מבנה תמיסת Cerulean חלבון פלואורסצנטי באמצעות MeshAndCollect
19 במרץ 2019
אנו מציגים את השימוש בפרוטוקול MeshAndCollect כדי לקבל ערכת נתונים עקיפה מוחלטת, לשימוש בקביעת מבנה עוקבות, המורכב עקיפה חלקי ערכות נתונים שנאספו מקריסטלים קטנים רבים של החלבון הניאון Cerulean.
פרוטוקול MeshAndCollect האוטומטי פותח כדי לשלב קריסטלוגרפיה סדרתית עם איסוף נתוני סיבוב סטנדרטי כדי למדוד גבישים קטנים מדגימות דיסקוס. השיטה מזהה תחילה את מיקום הגבישים המותקנים על אותו מחזיק מדגם כדי לכוון את איסוף ערכת הנתונים החלקית שתמוזג לאחר מכן ותשמש לפתרון המבנה. MeshAndCollect הוא משכנע כפי שהוא מאפשר לך לעשות ניסויים במהירות עם אותה התקנה, פתרון מבנה, הקרנת ליגנד, וכל זה עם גבישים זעירים.
השיטה תואמת ל-VMX של קורת סינכרוטרון המצויד באופן אידיאלי בגמישות פוטון גבוהה, קוטר קרן קטן וגלאי טעינה מחדש מהיר. ראשית, התחבר למערכת המידע המורחבת עבור מסד הנתונים של קרן גבישי החלבון ובחר MX.Log עם מספר הניסוי והסיסמה מטופס A. לאחר מכן, בחר הוסף משלוח חדש ומלא את המידע המבוקש.
בחר הוסף חלקי ומלא את הנתונים הרלוונטיים. בחר הוסף גורם מכיל, בחר דיסקית SC3 ומלא את המידע הדרוש, כולל המיקומים של מחזיקי הדגימה בדיסק. בבקתה הניסיונית, לטעון את הדיסקית לתוך עושה מחליף מדגם ולציין את מיקומו.
לאחר מכן, התחבר למערכת המידע למסד הנתונים של קרן גבישי החלבון. בחר הכן ניסוי, אתר את המשלוח, בחר הבא וציין את מיקום קו הקרן והתקסקית במחליף לדוגמה. היכנס לתוכנה לבקרת קו הקרן עם המספר והסיסמה הניסיוניים המופיעים בטופס A.
לחץ על סנכרן כדי לסנכרן את תוכנת הבקרה של קו הקרן עם מערכת המידע עבור מסד הנתונים של קרן גבישי החלבון. השתמש בתוכנת בקרת קו הקרן כדי לטעון את מחזיק הדגימה על הגניומטר. לאחר מכן לחצו לחיצה ימנית על מיקום באזור המחליף לדוגמה ובחרו 'תן טעינה לדוגמה'.
בחר את לחצן המרכז ולאחר מכן מרכז שלוש לחיצות באמצע קצה קצה הלולאה. שמור את המיקום המרכזי על-ידי בחירה באפשרות שמור. תחת מתקדם, הוסף את זרימת העבודה של ניתוב מחדש חזותי לתור איסוף הנתונים.
לאחר מכן הפעל את זרימת העבודה על-ידי לחיצה על תא איסוף. לאחר מכן, בחר באחת ממיקומי המרכז השמרים על-ידי לחיצה עליו. לחץ שוב על הכפתור המרכזי, ולאחר מכן מרכז שלושה לחיצה באמצע תחילת הגבעול של הלולאה.
שמור את המיקום השני על ידי לחיצה על שמור. ולאחר מכן לחץ על המשך. לאחר שזרימת העבודה מיישרת את המישור של מחזיק הדגימה עם ציר הסיבוב של הגוניומטר, מרכז שוב את מחזיק הדגימה איפשהו באמצע רשת שינוי.
כוון את מחזיק הדגימה כך שפנים של הרשת יצבו לכיוון קרן הרנטגן על ידי סיבוב ציר האומגה באמצעות תוכנת בקרת קו הקרן. בתוכנת בקרת קו הקרן, לחץ על התפריט הנפתח צמצם ובחר ערך. לאחר מכן לחצו על סמל הכלי רשת שינוי כדי להעלות את חלון הכלי רשת שינוי.
בתצוגה לדוגמה של תוכנת בקרת קו הקרן, צייר את רשת שינוי על-ידי לחיצה וגרירה של העכבר מעל האזור המכיל גבישים על מחזיק הדגימה. לשמירת רשת שינוי, לחצו על כפתור הפלוס בחלון הכלי רשת שינוי. בשדה הרזולוציה של תוכנת בקרת קו הקרן, הזן את הרזולוציה שבה יש לאסוף תמונות דיפוזיה.
אם לא ידוע מידע מוקדם על איכות ההתפזרות של הגבישים, מומלץ לקבל ערך בין שניים ל-2.5. בחר MeshAndCollect בכרטיסיה איסוף נתונים מתקדם. הוסף אותו לתור ולחץ על אסוף את התור.
בחלון הפרמטר, השתמש בפרמטרי ברירת המחדל התלויים בקו הקרן. בניסוי המתואר כאן, פרמטרי ברירת המחדל הם זמן חשיפה של 0.037 שניות לנקודת סריקת רשת שינוי, שידור של 100% ותנודות מדרגה אחת לכל קו סריקת רשת שינוי. לחץ על המשך.
סריקת הרשת פועלת ותמונות ההתהפוכות שנאספו בכל נקודת רשת מנותחות ומדורגות בהתאם לעוצמת הדיפרציה עם התוכנה Dozer. לאחר ניתוח Dozer, נוצרת מפת חום והסדר עבור אוספי נתונים חלקיים עוקבים מוקצה באופן אוטומטי בהתבסס על חוזק diffraction. לבסוף, לחץ על המשך כדי להפעיל את אוספי הנתונים החלקיים.
MeshAndCollect כפי שיושם MXCuBE שימש לאיסוף של ערכות נתונים עקיפה חלקית גבישים קטנים של Cerulean ממוקם על אותו מחזיק מדגם שבו זיהוי חזותי של גבישים היה קשה. כדי לסנן את מחזיק הדגימה, רשת צוירה מעל מרכז לולאת הרשת ובהתבסס על מפת החום של ניקוד Dozer, נאספו באופן אוטומטי 85 ערכות נתונים חלקיות של דיפוזיה. אלה שולבו בנפרד ואז מוזגו כדי לייצר ערכת נתונים עם שלמות של 99.8% ברזולוציה של 1.7 אנגסטרום.
כצפוי, מבנה הגביש של Cerulean יכול להיפתר על ידי החלפה מולקולרית באמצעות ערכת הנתונים שנוצר. לאחר עידון, הושגה עבודת R של 22.8% ו R ללא 25.4%. מיקום סופר של המבנה שנקבע בעבר מראה RMSD גלובלי על עמדות c-אלפא של 0.1 אנגסטרום.
עבור פרויקטים שבהם אופטימיזציה של שלב צמיחת הגביש, MeshAndCollect מספק את האפשרות להשיג ערכת נתונים מלאה המבוססת על השילוב של ערכות נתונים חלקיות אמורפיות אלה המתקבלות מקריסטלים קטנים יותר. טכניקה זו סללה את הדרך לביולוגים מבניים לפתור מבנה מדגם חלקים שבו רק כמה עשיריות של גבישי מיקרו לא ניתן היה לייצר.
סקירה
הפרוטוקול MeshAndCollect מאפשר איסוף של מערכות נתונים מלאות של עקיפה מגבישים קטנים, במיוחד עבור החלבון הפלואורסצנטי Cerulean. שיטה זו משלבת עקיפה סדרתית עם איסוף נתונים תקני סיבוב, המאפשרת ניסויים מהירים.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- ביולוגיה מבנית
- עקיפה
- ניתוח חלבונים
רקע
- MeshAndCollect משלב נתונים מגבישים קטנים מרובים.
- הוא מיועד לשימוש עם קווי קרניים של סינכרוטרון.
- הפרוטוקול משפר את יעילות קביעת המבנה.
- הוא מתמודד עם אתגרים בזיהוי ויזואלי של גבישים קטנים.
מטרת המחקר
- לפתח שיטה לקבלת מערכות נתונים מלאות של עקיפה.
- להקל על קביעת מבנה מגבישים קטנים.
- לשפר את המהירות והיעילות של ניסויים.
שיטות בשימוש
- איסוף אוטומטי של מערכות נתונים חלקיות מגבישים קטנים.
- שילוב נתונים באמצעות תוכנת ה-Dozer לניתוח.
- שימוש בכלי רשת לאופטימיזציה של מיקום הדגימה.
- יישום פרמטרים ברירת מחדל לאיסוף נתונים.
תוצאות עיקריות
- נאספו 85 מערכות נתונים חלקיות של עקיפה עם שלמות של 99.8%.
- הרזולוציה שהושגה הייתה 1.7 אנגסטרם.
- מבנה הגביש של Cerulean נפתר בהצלחה.
- השכלול הניב R work של 22.8% ו-R free של 25.4%.
מסקנות
- MeshAndCollect מאפשר איסוף נתונים יעיל מגבישים קטנים.
- השיטה הזו תומכת בביולוגים מבניים בפתרון מבנים מורכבים.
- היא מספקת פתרון לפרויקטים עם גידול גבישים מוגבל.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Structural determination of fluorescent proteins like Cerulean supports target validation and assay development in biopharma R&D by enabling mechanistic de-risking of protein function and interaction studies. The MeshAndCollect protocol addresses a key bottleneck in early discovery: obtaining high-quality structural data from poorly diffracting or micro-crystalline samples that hinder traditional X-ray crystallography workflows. This capability enhances predictive confidence in lead identification and supports portfolio triage by providing reliable structural insights for structure-based drug design.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through high-resolution structural data from weakly diffracting crystals.
- Operational Value: Supports biological de-risking by clarifying protein-ligand interactions and functional sites critical for target validation.
- Predictive Value: Improves confidence in structural models used for virtual screening and lead optimization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides validated structural templates for assay standardization and reproducibility in fluorescence-based screening platforms.
- Operational Value: Facilitates preparation of consistent biological systems for downstream compound evaluation and ligand screening campaigns.
- Scalability: Enables reuse of micro-crystal data collection workflows across multiple targets in structural genomics initiatives.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports alignment with disease-relevant systems by providing structural insights into fluorescent protein behavior in cellular environments.
- Mechanistic De-risking: Reduces ambiguity in target mechanism by confirming structural integrity under experimental conditions.
- Preclinical Readiness: Enables risk-adjusted advancement decisions through reliable structural data for biomarker and probe development.
Pipeline & Workflow Integration
The MeshAndCollect protocol fits within the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical support, particularly for projects challenged by difficult crystallization or limited sample availability.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by delivering high-resolution structural data from micro-crystals.
- Screening: Enhances assay readiness through standardized, reproducible structural inputs for ligand binding and conformational studies.
- Analytics: Generates quantitative diffraction data sets with high completeness (99.8%) and defined resolution (1.7 Å) for reliable comparative analysis.
- Translational Research: Connects structural findings to preclinical continuity by enabling biomarker alignment and probe development.
- Enterprise Reuse: Functions as a scalable, automated capability for structural data acquisition across multiple targets and campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target structure, reduction of mechanistic ambiguity, and improved model accuracy.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and rapid data collection from non-ideal crystals.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency in crystallography campaigns, and reduced biological risk in lead optimization.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on reliable structural data for advancement or termination decisions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein crystallography and synchrotron beamline operations.
- Dependent on access to VMX-equipped beamlines with high photon flux, small beam size, and fast detectors.
- Necessitates standardized sample preparation and puck-based loading protocols for consistent mesh-based positioning.
- Involves cross-team alignment between structural biology, assay development, and computational modeling groups.
- Limited by crystal quality and diffraction strength, though effective even with weakly diffracting micro-crystals.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:51
Offline Preparation of the Synchrotron Experiment
1:31
Loading of the Sample onto a Beamline
3:49
Prepare and Execute the MeshAndCollect Workflow
5:02
Results: Structure Determination of the Fluorescent Protein Cerulean using MeshAndCollect
6:10
Conclusion
