Name: שחזור Biocytin, שחזורים תלת-ממד של CA2 בהיפוקמפוס מלא Interneurons (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-20T14:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 21 s
Description: חקור שחזור תלת-ממדי של נוירוני CA2 בהיפוקמפוס באמצעות רקורדינג אלקטרופיזיולוגי ואימונופלואורסצנציה. פרוטוקול זה מאפשר אפיון תכונות נוירונליות ולימוד מעגלים קורטיקליים בפרטים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה קיבל מימון לבין המועצה למחקר רפואי מוענק פרופ אלכס תומסון, ביוטכנולוגיה, מחקר מדעי הביולוגיה המועצה (BBSRC-BB/G008639-1), החברה פיזיולוגיים, האיחוד האירופי של נוברטיס פארמה (באזל) אופק 2020 תכנית המסגרת עבור מחקר וחדשנות מתחת לנתיב הסכם ספציפי גרנט 720270 (המוח האנושי פרוייקט SGA1) ותחת לנתיב הסכם ספציפי גרנט 785907 (SGA2 פרוייקט מהמוח האנושי). אנו מודים מאוד על פרופסור אלכס תומסון עבור הגדרת פרוטוקול אזורים קורטיקליים אחרים, הבטחת המימון, תמיכה שוטפת שלה עבור פרוייקט זה. התרומות שנעשו על ידי המעבדה-חברים אשר עזר אופטימיזציה פרוטוקול השחזור, שיחזר CA2 neurones הם בתודה הודה: ג'יי Deuchars, ה Pawelzik, ד א יוז, בניסטר עמ' א, ק Eastlake, Trigg ה, ש א Botcher.

<ol><li>Klausberger, T., Somogyi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+diversity+and+temporal+dynamics%3A+the+unity+of+hippocampal+circuit+operations%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations.</a> Science. 321, 53-57 (2008).</li>
<li>DeFelipe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+classification+and+nomenclature+of+cortical+GABAergic+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons.</a> Nature Reviews Neuroscience. 14 (3), 202-216 (2013).</li>
<li>Bezaire, M. J., Soltesz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+CA1+local+circuits%3A+knowledge+base+for+interneuron-pyramidal+cell+connectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of CA1 local circuits: knowledge base for interneuron-pyramidal cell connectivity.</a> Hippocampus. 23, 751-785 (2013).</li>
<li>Katona, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavior-dependent+activity+patterns+of+GABAergic+long-range+projecting+neurons+in+the+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Behavior-dependent activity patterns of GABAergic long-range projecting neurons in the rat hippocampus.</a> Hippocampus. 27, 359-377 (2017).</li>
<li>Ali, A. B., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facilitating+pyramid+to+horizontal+oriens-alveus+interneurone+inputs%3A+dual+intracellular+recordings+in+slices+of+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Facilitating pyramid to horizontal oriens-alveus interneurone inputs: dual intracellular recordings in slices of rat hippocampus.</a> Journal of Physiology. 507, 185-199 (1998).</li>
<li>Ali, A. B., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+alpha+5+subunit-containing+GABAA+receptors+mediate+IPSPs+elicited+by+dendrite-preferring+cells+in+rat+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Synaptic alpha 5 subunit-containing GABAA receptors mediate IPSPs elicited by dendrite-preferring cells in rat neocortex.</a> Cerebral Cortex. 18, 1260-1271 (2008).</li>
<li>Ali, A. B., Bannister, A. P., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+correlations+between+action+potential+duration+and+the+properties+of+synaptic+connections+in+layer+4+interneurones+in+neocortical+slices+from+juvenile+rats+and+adult+rat+and+cat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Robust correlations between action potential duration and the properties of synaptic connections in layer 4 interneurones in neocortical slices from juvenile rats and adult rat and cat.</a> Journal of Physiology. 580, 149-169 (2007).</li>
<li>Pawelzik, H., Bannister, A. P., Deuchars, J., Ilia, M., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+bistratified+cell+IPSPs+and+basket+cell+IPSPs+by+pentobarbitone+sodium%2C+diazepam+and+Zn2%2B%3A+dual+recordings+in+slices+of+adult+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modulation of bistratified cell IPSPs and basket cell IPSPs by pentobarbitone sodium, diazepam and Zn2+: dual recordings in slices of adult rat hippocampus.</a> European Journal of Neuroscience. 11, 3552-3564 (1999).</li>
<li>Pawelzik, H., Hughes, D. I., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4176080/">Physiological and morphological diversity of immunocytochemically defined parvalbumin-and cholecystokinin-positive interneurones in CA1 of the adult rat hippocampus.</a> Journal of Comparative Neurology. 443, 346-367 (2002).</li>
<li>Thomson, A. M., Lamy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+maps+of+neocortical+local+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Functional maps of neocortical local circuitry.</a> Frontiers of Neuroscience. 1, 19-42 (2007).</li>
<li>Kepecs, A., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interneuron+cell+types+are+fit+to+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interneuron cell types are fit to function.</a> Nature. 505 (7483), 318-326 (2014).</li>
<li>Wilent, W. B., Nitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discrete+Place+Fields+of+Hippocampal+Formation+Interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Discrete Place Fields of Hippocampal Formation Interneurons.</a> Journal of Neurophysiology. 97, 4152-4161 (2007).</li>
<li>Hirsch, J. A., Martinez, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminar+processing+in+the+visual+cortical+column%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Laminar processing in the visual cortical column.</a> Current Opinion in Neurobiology. 16 (4), 377-384 (2006).</li>
<li>Kay, K., Sosa, M., Chung, J. E., Karlsson, M. P., Larkin, M. C., Frank, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hippocampal+network+for+spatial+coding+during+immobility+and+sleep%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A hippocampal network for spatial coding during immobility and sleep.</a> Nature. 531, 185-190 (2016).</li>
<li>Yu, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+hippocampal-cortical+memory+representations+for+experiences+associated+with+movement+versus+immobility%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Distinct hippocampal-cortical memory representations for experiences associated with movement versus immobility.</a> eLife. 6, e27621(2017).</li>
<li>Markram, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+and+Simulation+of+Neocortical+Microcircuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Reconstruction and Simulation of Neocortical Microcircuitry.</a> Cell. 163, 456-492 (2015).</li>
<li>Van Geit, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BluePyOpt%3A+Leveraging+Open+Source+Software+and+Cloud+Infrastructure+to+Optimise+Model+Parameters+in+Neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroinformatics%22%5BJournal%5D)">BluePyOpt: Leveraging Open Source Software and Cloud Infrastructure to Optimise Model Parameters in Neuroscience.</a> Frontiers in Neuroinformatics. 10, 17(2016).</li>
<li>Gal, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rich+cell-type-specific+network+topology+in+neocortical+microcircuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Rich cell-type-specific network topology in neocortical microcircuitry.</a> Nature Neuroscience. 20, 1004-1013 (2017).</li>
<li>Thomson, A. M., West, D. C., Wang, Y., Bannister, A. P. <a target="_blank" href="https://academic.oup.com/cercor/article/12/9/936/383201">Synaptic connections and small circuits involving excitatory and inhibitory neurons in layers 2-5 of adult rat and cat neocortex: triple intracellular recordings and biocytin labeling in vitro.</a> Cerebral Cortex. 12, 936-953 (2002).</li>
<li>Mercer, A., West, D. C., Morris, O. T., Kirchhecker, S., Kerkhoff, J. E., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitatory+connections+made+by+presynaptic+cortico-cortical+pyramidal+cells+in+layer+6+of+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Excitatory connections made by presynaptic cortico-cortical pyramidal cells in layer 6 of the neocortex.</a> Cerebral Cortex. 15, 1485-1496 (2005).</li>
<li>West, D. C., Mercer, A., Kirchhecker, S., Morris, O. T., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Layer+6+cortico-thalamic+pyramidal+cells+preferentially+innervate+interneurons+and+generate+facilitating+EPSPs%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Layer 6 cortico-thalamic pyramidal cells preferentially innervate interneurons and generate facilitating EPSPs.</a> Cerebral Cortex. 16, 200-211 (2006).</li>
<li>Bannister, A. P., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+properties+of+excitatory+synaptic+connections+involving+layer+4+pyramidal+cells+in+adult+rat+and+cat+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Dynamic properties of excitatory synaptic connections involving layer 4 pyramidal cells in adult rat and cat neocortex.</a> Cerebral Cortex. 17, 2190-2203 (2007).</li>
<li>Mercer, A., Trigg, H. L., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+neurons+in+the+CA2+subfield+of+the+adult+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Characterization of neurons in the CA2 subfield of the adult rat hippocampus.</a> Journal of Neuroscience. 27 (7), 7329-7338 (2007).</li>
<li>Mercer, A., Eastlake, K., Trigg, H. L., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+circuitry+involving+parvalbumin-positive+basket+cells+in+the+CA2+region+of+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Local circuitry involving parvalbumin-positive basket cells in the CA2 region of the hippocampus.</a> Hippocampus. 22 (1), 43-56 (2012).</li>
<li>Mercer, A., Botcher, N. A., Eastlake, K., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SP-SR+interneurones%3A+a+novel+class+of+neurones+of+the+CA2+region+of+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">SP-SR interneurones: a novel class of neurones of the CA2 region of the hippocampus.</a> Hippocampus. 22 (8), 1758-1769 (2012).</li>
<li>Sabatini, D. D., Bensch, K., Barrnett, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochemistry+and+electron+microscopy%3A+The+Preservation+of+Cellular+Ultrastructure+and+Enzymatic+Activity+by+Aldehyde+Fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cytochemistry and electron microscopy: The Preservation of Cellular Ultrastructure and Enzymatic Activity by Aldehyde Fixation.</a> Journal of Cell Biology. 17, 19-58 (1963).</li>
<li>Somogyi, P., Takagi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+note+on+the+use+of+picric+acid-paraformaldehyde-glutaraldehyde+fixative+for+correlated+light+and+electron+microscopic+immunocytochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A note on the use of picric acid-paraformaldehyde-glutaraldehyde fixative for correlated light and electron microscopic immunocytochemistry.</a> Neuroscience. 7, 1779-1783 (1982).</li>
<li>Hughes, D. I., Bannister, A. P., Pawelzik, H., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+immunofluorescence%2C+peroxidase+labelling+and+ultrastructural+analysis+of+interneurones+following+prolonged+electrophysiological+recordings+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Double immunofluorescence, peroxidase labelling and ultrastructural analysis of interneurones following prolonged electrophysiological recordings in vitro.</a> Journal of Neuroscience Methods. 101, 107-116 (2000).</li>
<li>Botcher, N. A., Falck, J. E., Thomson, A. M., Mercer, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4176080/">Distributions of interneurones in the CA2 region of the rat hippocampus.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 8, 104(2014).</li>
<li>Mercer, A., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cornu+Ammonis+Regions-Antecedents+of+Cortical+Layers%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Cornu Ammonis Regions-Antecedents of Cortical Layers?</a> Frontiers in Neuroanatomy. 11, 83(2017).</li>
<li>Blackman, A. V., Grabuschnig, S., Legenstein, R., Sjöström, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+manual+neuronal+reconstruction+from+biocytin+histology+or+2-photon+imaging%3A+morphometry+and+computer+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">A comparison of manual neuronal reconstruction from biocytin histology or 2-photon imaging: morphometry and computer modeling.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 8, 65(2014).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

הקלטות אלקטרופיזיולוגיות במבחנה (איור 1 Ac,d ו- לפנה ס, d) בשילוב עם פתולוגיה ולהפעיל הליכים immunohistochemical את תאור מפורט, סידן מחייב חלבון תוכן, זהותו של interneurons קורטיקלית למבוגרים הקליט להתגלות. באזור CA2, טכניקה זו אפשרה את חקר המעגלים המקומיות בפעם הראשונה וגילה מחלקות של interneurons זה היה לא תוארה בעבר CA1 או CA3: תאים דנדריטים של עצב ארבור סל (איור 1B), bistratified התאים, SP-SR interneurons.
הפרוטוקול המתואר כאן מוטבה כדי לשמר את ultrastructure של הנוירונים ולקבל להתאוששות מצוין (כולל הדנדריטים) וגם ובשבילים עצב. שלבים קריטיים כוללת את השימוש בטכניקה קיבוע כפול כדי לשפר את הניגודיות של מיקרוסקופ אור26 ותוספת של פתרון גלוטראלדהיד וחומצה picric הפתרון מקבע נוגדן חדירה לשפר ולשמר את עצביים ultrastructure27. הקפאת עדין-הפשרה permeabilization נותן יותר לשימור המבנה הדק, בעוד osmication והטבעה שרף להפחית את מטוס ה-z הצטמקות28. בנוסף, החזיית מאוד ומבנים (בסדר אקסונים עם קטן עם העיתון ons לדוגמה) משופרת על ידי המקננת הסעיפים עם2O H2 ו- NaBH4 כדי להפחית את הרקע מכתים. ניתן להגדיל חדות גם עם התוספת של NiCl2 כדי התגובה HRP.
ההליך היסטולוגית מפורט כאן מציע תוצאות מצוינות מבחינת הפארמצבטית ואמינות. עם זאת, משך הזמן של ההקלטות אלקטרופיזיולוגיות יקבע את האיכות של כתמים, עם הקלטות קצר בדרך כלל מקושר עם צביעת עצב המסכן biocytin/קרינה פלואורסצנטית. הבחירה של הקלטה פרוטוקולים (הקלטות תאיים באמצעות אלקטרודות חדה לעומת תאים כל תיקון מחבר חובק למעקה) עשויים להשפיע גם biocytin השמירה ושימור אנטומיה משובחים.
למרות הקשיים נתקל שימור המבנה הדק במהלך עיבוד היסטולוגית המתוארים כאן, לוקחים את הזמן כדי לשחזר בהגדלה X 100 (1-4weeks בהתאם למורכבות האקסון) יתקבלו בברכה, ששיטה זו מאפשרת ייצוג מדויק של קטרים דנדריטים, עצב. השימוש פחות פרוטוקולים בדרישה לחשוף biocytin labelling הוא מובן, עם זאת, אלה לעיתים קרובות למנוע חזותי ברור של ענפי עצב בסדר. דטרגנטים, כדי לקדם את כניסת אבידין-HRP כדי לחשוף את biocytin ואת נוגדנים, נדרשים לעיתים קרובות בסעיפים עבה, אך יכול לשבש את המבנה הדק. מדעני מוח חיפוש ללא הרף לשיטות שחזור אוטומטי, אבל, עכשיו ולעולם אקסונים במיוחד, biocytin-HRP עם שחזור ידני נשאר תקן הזהב31.
מאוד מפורט שחזורים עצביים, במיוחד מדויק ציורים של עצב עם העיתון ons, צמתים, נוכחות או היעדרות של מיאלין, באופן כללי יותר הציור של ארבור עצב מלאה, עם ייצוג מדויק קוטר האקסון משתנה לאורך שלה אורך, לספק מידע לצורך זיהוי מדויק של סוג ייחודי של interneurone נוסף. למרות interneurons רבים עשויים לא להתאים בדיוק לתוך מחלקה מסוימת, בטכניקה המתוארת לעיל מספקת נתונים מתואם על מאפייני אלקטרופיזיולוגיות עצביים, פלסטיות לטווח קצר המשויך סוג ספציפי של חיבור ומפורט שחזורים עצביים, המאפשר את דיאגרמת החיווט, באזור CA2, לדוגמה, שילמדו בפירוט.
בסדר, מפורט מבנה היא פשוטה יותר לעיתים קרובות במודלים חישובית. בעוד מובן, התוצאה האובדן של מידע שיכול להוכיח הקריטי בעתיד. ניתוח של נתונים היסטוריים שחזורים תלת-ממד עם נתונים מקבילים סינפטית תאפשר התוספת של עוד קריטריונים לסיווג interneuronal. נתונים יכול להיות שהופקדו מאגרים ציבוריים ואת בשימוש על ידי בוני הדגמים לחקור את התוצאה של שינויים סדיר קוטר האקסון myelination על פוטנציאל הפעולה הפצת שהמפתחות.

קליפת ההיפוקמפוס הם מבנים של מורכבות כאלה כי הסיווג של עצביים תת1,2,3,4, מפות של הקשרים ביניהם5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 איך המעגלים הזה תומך תפקודים קוגניטיביים12,13,14,15 נמצאים עדיין בשלבי מחקר אינטנסיבי, הנושא של הדיון המתמשך. לדוגמה, כדי להבין את הפרטים ואת המורכבות של המעגלים וכדי לתאם והנתונים שהתקבלו ממחקרים שונים רבים, זה עוזר מאוד שתוכל להגדיר ולתאר את הרכיבים, אבל זה נשאר עניין לדיון כמה שונים סוגי נוירונים קיימים, או אפילו האם זה אפשרי להגדיר את כל הנוירונים כשייך מחלקה מסוימת. כלים חישוביים זה ניתן לבנות ולבדוק מעגלים עם דרגות שונות של מורכבות מתבצעת מפותחת16,17,18, אבל מרכזי במאמצים אלה הוא הצורך ללימודי מפורט הסוגים התא ואת המאפיינים של הקשרים ביניהם. כמות גדולה של מידע על המעגלים המקומיות של קליפת של עכברים בוגרים שכבר נאסף באמצעות הפרוטוקול המתוארים כאן10,19,20,21, 22. למרות "חיווט תרשים" רחוקה מלהיות מלאה, יש לנקות את דפוסי או כללים הופיעו. יתר על כן, למרות כמה פרטים משתנים, כללים אלה נפוצים שני מינים יונקים (חולדה וחתול) ועל -פני מכמה אזורים neocortical, המאפשר הפיתוח של אבני היסוד אשר צפויים להיות ישים באותה מידה וקליפת אנושי. בטכניקה המתוארת כאן משמש כדי להרחיב את ההבנה שלנו של המפה פונקציונלי של המעגלים בקליפת המוח על-ידי זיהוי הנוירונים presynaptic ו postsynaptic מעורב חיבורים באזורים אשר לא נחקרו בפירוט בעבר, באמצעות פרוטוקול המאפשר שימור רקמות מצוינת ושחזור מכתימים מדהים ברקמת המוח למבוגרים. נתונים על המעגלים המקומיות ב CA2 ומאפיינים עצביים ב הזה כתת-תחום שנאסף באמצעות שיטה זו על ידי שילוב הקלטות תאיים אלקטרופזיולוגים (מזווג הקלטות עם microelectrodes חדה) עם מילוי, biocytin immunofluorescence, נהלים היסטולוגית ושיחזור הפערים מפורט עצביים, המאפשר השוואה ישירה עם השכן CA אזורים23,24,25.
בטכניקה המתוארת במאמר זה פותחה במשך השנים כדי להשיג את האנטומיה עצביים מפורט המאפשר הסיווג הנכון של תאים באיכות גבוהה שחזורים מדויקים של שני שלהם דנדריטי ואת עצב ובשבילים, נתונים יכול להיות בקורלציה עם אלקטרופיזיולוגיות הנתונים שנאספו מן הקלטות לזווג באמצעות אלקטרודות חדה. פרוטוקול היסטולוגית מוטבה כדי לשמר את ultrastructure של הנוירונים ולקבל להתאוששות מצוין (כולל הדנדריטים) וגם ובשבילים עצב. לדוגמה, העיקרון של הטכניקה קיבוע כפול על-ידי ראשית אנו ממליצים פתרון מקבע ותיקון שנית פוסט באוסמיום ארבע-חמצני נותן קונטרסט טוב מיקרוסקופ אור26. כמות קטנה של חומצה picric פתרון גלוטראלדהיד יתווספו הפתרון לשבועיים כדי לשפר את הנוגדן חדירה ולשמור על ultrastructure התאים כפי שהוצע המחקר הקודם27. Permeabilization הפרוסות המוח באמצעות שיטת ההקפאה-הפשרה בשילוב עם הקפאה-הגנה עם סוכרוז, יותר מאשר חומר ניקוי מסורתית, מספק גם אופטימלית שימור הרקמות עבור ניתוח מורפולוגי מפורט של התאים המוקלט. בנוסף, החזיית במיוחד ומבנים מאוד משופרת על-ידי הפחתת צביעת הרקע, עם incubations עם מי חמצן (H2O2), נתרן borohydride (NaBH4). הוספת ניקל כלורי (NiCl2) חזרת peroxidase (HRP) התגובה לשם השגת מוצר התגובה פיגמנט שחור גם מגביר את החדות.
הפרוטוקול הבא מתאר את ההליכים נהגו לברר שימור רקמות מעולה, מאוד מפורט שחזורים תלת-ממד עצביים בעקבות הקלטות תאיים במבחנה. התיאור של הכנת פרוסה, הקלטות לזווג תאיים באמצעות חדים אלקטרודות, הבאים הליכים היסטולוגית המשמשים במעבדה שלנו היה שדווחה בעבר28. למרות הפרוטוקול חל על התאים מלאים intracellularly biocytin לפרוסות עבות μm 450-500, באותו הפרוטוקול עשוי לשמש בעקבות הקלטות תאים שלמים. עם זאת, השימוש של פרוסות דק יותר תגרום פחות מלאה שחזורים של התאים.

<table><tbody><tr><td>נוגדן אבידין-7-אמינו-4-מתילקומרין-3-חומצה אצטית (אבידין-AMCA) - 20.8 מ"ג/מ"ל&nbsp;</td><td>מעבדות וקטור</td><td>A2008</td><td></td></tr><tr><td>ביוציטין&nbsp; &ge; 98% (TLC)</td><td>Sigma</td><td>B4261</td><td></td></tr><tr><td>3,5 דיאמינובנזידין (DAB), להכנת 5 מ"ל</td><td>Sigma</td><td>D4293</td><td></td></tr><tr><td>Durcupan שרף אפוקסי A</td><td>Sigma</td><td>44611</td><td></td></tr><tr><td>Durcupan שרף אפוקסי B</td><td>Sigma</td><td>44612</td><td></td></tr><tr><td>שרף אפוקסי Durcupan C</td><td>Sigma</td><td>44613</td><td></td></tr><tr><td>שרף אפוקסי Durcupan D</td><td>Sigma</td><td>44614</td><td></td></tr><tr><td>אתנול, puriss. p.a., מוחלט, &ge; 99.8%</td> <td>סיגמא</td><td>32221</td><td></td></tr><tr><td>ג'לטין</td><td>סיגמא</td><td>48723</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת גלוטרלדהיד, דרגה I, 25% ב-H2O</td><td>סיגמא</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול, &ge; 99%&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>סרום עיזים</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>עיזים נגד עכברים פלואורסצאין איזותיוציאנט (FITC) - 14.3 מ"ג/מ"ל</td><td>Sigma</td><td>F2653</td><td></td></tr><tr><td>עיזים נגד ארנב טקסס אדום (TR) - 3.3 מ"ג/מ"ל</td><td>Invitrogen</td><td>T2767</td><td></td></tr><tr><td>מי חמצן, תמיסה 30%</td><td>Sigma</td><td>H-1009</td><td></td></tr><tr><td>שמן טבילה, צמיגות 1.250 cSt (מואר)</td><td>סיגמא</td><td>I0890</td><td></td></tr><tr><td>ניקל כלוריד (NiCl2 . 6H2O)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>N5756</td><td></td></tr><tr><td>אוסמיום טטרוקסיד, למיקרוסקופ אלקטרונים, 4% ב-H2O&nbsp;</td><td>סיגמא</td><td>75632</td><td></td></tr><tr><td>פרפורמלדהיד, דרגת ריאגנט, גבישי&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>חומצה פיקרית, לחה במים, &ge; 98%</td><td></td> חוצץ פוספט 197378 <td></td><td>סיגמא</td></tr><tr><td>1 מ'</td><td>סיגמא</td><td>P3619</td><td></td></tr><tr><td>תחמוצת פרופילן (C3H6O), 99%</td> <td>Alfa Aesar&nbsp;</td><td>30765</td><td></td></tr><tr><td>נתרן טטרה-הידרובוראט</td><td>VWR</td><td>27885.134</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>פישר מדעי</td><td>S/8600/53</td><td></td></tr><tr><td>טריזמה הידרוכלוריד, &ge; 99.0%</td><td>Sigma</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>בסיס Trizma, &ge; 99.9%</td><td>Sigma</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield Antifade הרכבה בינונית, מקדם שבירה 1.45&nbsp;</td><td>מעבדות וקטור</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Vectastain Elite ABC ערכת HRP</td><td>מעבדות וקטור</td><td>PK6100</td><td></td></tr><tr><td>ציוד בשימוש&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Agar Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C4A פלנצ'ט אלומיניום מכוסה&nbsp;</td><td>GA-MA & עמיתים, בע"מ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ Leica DMR&nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>X-Cite 120PC Q&nbsp; מקור אור פלואורסצנטי&nbsp;</td><td>אקסליטאס טכנולוגיות&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מצלמת מיקרוסקופ דיגיטלית Leica DFC450&nbsp;</td><td>לייקה מיקרוסיסטמס&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>עט שרטוט טכני רפידוגרף 0.18 מ"מ&nbsp;</td><td>מרכז</td><td></td><td></td>גרפי לונדון</tr><tr><td>0.18 מ"מ ציפורן רפידוגרף מרכז</td><td>גרפי</td><td></td><td></td>לונדון</tr><tr><td>עט ציור טכני רפידוגרף 0.25 מ"מ&nbsp;</td><td>לונדון גרפיקה מרכז</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.25 מ"מ רפידוגרף ציפורן</td><td>לונדון מרכז גרפי</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מערכת Neurolucida כולל תחנת עבודה למחשב, במה, מצלמה וג'ויסטיק לבקרת שלב XYZ</td><td>Microbrighfield (MBF) Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neurolucida גרסת תוכנה 2017</td><td>Microbrighfield (MBF) Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CorelDRAW גרפיקה Suite X5</td><td>Corel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תוכנה לעריכת וידאו&nbsp;</td><td>בקבוקוני זכוכית Adobe Premiere Pro</td><td></td><td></td></tr><tr><td>14 מ"ל</td><td>פישר מדעי&nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

שחזור biocytin, שחזורים תלת-ממד של ca2 בהיפוקמפוס מלא interneurons

Biocytin Recovery and 3D Reconstructions of Filled Hippocampal CA2 Interneurons

איך פעילות רשת בקליפת המוח מעבד מידע יש חשיבות למספר רב של שאלות מדעי בסיסי וקליני. הפרוטוקול המתואר כאן מזהה אבני הבניין הבסיסיות של המעגלים הזאת. המחקרים מעמיק של אזורים קורטיקליים יספק בסופו של דבר לצורך הבנה של איך המוח רוכשת מדענים אחרים עם הרכיבים במעגל, מעבדת ושומרת מידע, מה משתבש במחלה, ואילו אלקטרופיזיולוגיות נתונים מורפולוגיים נמצאים בשימוש נרחב על ידי מדעני מוח חישובית בבנייה של רשתות דגם לחקור עיבוד מידע. פרוטוקול שמפורטות כאן מתאר כיצד תאים מלא biocytin הקליטה באזור CA2 ההיפוקמפוס הם לשחזר ולאחר מכן שיחזר ב- 3D. בנוסף, הפרוטוקול מתאר ההפגנה של סידן מחייב חלבון או פפטיד תוכן interneurons המוקלט.

נוירונים ב- CA2 בהיפוקמפוס היו מלאים biocytin בעקבות הקלטות אלקטרופזיולוגים (דמויות 1Ac, Ad ו- 1Bc, Bd). הפרוסות תוקנו במשך הלילה בעקבות ההקלטות, נוירוכימיה ואפיון מורפולוגי של נוירונים נחשפו בעקבות פרוטוקול המתוארים כאן.
סידן מחייב חלבון או תכולת החלבון של interneurons מלא נקבע על ידי המקננת הפרוסות תחילה עם נוגדנים הראשי ולאחר מכן עם נוגדנים משניים fluorescently עם תוויות ברורות. מאפייני ירי interneurons במהלך ההקלטות יכתיב את הבחירה של נוגדנים העיקרי בשימוש. אבידין-AMCA שימש כדי להמחיש את interneuron מלא biocytin, אנטי-העכבר fluorescein isothiocyanate (FITC) עז נגד ארנב אדום טקסס (TR) שימשו כדי לאפיין את נוירוכימיה interneuronal (איור 1Bb).
בעקבות הפריט החזותי פלורסצנטיות, פרוטוקול HRP שימש כדי לחשוף את biocytin (איור 1Ab). האנטומיה מפורט בסדר של CA2 interneurons נמשך אז תלת-ממד באמצעות תוכנת שחזור נוירון (איור 2 ו- 3 א איור). סרטון של שחזור תלת-ממד של תא סל הקליטה, מולאו CA2 מוצג וידאו. שחזורים עצביים נחשבו כמשימה שהושלמה, אם שניהם ובשבילים דנדריטי ואת עצב הוגבלו בתוך העומק של הפרוסה μm 450-500. ארבור עצב המסכן מכתים הוערכה על ידי הנוכחות של סניפים קטום עם סופים פתוחים בחלק העליון או התחתון של הפרוסה או על-ידי מכתימה את זה היה מוגבל ל קטע הראשונית האקסון וסניפים מקורב מאוד. איור 4 מייצג את הדוגמאות של טובה והדמיה של עניים HRP מכתימים הבאים biocytin.
ניתוח Morphometric של שחזורים תלת-ממד (איור 3) יכול להתבצע כדי להדגים סניף המורכבות, סומה פני השטח ואת שטח ףקיהב ובשבילים דנדריטים, עצב.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58592/58592fig1.jpg"> איור 1 : שחזורים עצביים של שני סוגים של תאים סל הקליטה מלא באזור CA2 בהיפוקמפוס ואת בקורלציה אלקטרופיזיולוגיות נתונים שהושגו בעקבות הקלטות תאיים במבחנה. איור זה השתנה מ מחקרים קודמים23,24. כל שכבה Oriens, SP שכבה Pyramidale, SR שכבה Radiatum, הסים שכבה Lacunosum Moleculare. (א) Aa: שחזור של CA2 סל תא עם סוכת דנדריטי ואת עצב מוגבלת באמצעות שפופרת ציור (1000 X). דנדריטים הם בשחור, האקסון הוא אדום. Ab: תמונה של התא סל מלא biocytin בעקבות פרוטוקול אבידין-HRP המתוארים כאן. Ac: מעקב נציג של מתח התגובות hyperpolarizing ו- depolarizing הנוכחי הזרקה של CA2 סל תא עם סוכת דנדריטי ואת עצב מוגבלת. מודעה: דוגמה של פירמידה CA2 לצמצם ארבור סל תא חיבורים הקליטה באמצעות אלקטרודות חדה. פוטנציאל פוסט-סינפטיים סינאפסות ללא הפרדות צבע (EPSP) ממוצעים להציג דיכאון קצרה הרכבת נראית לעין במהלך התגובות רכבות של שלושה קוצים. (B) Ba: שחזור דו-ממדי של תא סל של CA2 ובשבילים דנדריטים של עצב באמצעות שפופרת ציור (1000 X). העץ הדנדריטי של תא זה סל (בשחור) מורחב רדיאלי דרך כל השכבות של CA2 ו- SO אופקית בתוך והאזור SP של CA2 ו CA3 אזורים. דנדריט אופקי אחד להגיע גם לאזור CA1. הפעולה באקסון (באדום) להרחיב CA3 ואת CA1 אזורים. Bb: מלא biocytin (AMCA ההכתמה) סל תא PV-immunopositive (צביעת FITC) והיה CB-immunonegative (צביעת טקסס-אדום). לפנה ס: מעקב נציג של מתח התגובות hyperpolarizing ו- depolarizing הנוכחי הזרקה של CA2 סל תא עם סוכת דנדריטים של עצב. Bd: ממוצעים EPSP מורכב להציג קצר הרכבת הקלה לכאורה במהלך התגובות רכבות של שלושה קוצים. ניתן למצוא דוגמאות של סוגים אחרים של interneurons טלקוה CA2 מחקרים קודמים25,30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58592/58592fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a> 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58592/58592fig2.jpg"> איור 2 : שחזור תלת-ממדי גוף התא. (א) עקיבה תלת-ממד של גוף התא. מבט על קווי המתאר שונים לאתר z שונים ומעמדות תוך התמקדות דרך הגוף התא. (B) תצוגת תלת-ממד של קווי המתאר שונים. (ג) תצוגת תלת-ממד של גוף התא בזווית אחרת. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58592/58592fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a> 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58592/58592fig3.jpg"> איור 3 : ניתוח Morphometry של שחזורים תלת-ממד עצביים. (א) שחזור תלת-ממד של CA2 arbor הצרה סל תא. כל סניף דנדריטים מיוצג על-ידי צבע (ירוק, כחול, אדום וורוד), האקסון כחול בהיר. Dendrogram (B) של התא סל המייצגים מספר הסניפים דנדריטי ואת האורך של כל אחד מהמקטעים הכלול בתוך התחומים קונצנטריים עם סומא, במרווחים של 100 μm של סומא. הצבעים dendrogram מקבילים לאלה של דנדריטים בדוגמה (ג) א של ניתוח morphometric מתבצע על תאים כפירמידה CA2 (הותאם מן המחקר הקודם23). מספר הסניפים דנדריטים הייתה להתוות נגד המרחק soma של CA2 הפירמידלית הבנויה תאים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58592/58592fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a> 
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58592/58592fig4.jpg"> איור 4 : דוגמאות טוב (א) ועני (ב) HRP מכתים. (א) Biocytin השחזור חשף interneuron טוב מאוד מלא ב CA2. גוף התא (CB) היא מוכתמת בקדרות ויש לו קווי מתאר ברורים. דנדריטים הם חרוזים ומוצגים כמה קוצים (המיוצגים על ידי כוכבים אדומים). סוכת עצב (א) הוא צפוף ומציגה עם העיתון ons קטן. (B) דוגמה עניים דנדריטי ואת עצב מכתים של 2 תאים כפירמידה CA2. ההכתמה של מגלן הוא חלש עם אין מתאר ברור. צביעת המסכן קשורה לעיתים קרובות עם הקלטות אלקטרופיזיולוגיות קצרים יותר וכתוצאה מכך בנוכחות ענפים עתירי biocytin מעט מאוד. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58592/58592fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a> 
וידאו 1: שחזור עצביים תלת-ממד של תא סל של CA2 מוגבלת דנדריטים ארבור (המכונה גם CA2 arbor הצרה סל תא) עם סומא שלה בשכבה pyramidale, דנדריטים המתפרסות על-פני כל שכבות של האקסון CA2 שכבה pyramidale, שכבה הסמוך oriens radiatum. סניפים מעטים הגיעו את oriens הרובד CA3 הפרוקסימלית ואת CA3 שכבה pyramidale. תא זה היה מלא biocytin בעקבות הקלטות אלקטרופיזיולוגיות, סעיפים היו מעובדים עם אבידין-HRP בעקבות פרוטוקול המתוארים כאן. עקב עם פרוסות, נמצאה רק האקסון בתוך העומק של הפרוסה, למרות דנדריטים שלמים. דנדריטים הם ורוד כהה האקסון בלבן. גבולות השכבה ואזור נוספו בתחילת הסרטון. שחזור תלת-ממד על-ידי גאורגיה Economides-3D וידאו מאת פאלק Svenja. הווידאו היה הקליט עם תוכנת שחזור נוירון כאמור שלב 2.17, נערך עם תוכנת עריכת וידאו. לקשר הוידאו:30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58592/Figure_3.mp4" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>פתרונות בשימוש</td>
			<td>הרכב/הוראות</td>
		</tr>
<tr>
<td>קיבוע פתרון</td>
			<td>4% paraformaldehyde, 0.2% רוויות חומצה picric פתרון, פתרון גלוטראלדהיד 0.025% 0.1 M פוספט מאגר (PB)</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.1 M מאגר פוספט pH 7.6</td>
			<td>להוסיף 100 מ של מניות 1 מ' פוספט מאגר 900 מ ל מים מזוקקים</td>
		</tr>
<tr>
<td>פוספט buffered (PBS) מלוחים pH 7.4/7.5</td>
			<td>להוסיף 10 מ ל 0.1M פוספט מאגר, 0.2 גרם של אשלגן כלורי ו- g 8.76 של NaCl 990 מ של מים מזוקקים</td>
		</tr>
<tr>
<td>טריס מאגר pH 7.5</td>
			<td>להמיס 5.72 g של טריס הידרוכלוריד, g 1.66 טריס הבסיס ב- 50 מ ל מים מזוקקים. ואז להפוך עד 1 ליטר עם מים מזוקקים.</td>
		</tr>
<tr>
<td>פתרון גלוטראלדהיד מקבע paraformaldehyde במאגר</td>
			<td>4% paraformaldehyde, 0.2% רווי חומצה picric פתרון, פתרון גלוטראלדהיד 0.025% במאגר פוספט 0.1 M.</td>
		</tr>
<tr>
<td>פתרון ABC</td>
			<td>פתרון להתבצע לפחות 30 דקות לפני השימוש הערכה ABC. להוסיף טיפה 1 של פתרון A וטיפה 1 של פתרון B 2.5 מ ל- PBS.</td>
		</tr>
<tr>
<td>שרף אפוקסי Durcupan:</td>
			<td>כדי להפוך את הסירים 20: 20 גרם של רכיב A, 20 גרם של רכיב B, g 0.6 של רכיב C ו 0.4 g של רכיב D -</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>להגן על האיזון נשפך על ידי כיסוי לצלחת עם מעגל של נייר סינון. לשקול בזהירות את ריאגנטים לתוך גביע tripour בפרופורציות האמור לעיל. לערבב ביסודיות על ידי ערבוב נמרצות באמצעות שני מקלות עץ לפחות 5 דקות. התערובת צריך להיות צבע חום כהה צפיפות אחידה. מקם את הספל לתנור ב ~ 50 מעלות צלזיוס לכל היותר 10 דקות להסיר את בועות אוויר רבים ככל האפשר. הערה: השרף תתחיל לרפא אם לעזוב. הספל בתנור יותר מ 10 דקות Decant השרף דרך סירי פלסטיק או מזרקים מ ל, לצאת איתם ולא לאחסן במקפיא-20 ° C מוכן לשימוש.</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: טבלה של פתרונות.

פרוטוקול שמפורטות כאן מתאר את ניתוח immunofluorescence, biocytin השחזור של שחזורים באיכות גבוהה של interneurons CA2 בהיפוקמפוס בעקבות את הקלטות אלקטרופיזיולוגיות תאיים במבחנה, ומאפשר עצביים אפיון, בסופו של דבר בסדר אנטומיה עצביים שילמדו.

שחזור Biocytin, שחזורים תלת-ממד של CA2 בהיפוקמפוס מלא Interneurons

How cortical network activity processes information is of importance to a large number of basic and clinical scientific questions. The protocol described ...

שיטה זו יכולה לעזור לסווג תת-סוגים עצביים ולהרחיב את הבנתנו את המפה הפונקציונלית של מעגלים קליפת המוח. פרוטוקול זה עבר אופטימיזציה כדי לשמר את המבנה האולטרה-מבנה של הנוירונים ולקבל התאוששות מצוינת של ארברים דנדריטיים ואקסונאליים, המאפשר שחזורים באיכות גבוהה. בסוף הקלטה אלקטרופיזיולוגית, להעביר את הפרוסה המכילה את התא המוקלט לצלחת קטנה של ACSF.תוך כדי עבודה במכסה המנוע של האדים, מרדדים את הפרוסה על פיסת נייר מסנן קטנה ואיכותית ומ מניחים עוד פיסת נייר מסנן לחה על הפרוסה. מניחים את הרקמה בסיר פלסטיק קטן המכיל 5 עד 10 מיליליטר של פתרון קיבוע ולאחסן בארבע מעלות צלזיוס לילה. למחרת, להעביר את הרקמה מן המיכל עם פתרון תיקון למיכל עם שני מיליליטר של חיץ פוספט טוחן 0.1 על מנת לשטוף, לחתוך כל רקמה עודפת עם להב אזמל.הסר רקמה עודפת על ידי הנחת הפרוסה בצלחת פטרי, וחתך את הרקמה העודפת עם להב אזמל. מעבירים את הרקמה הקצוצה לצלחת פטרי נקייה, ומבטיחים שהיא שוכנת שטוחה ללא קפלים או קמטים. הסר את המאגר העודף באמצעות מברשת צבע יבשה.מכסים את הרקמה בתסנת ג'לטין חמה ומ מניחים את צלחת פטרי על בלוק קפוא כדי לקרר במהירות את הפתרון. לאחר מכן, להעביר את המנה של הגדרת ג'לטין ל 4 מעלות צלזיוס במשך 30 עד 60 דקות. במכסה המנוע של האדים, השתמש בלהב אזמל כדי לחתוך בלוק קטן באורך 1 X 1 ס"מ המכיל את הרקמה המוטבעת של הג'לטין.הרם את הבלוק באמצעות מרית קטנה והעבר בזהירות לפתרון קיבוע טרי. אפשר לתקן לפחות 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר קיבעון שני זה, לשטוף את בלוק ג'לטין בחמישה מיליליטר של PB שלוש פעמים.לאחר הכביסה, ייבשו את הבלוק בעזרת פיסת רקמת נייר. לאחר מכן השתמש בכמות קטנה של דבק cyanoacrylate כדי לתקוע את הבלוק, בכיוון עם הרקמה בחלק העליון, על משאית רטט באמצעות דבק סופר. חותכים את הפרוסה בעובי 50 מיקרון באמצעות רטט וממקמים כל קטע בזהירות בבקבוקון זכוכית המכיל 10 אחוז סוכרוז.לאחר ההידור, אוספים בזהירות קטע מהבקבוקון ומ מניחים אותו שטוח במכסה צלחת פטרי. לאחר מכן השתמש בלהב אזמל טרי כדי להסיר את הג'לטין מסביב לקטע. מניחים את החלקים לתוך בקבוקון המכיל 2 מיליליטר של סוכרוז טרי 10 אחוז PB, ומתסיסים במשך 10 דקות כדי להתחיל את תהליך cryoprotection.לאחר cryoprotection, מניחים את החלקים שטוחים על מלבן קטן של רדיד אלומיניום באמצעות מברשת צבע. מוציאים כל נוזל עודף מהסעיפים ומקפלים בזהירות את נייר הכסף לחבילה. החזק את רדיד האלומיניום קרוב לפני השטח של חנקן נוזלי מבלי לגעת בפני השטח במשך 30 שניות.ואז לאפשר את החלקים להפשיר לחלוטין במשך כ 30 שניות. חזור על ההפשרה ההקפאה עוד פעמיים. הסר את כל החלקים מנייר כסף עם מברשת צבע והצב אותם לתוך בקבוקון זכוכית המכיל שני מיליליטר של PB לשטוף סוכרוז עודף תחת תסיסה מתמדת.לאחר כשל חיסוני להדמיית פלואורסצנטיות, מניחים את הגלישה בצלחת פטרי מזכוכית המכילה PBS, ומסירים בזהירות את החלקת המכסה. לאחר מכן לשטוף את החלקים את השקופית באמצעות פולסים עדינים של PBS מתוך פיפטה פסטר. מניחים את החלקים לתוך בקבוקון זכוכית נקי המכיל PBS.בצע את תגובת Avidin HRP על ידי הדגירה הראשונה של החלקים במתחם ביוטין אבידין או ABC, לפחות שעתיים כדי להגביר את מוצר תגובת HRP. לאחר מכן, לשטוף את החלקים עם PBS 3 פעמים במשך 10 דקות, ולאחר מכן עם חיץ טריס פעמיים במשך 10 דקות. לאחר הסרת לשטוף חיץ tris האחרון, להוסיף במהירות טיפה אחת של פתרון כלוריד ניקל שמונה אחוזים תותב diaminobenzidine או פתרון DAB.לאחר מכן pipette הפתרון פנימה החוצה לערבב במהירות להוסיף מיליליטר אחד של פתרון זה על הסעיפים. הדגירה את החלקים בפתרון זה במשך 15 דקות. לאחר מכן להוסיף 10 microliters של 1 אחוז מי חמצן לפתרון DAB.אפשר לתגובה להמשיך בחושך תחת תסיסה מתמדת במשך כ 1 עד 2 דקות עד התאים מסומנים. במכסה המנוע של האדים, מניחים עיגול קטן של נייר סינון לתוך צלחת פטרי ומדכאים אותה עם PB. הרם את החלקים בזה אחר זה מבקבוקון הזכוכית באמצעות מברשת צבע והצב אותם בזהירות שטוחים על הנייר. מכסים את החלקים בעיגול לח אחר של נייר סינון ומסירים חיץ עודף על ידי נגיעה עדין בנייר טישו אל פני השטח.החל שמונה או תשע טיפות של אחוז אחד osmium tetroxide ב PB על הנייר העליון. מכסים את המנה ושומרים על מכסה המנוע של האדים לפחות 30 דקות, אך לא יותר משעה. לאחר שטיפה, הרכבה, מכסה את החלקים, להתייבש באמצעות סדרה של 50 אחוז, 70 אחוז, 95 אחוז, ו 100 אחוז אלכוהול פתרונות.לאחר שלב ההתייבשות, מעבירים את החלקים לבקבוקון זכוכית המכיל 100 אחוז אתנול על שייקר במשך כחמש דקות. החלף את תסנון האלכוהול בתחמוצת פרופילן ושטף שלוש פעמים במשך חמש דקות. לאחר הכביסה האחרונה, לשמור על סביב שני מיליליטר של תחמוצת פרופילן בבקבוקון ולהוסיף שרף ביחס 1:1.ודא כי שהרשת מומסת ולשמור את החלקים תחת תסיסה מתמדת במשך 30 דקות. לאחר 30 דקות, יש להשתמש במקל עץ כדי למקם כל קטע במטזי אלומיניום המכילים שרף אפוקסי, ולטרוב בן לילה. למחרת, מניחים את planchette על צלחת חמה במשך כ 10 דקות.ואז להרים כל קטע עם מקל עץ ולמקום על שקופית נקייה. לאחר שכל המקטעים הועברו לשקופית, הצג את השקופית תחת מיקרוסקופ חותך כדי לבדוק את כיוון הפרוסות והצב כיסוי מעל המקטעים. מרפאים בתנור במשך 48 שעות ב-56 מעלות.השתמש במטרה הגדלה נמוכה כדי להתמקד בסעיף הבית המכיל את גוף התא. לאחר מכן השתמש במטרה 100x, התמקד בגוף התא ולחץ במרכז כדי לסמן את נקודת ההתייחסות. למעקב אחר ה-soma ב-3D באמצעות המטרה 100x, בחרו מיתאר מהלשונית 'מעקב' ובחרו בקווי המתאר של גוף התא.השתמש ג'ויסטיק כדי להעביר את המוקד לראש החלק העליון של גוף התא. מקם את הנקודות על-ידי לחיצה מסביב להיקף החלק שנמצא כעת במוקד. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני ובחר קו מתאר סגור כדי לסיים חלוקה לרמות ראשונה זו.חזור על תהליך זה במיקומים z שונים עד שהתחתית של גוף התא הוא הגיע. כדי לעקוב אחר האילנות הדנידריטית, בחר דנדריט או דנדריט אפי, בתפריט הנוירון. ראשית, עקוב אחר מקטע התחלתי קצר עבור כל דנדריט באמצעות גלגל הגלילה של העכבר כדי להתאים את קוטר הסמן כך שיתאימו לקוטר הנדריט.עקוב אחר כל דנדריט. כאשר מגיעים לצומת בעץ, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני ובחר צומת דו-קוטבי או צומת משולש מהתפריט הנפתח. כדי לזהות נקודות תואמות בין הנדריטים במקטע התואם למקטע שהושלם, לחץ על הכרטיסיה הזז ובחר נקודות התאמה.בחר את מספר הנקודות שיש להתאים ולאחר מכן לחץ על אישור. לחץ על סיום ענף שהושלם ולאחר מכן לחץ על הענף. חזור על פעולה זו עבור כל נקודת משחק. לאחר כל dendrites של כל קטע כבר נעוצים, לעקוב אחר האקסון באמצעות אותו תהליך מוצג כאן הוא שחזור של תא סל CA2 עם ארבור דנדריטי ואקסונאלי מוגבל באמצעות צינור ציור.הדנדריטים בשחור והאקסון באדום. זוהי תמונה לדוגמה של תא הסל מלא ביוציטין בעקבות פרוטוקול HRP אבידין המתואר כאן. מוצג כאן הוא וידאו של שחזור עצבי 3D של תא הסל CA2.דנדריטים בוורוד כהה והאקסון בלבן. לבסוף, תמונה זו מציגה דנדרוגרמה של תא הסל CA2. זה ייקח זמן להיות מיומן עם פרוטוקול זה.עם זאת, גישה ממוטבת זו יכולה ליצור תמונות ברזולוציה גבוהה של מבנים קליפת המוח והיפוקמפוס מורכבים במבחנה.

biocytin-recovery-3d-reconstructions-filled-hippocampal-ca2

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

סרטון זה מדגים את תהליך ההדמיה של נוירון פנימי מלא ביוציטין בקטע היפוקמפוס של חולדה, ומדגיש את זהותו הנוירוכימית באמצעות שימוש בנוגדנים ספציפיים ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

צביעה חיסונית של אינטרנוירונים בקטע היפוקמפוס של חולדה

סרטון זה מדגים את ההליך לצביעה של פרוסות מוח קבועות של חולדות המכילות אינטרנוירונים מלאים בביוציטין. הפרוטוקול כולל דגירה עם קומפלקס אבידין-ביוטין (ABC), צביעה עם HRP ומצע כרומוגני, שימור מבנים עם אוסמיום טטרוקסיד והטמעת הרקמה בשרף להדמיה.

תיוג של אינטרנוירונים מלאים בביוציטין בפרוסות היפוקמפוס של חולדות לצורך הדמיה

כדי להבין את המבנה של רשתות נוירונים, אפיון פונקציונלי וצורני של נוירונים בודדים הוא הכרח. הנה, אנחנו מדגימים תיוג juxtasomal biocytin, המאפשר הקלטות אלקטרו בתצורה תאית, ועם זאת שמירה על היכולת לתייג את הנוירון לפוסט הוק שחזור של הדנדריטים ואדריכלות אקסון intracellularly.

Juxtasomal Biocytin תיוג לחקר קשר בין מבנה לתפקוד של פרט נוירונים קליפתיים

רשתות קליפת המוח נשלטות על ידי קבוצה קטנה, אך מגוונת של interneurons המעכב. חקירה פונקציונלית של interneurons לכן דורשת הקלטה ממוקדת וזיהוי קפדני. שתואר כאן היא גישה משולבת הכוללת כל תא הקלטות מזוגות בודדים או synaptically מצמידים של נוירונים עם תיוג תאיים, שלאחר הוק מורפולוגיים וניתוח immunocytochemical.

הקלטות תיקון מהדק כל התא מMorphologically- וinterneurons היפוקמפוס זיהה Neurochemically

תרביות בצפיפות נמוכה של נוירונים ראשוניים בהיפוקמפוס דורשות בדרך כלל שכבת הזנה גליה כדי לספק גורמים נוירוטרופיים ולשמור על אריכות ימים. אנו מתארים כאן שיטה פשוטה לתרבית נוירונים בצפיפות נמוכה במיוחד על כיסויי זכוכית בנוכחות שכבת הזנה עצבית בצפיפות גבוהה, המאפשרת חקירה של מנגנונים עצביים-אוטונומיים ספציפיים.

שיטה פשוטה עבור צפיפות Ultra-Low, לטווח ארוך ראשית בהיפוקמפוס Neuron תרבות

פרוטוקול זה מציג שיטה ההתאוששות מורפולוגי של נוירונים תוקנו במהלך הקלטות אלקטרו באמצעות מילוי biocytin ו postprocessing immunohistochemical שלאחר מכן. אנו מראים כי חלקים עבים המלאה biocytin כי היו מוכתמות coverslipped ניתן restained עם ימים או חודשי נוגדן ראשוניים שניים לאחר מכן.

Immunostaining סעיפים Biocytin מלא ומעובד מרקרים הנוירוכימיים

אנו מציגים שיטת שילוב תאים כל תיקון-קלאמפ הקלטות והדמיה שני הפוטונים להקליט את Ca2 + שנחשולי דנדריטים עצביים במוח חריפה פרוסות.

שני הפוטונים סידן הדמיה של דנדריטים עצביים במוח פרוסות

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים להכנת פרוסות מוח חריפה המכילים את הגרעין הגנוקה לרוחב ואת החקירה אלקטרופיסיולוגית של הפונקציה retinogeniculate ותפקוד הסינפסות. פרוטוקול זה מספק דרך יעילה לחקר הסינפסות עם שחרור גבוה והסתברות נמוכה של שחרור באותן פרוסות מוח חדות.

החקירות האלקטאליות של הפונקציה Retinogeniculate ו Corticogeniculate סינפסה

אנו מציגים פרוטוקול להכנת פרוסות חריפות מההיפוקמפוס הגבי-ביניים של עכברים. אנו משווים הכנה רוחבית זו עם חתך קורנל במונחים של איכות הקלטות ושמירה על תכונות מורפולוגיות של נוירונים מוקלטים.

הכנת פרוסות חריפות מהיפוקמפוס הגבי להקלטה של תא שלם ושחזור עצבי בGyrus דנטאטה של עכברים בוגרים

כאן אנו מציגים פרוטוקול המתאר התמרה ויראלית של אזורי מוח בדידים עם מבנים אופטוגנטיים כדי לאפשר אפיון אלקטרופיזיולוגי ספציפי לסינפסה בפרוסות מוח של מכרסמים חריפים.

אקס ויוו חקירה אופטוגנטית של העברה סינפטית ארוכת טווח ופלסטיות מקליפת המוח הקדם-מצחית האמצעית ועד קליפת המוח האנטורינלית הלטרלית

שילוב של התמרה וקטורית נגיפית וניקוי מוח בשיטת CLARITY מאפשר לחקור מספר רב של נוירונים ואסטרוציטים בו זמנית.

חקירת אינטראקציה מרחבית בין אסטרוציטים לנוירונים במוחות מנוקים

חקור שחזור תלת-ממדי של נוירוני CA2 בהיפוקמפוס באמצעות רקורדינג אלקטרופיזיולוגי ואימונופלואורסצנציה. פרוטוקול זה מאפשר אפיון תכונות נוירונליות ולימוד מעגלים קורטיקליים בפרטים.

שחזור Biocytin, שחזורים תלת-ממד של CA2 בהיפוקמפוס מלא Interneurons

גלה סרטונים נוספים