chemistry+Letters%22%5BJournal%5D)">A Double Decarboxylation in Superfolder Green Fluorescent Protein Leads to High Contrast Photoactivation.</a> Journal of Physical Chemistry Letters. 8 (13), 2862-2868 (2017).</li>
<li>Subach, F. V., Patterson, G. H., Renz, M., Lippincott-Schwartz, J., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bright+monomeric+photoactivatable+red+fluorescent+protein+for+two-color+super-resolution+sptPALM+of+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Bright monomeric photoactivatable red fluorescent protein for two-color super-resolution sptPALM of live cells.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (18), 6481-6491 (2010).</li>
<li>Renz, M., Wunder, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internal+rulers+to+assess+fluorescent+protein+photoactivation+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Internal rulers to assess fluorescent protein photoactivation efficiency.</a> Cytometry A. , (2017).</li>
<li>Renz, M., Daniels, B. R., Vamosi, G., Arias, I. M., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+the+asialoglycoprotein+receptor+deciphered+by+ensemble+FRET+imaging+and+single-molecule+counting+PALM+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Plasticity of the asialoglycoprotein receptor deciphered by ensemble FRET imaging and single-molecule counting PALM imaging.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (44), E2989-E2997 (2012).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

עד כה, אין שיטה קיימת כדי לקבוע בצובר השבר של הרשות הפלסטינית-FPs לידי ביטוי תאים חיים זה photoactivated להיות פלורסנט. פרוטוקול שהוצגו ניתן לכל זוג חלבון פלואורסצנטי spectrally נפרדים. בעוד ביטוי כאן עבור הפיכה הרשות הפלסטינית-FPs-GFP, הרשות הפלסטינית-שרי, גישה זו היא עקרונית החלים photoconvertible חלבונים גם כן. החלבון הניאון ברורים spectrally, עם זאת, יש לבחור בקפידה כדי למזער חפיפה ספקטרלי בהתחשב בעובדה photoconvertible חלבונים פלורסנט משמרת את ספיגת ואת ספקטרום הפליטה, למשל מירוק כדי פלואורסצנטי אדום.
<...

בשנת 2002, תוארו של photoactivatable בהרחבה ישים הראשון (PA-GFP1), photoconvertible (קאךה2) חלבונים פלורסנט. אלו חלבונים פלורסנט אופטי סימון לשנות תכונות ספקטרליות שלהם על הקרנה עם אור UV, קרי, הם הופכים בהירים (חלבונים פלורסנט photoactivatable, קרי, הרשות הפלסטינית-FPs), או לשנות את צבעם (photoconvertible FPs). עד כה, הפיך ובלתי הפיכה photoactivatable ו- photoconvertible פלורסנט חלבונים שונים כבר פיתח3,4. במחקרים אנסמבל או בכמות גדולה, עטי סימון אופטיים שימשו כדי ללמוד את הדינמיקה של תאים שלמים או חלבונים, הקישוריות של תאים subcellular. יתר על כן, עטי סימון אופטי התומך יחיד מולקולה מבוססת superresolution הדמיה טכניקות כגון PALM5 ו FPALM6.
למרות מעבד צילוםכימי במהלך photoactivation או - המרה תוארו עבור רבים עטי סימון אופטי, אפילו לחקר הגבישים מבנים לפני ואחרי photoactivation / - המרה נעשו זמינים7 , 8, המנגנון הבסיסי שלהפיזי צילום של photoactivation והמרה אינה מובנת לחלוטין. יתר על כן, עד כה הערכות גולמי בלבד קיים ליעילות של photoactivation והמרה, כלומר, השבר של חלבונים פלורסנט הביע זה בעצם photoconverted או photoactivated להיות פלורסנט. מחקרים במבחנה אנסמבל דווחו לכימות המשמרת ב ספקטרום בליעה ואת מידת מקורי ומופעל חלבון10,9,ג'ל11.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול מעורבים חלבון פלואורסצנטי כימרות כדי להעריך את השבר של photoactivated פלורסנט חלבונים בכמות גדולה, תאים חיים. בכל פעם עובד עם חלבונים פלורסנט מקודדים גנטית, כמות החלבונים הביע מוחלט משתנה מתא לתא, אינו ידוע. אם תא אחד לבטא של הרשות הפלסטינית-FP מראה אות בהיר יותר לאחר photoactivation מאשר תא אחר, זה לא יכול להיות מבודלים אם האות בהיר הזה הוא ביטוי גבוה יותר של הרשות הפלסטינית-FP או של photoactivation יעיל יותר של הרשות הפלסטינית-FP. כדי לתקנן את רמת הביטוי בתאים, אנחנו מציגים פנימי שליטי גנטית בשילוב חלבונים פלורסנט spectrally נפרדים. זיווגו המידע הגנטי של חלבון פלואורסצנטי photoactivatable spectrally ברורים תמיד בפלורסנט חלבונים, סרגלים פנימי נוצרים זה עדיין יתבטא לסכום הכולל אינו ידוע אך בכמות היחסית קבועים וידועים של ציור אסטרטגיה זו מאפשרת אפיון שונה אור UV photoactivation מזימות, קרי, כמותיים להערכת הכמות היחסית של הרשות הפלסטינית-FPs זה יכול להיות photoactivated עם מצבים שונים של photoactivation, ובכך מאפשרת כדי להגדיר ערכות photoactivation יעילים יותר מאחרים. יתר על כן, אסטרטגיה זו מאפשרת באופן עקרוני את ההערכה של כימות מוחלטת של השבר photoactivated הרשות הפלסטינית-FP. לשם כך, חשוב להבין כי המחקרים שהוצגו אנסמבל הם מבוססי-עוצמת שעושה הניתוח מורכב יותר בהתאם לפריסתו של פרוטוקול זה. פרמטרים לקביעת את עוצמת פלורסנט נמדד, קרי, בהירות מולקולרי שונה, ספיגת, ספקטרום הפליטה ואפקטים סריג, צריכים לקחת בחשבון כאשר משווים עוצמות קרינה פלואורסצנטית של חלבונים שונה פלורסנט.
רציומטרי הציג המבוסס על עוצמת כימות של יעילות photoactivation הוא דוגמה עבור הרשות הפלסטינית-GFP והרשות הפלסטינית-שרי בתאים חיים, אבל הוא ישים באופן כללי עקרוני והוא יכול לשמש עבור כל חלבון פלואורסצנטי photoactivatable בשום תנאי הניסוי.

<table><tbody><tr><td>pEGFP-N1 וקטור ביטוי תאי יונקים</td><td>Clontech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM עם פנול אדום</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11054020</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין עם פנול אדום</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין (200 מ"מ)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>תאים 8 בארות LabTek #1.0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12565470</td><td></td></tr><tr><td>Fugene 6</td><td>Promega</td><td>E2691</td><td></td></tr></tbody></table>

כיצד ניתן לכמת את השבר של photoactivated פלורסנט חלבונים בכמות גדולה, תאים חיים

How to Quantify the Fraction of Photoactivated Fluorescent Proteins in Bulk and in Live Cells

Photoactivatable וחלבונים - להמרה פלורסנט (PA-FPs) שימשו פלורסצנטיות לחיות תאים במיקרוסקופ לניתוח את הדינמיקה של תאים, חלבון הרכבים. עד כה, אין שיטה כבר זמין לכמת בצובר, שידור חי תאי ביטא כמה של הרשות הפלסטינית-FPs הם photoactivated כדי לזרוח.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול מעורבים סרגלים הפנימי, קרי, גנטית בשילוב חלבונים פלורסנט ברורים spectrally (photoactivatable), כדי ratiometrically לכמת את השבר של כל הרשות הפלסטינית-FPs הביע בתא אינם כבויים. פלורסנט. באמצעות פרוטוקול זה, נראה כי מצבים שונים של photoactivation הניבו היעילות photoactivation שונים. Photoactivation ובעוצמת קצר עם לייזר קונפוקלי סורק מיקרוסקופ (CLSM) הביא עד ארבע פעמים photoactivation ליעילות נמוכה יותר מאות חשיפות נמוכה שהוחלו על-ידי CLSM או דופק קצר שהוחלו על-ידי תאורה widefield. בעוד יש כבר ביטוי בפרוטוקול כאן (נולד ב- PA) GFP, (נולד ב- PA) שרי, זה באופן עקרוני ניתן להחיל לכל זוג חלבון פלואורסצנטי נפרדים spectrally של photoactivatable או photoconvertible, כל הגדרת ניסיוני.

פרוטוקול המוצגת כאן מראה כימות רציומטרי של השבר של חלבונים פלורסנט כי הם photoactivated להיות פלורסנט (איור 1). שבר זה שונה בהתאם למצב של photoactivation.
תוצאה באמצעות photoactivation ובעוצמת זמן קצר עם לייזר קונפוקלי סורק מיקרוסקופ (CLSM) מוצג באיור 2 c. לאחר titrating את עוצמת הלייזר כפי שהיא נמדדת בעדשה המטרה פיקסל להתעכב זמן שידור ATOF, יעילות מקסימלית photoactivat...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול זה כרוך photoactivatable spectrally שונות גנטית בשילוב וחלבונים פלורסנט. אלה היו חלבון פלואורסצנטי היתר כימות של השבר הרשות הפלסטינית-FP זה photoactivated להיות פלורסנט, קרי, את יעילות photoactivation. הפרוטוקול מגלה כי מצבים שונים של photoactivation תשואה היעילות photoactivation שונים.

כיצד ניתן לכמת את השבר של Photoactivated פלורסנט חלבונים בכמות גדולה, תאים חיים

Photoactivatable and -convertible fluorescent proteins (PA-FPs) have been used in fluorescence live-cell microscopy for analyzing the dynamics of cells ...

אנו מציגים כאן פרוטוקול הכולל חלבונים מובחנים מבחינה גנטית הניתנים להפעלה באמצעות פוטו ופלורסנט. שליטים פנימיים אלה מאפשרים לכמת את שבר ה-PAFP המופעל באמצעות תמונה כדי להיות פלואורסצנטי. עד כה, לא הייתה שיטה זמינה לכמת בכמויות גדולות בתאי החיים כמה מה-PAFP המובעים הם תמונה המופעלת ל פלואורסצנטיה. הכימות המוצג של יעילות הפעלת תמונות בא לידי ביטוי עבור PA-GFP ו- PA Cherry בתאים חיים, אך הוא ישים באופן עקרוני וניתן להשתמש בו עבור כל חלבון פלואורסצנטי הניתן להפעלה פוטו בכל תנאי ניסיוני. בכל פעם עבודה עם חלבונים פלואורסצנטיים מקודדים גנטית, הכמות המוחלטת של חלבונים לידי ביטוי משתנה מתא לתא וזה לא ידוע. כדי לתקנן את הביטוי בין התאים, אנו מציגים סרגלים פנימיים של חלבונים פלואורסצנטיים מובחנים מבחינה גנטית. על ידי צימוד המידע הגנטי של חלבון פלורסנט הניתן להפעלה פוטו לנבדל ספקטרלי תמיד על סרגלים פנימיים של חלבון פלואורסצנטי נוצרים שעדיין יבואו לידי ביטוי בכמות כוללת לא ידועה אך בכמות יחסית ידועה קבועה של אחד לאחד. כדי להתחיל לבנות את הפלסמידים כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. כמו כן, תרבות בקו התא הסטנדרטי במדיום הפרספקטיבה שלה באמצעות הגרסה פנול אדום חינם. כאשר מוכן להתחיל את הניסוי, לקצור את התאים באמצעות טריפסין ללא פנול אדום כדי להפחית את הפלורציה ברקע. לאחר הקציר, למלא פיפטה 2 מ"ל עם ההשעיה התא מתרבות תאים confluent גדל בבקבוק תרבות תא T 12.5. הוסף טיפה אחת לכל תא של מגלשת זכוכית תאית שמונה. הדגירה את השקופית בתנאי תרבות תאים סטנדרטיים במשך 24 שעות. לאחר מכן, התפנית הבאה תדביק את התאים באמצעות רייגנטים מסחריים בהתאם לפרוטוקול המפיצים. להדביק את התאים עם דובדבן GFP, PA-GFP דובדבן ו GFPPA שרי כימרות. לאחר מכן החזירו את התאים לחממה כדי לאפשר ביטוי חלבון, קיפול והתבגרות. לאחר 20 שעות לאחר ההתמזגות, העבירו את התאים לשלב של מיקרוסקופ פלורסנטי קונפוקאלי המצויד בתא הסביבתי הלח והחומם שהתחמם מראש ל-37

how-to-quantify-fraction-photoactivated-fluorescent-proteins-bulk

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

פרוטוקול זה מתאר גישה כללית לבצע photoconversion של חלבוני ניאון על מיקרוסקופ סורק לייזר confocal. אנו מתארים נהלים photoconversion של דגימות חלבון puried, כמו גם עבור dual-בדיקה אופטי הדגשת בתאים חיים עם mOrange2 ו Dronpa.

Photoconversion של חלבונים מטוהרים פלורסנט ו Dual-בדיקה אופטי סימון בתאים חיים

פרוטוקול זה מתאר כיצד חלבונים תמונה אינטראקציות באמצעות assay סריג מבוססי הקרבה.

הדמיה חלבונים אינטראקציות In vivo</em

על ידי שימוש לפתור spectrally שני הפוטונים מערכת הדמיה מיקרוסקופית, פיקסל ברמה מפות של העברת אנרגיה תהודה פורסטר (סריג) יעילות מתקבלים עבור תאים להביע את קולטני קרום השערה כדי ליצור הומו-oligomeric קומפלקסים. מן סריג מפות יעילות, אנו מסוגלים להעריך מידע stoichiometric על המתחם oligomer תחת מחקר.

ב כימות vivo של G מצמידים חלבון קולטן אינטראקציות באמצעות נפתר Spectrally שני פוטון מיקרוסקופית

מחקרים של ביומולקולות in vivo חיוניים להבנת תפקוד מולקולרי בהקשר ביולוגי. כאן אנו מתארים שיטה חדשה המאפשרת הפנמה של ביומולקולות פלואורסצנטיות, כגון DNA או חלבונים, למיקרואורגניזמים חיים. ניתוח נתונים in vivo שנרשמו על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מוצג ונדון גם כן.

הפנמה והתבוננות של פלורסנט מולקולות ביולוגיים במיקרואורגניזמים שחיים דרך Electroporation

כימות מדויק של אירועי סחר בשלפוחית מספק לעתים קרובות תובנות מפתח לגבי תפקידים של חלבונים ספציפיים והשפעות של מוטציות. מאמר זה מציג שיטות לשימוש ב-pHluorin סופר-אקליפטי, וריאנט GFP רגיש ל-pH, ככלי לכימות אירועים אנדוציטיים בתאים חיים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי כמותי וציטומטריית זרימה.

יישומים של pHluorin עבור כמותי, קינטי וניתוח תפוקה גבוהה של אנדוציטוזה שמרים הנצה

תיוג תחום תאי של חלבון הממברנה עם fluorophore pH רגיש, superecliptic pHluorin (ספטמבר), מאפשר לוקליזציה, ביטוי subcellular, וסחר שייקבע. הדמיה ספטמבר- שכותרתו חלבונים עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי השתקפות פנימית מוחלטת (TIRFM) מאפשרת כימות של רמות חלבון בקרום ER ו פלזמה הפריפריה.

ניצול רצפטורים-tagged pHluorin לפקח subcellular לוקליזציה וסחר

כתב יד זה מתאר שיטה כדי להמחיש ולכמת תרגום לשפות אחרות אירועים בתאים subcellular. הגישה המוצעת כתב יד זה דורש מערכת הדמיה קונאפוקלית בסיסית, ריאגנטים, והוא מהיר וחסכוני.

Immunofluorescence כמותי מודדים הגלובלי לשפות אחרות תרגום

נתאר כמה מיקרו - photomanipulation טכניקות כגון FRAP photoactivation לאפשר קביעת פרמטרים תנועתיות ואת הדינמיקות ייתכן של חלבונים בתוך מעביר תאים. ניסיוני הקריאות הבאות כוללות דינמיקה subcellular מחזור של הרגולטורים תנועתיות או של שלד התא המשמש כבסיס של אקטין.

בטכניקות המיקרומניפולציה המאפשר ניתוח של דינמיקה Morphogenetic מחזור של הרגולטורים Cytoskeletal

Efferocytosis, הסרת phagocytic בתאים אפופטוטיים להיפגע, הוא נדרש כדי לשמור על הומאוסטזיס, בהנחייתם של רצפטורים, איתות המסלולים המאפשרים זיהוי, היבלעות של הפנמה של מוות תאים. במסמך זה, אנו מציגים מיקרוסקופ פלורסצנטיות פרוטוקול עבור כימות של efferocytosis וכן את פעילותם של efferocytic איתות המסלולים.

כימות של Efferocytosis על-ידי קרינה פלואורסצנטית תא בודד מיקרוסקופ

פרוטוקול זה מתאר פלורסצנטיות תנודות מבוסס-ספקטרוסקופיה בגישה לחקור אינטראקציות בין חלבונים מתווכים תא-תא אינטראקציות, כלומר חלבונים מותאם צמתי תא, ישירות בתאים חיים. אנו מספקים הנחיות מפורט על מכשיר כיול, חדרי קירור והקפאה, ניתוח, כולל תיקונים למקורות אפשריים החפץ.

Assay ספקטרוסקופיה התנודות זריחה של אינטראקציות חלבון-חלבון באנשי קשר תא-תא

Förster Resonance Energy Transfer (FRET) בין שתי מולקולות פלואורופור יכול לשמש לחקר אינטראקציות חלבונים בתא החי. כאן, פרוטוקול מסופק כיצד למדוד FRET בתאים חיים על ידי זיהוי פליטה רגישה של המקבל ומרווה של מולקולת התורם באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי.

הערכת אינטראקציות חלבונים בתאים חיים עם פליטה רגישה ל-FRET

למדו פרוטוקול לכימות יעילות הפעלת אור של חלבונים פלורסנטיים בתאים חיים באמצעות שילוב גנטי של חלבונים ספקטרליים שונים. השיטה מאפשרת השוואת מצבי הפעלה שונים ושיפור מחקרים בנוירומדע וביולוגיה תאית.

כיצד ניתן לכמת את השבר של Photoactivated פלורסנט חלבונים בכמות גדולה, תאים חיים

גלה סרטונים נוספים