אופטימיזציה אינטרפרון-גמא ELISpot Assay מידה תגובות תא T במודל שפן לאחר החיסון

בעבר האפיון של אימונותרפיה במודל שפן הניסיונות הוגבל למדידת חסינות הומוריסטית. מכון ELISpot מתגבר על מגבלה זו והוא יסייע לחוקרים להפיק נתונים משמעותיים יותר במודל החייתי הזה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי התאים מתקבלים דם היקפי.

אין צורך בנקרופסיה. זה מאפשר מדידה של לא רק סדר גודל אלא גם קינטיקה של תגובות תאי T בחזירי ים בודדים במהלך זיהום טבעי או לאורך משטר חיסון. הפגנת ההליך תהיה הולי פיו.

היא עמיתת מחקר מהמחלקה פרה-קלינית R ו-D של Inovio. כדי להתחיל להוסיף 15 מיקרוליטרים של 35% אתנול לכל באר של צלחת בדיקה ELISpot. לאחר 60 שניות להוסיף 150 microliters של PBS לכל באר.

ולהפוך את הצלחת כדי לעצור טיפול מקדים אתנול. יש לנהוג בזהירות רבה גם בעת טיפול בצלחות ההתמדה ELISpot כדי למנוע זיהום או פגיעה בממברנה. כדי לשטוף את הצלחת להוסיף 250 microliters של PBS לכל באר.

לאחר חזרה על לשטוף פעמיים נוספות, להוסיף 100 microliters של ללכוד נגד גינאה חזיר אינטרפרון גמא נוגדן VE4 לכל באר. ואז לה הדגירה את הצלחת לפחות 12 שעות ב 4 מעלות צלזיוס. לאחר תקופת הדגירה לשטוף את הצלחות שלוש פעמים.

הוסף 200 מיקרוליטרים של מאגר חסימה לכל באר. דגירה הצלחת בטמפרטורת החדר במשך שעתיים. ואז לשטוף את הצלחות שלוש פעמים נוספות.

הכינו צינורות חרוטיים עם 4.5 מ"ל של מדיום שיפוע טמפרטורת החדר. ואז לערבב נפח שווה של תווי מלח מאוזנים של הנקס עם הדם. שכבת הדם מדולל בהדרגה על המדיום שיפוע צפיפות, דואג לא להפריע את הממשק.

לאחר מכן, צנטריפוגה הצינורות ב 800 x גרם במשך 30 דקות ללא בלמים בטמפרטורת החדר. הסר את הצינור מן הצנטריפוגה, דואג לא להפריע את השכבות. לאחר זיהוי נכון של השכבות שאפו את שכבת המעיל המלאה כדי לקצור את מחשבי ה-PBMCs.

שכבה איטית דם מדולל HBSS על המדיום שיפוע צפיפות. הימנע מכל הפרעה של הצינור ולכבות את הבלמים צנטריפוגה. מעבירים את התאים לצינור חדש של 15 מ"ל.

לאחר מכן לדלל את התאים R10 בינוני לנפח כולל של 15 מ"ל. לאחר pelleting את התאים, להשליך את supernatant ולתלות מחדש את התאים ב 15 מ"ל של R10 בינוני. מעבירים את מתלי התא דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר לצינור חדש.

ספור את התאים וקבע את מספר התאים החיים באמצעות בדיקת אי-הכללה כחולה של Trypan. לאחר מכן לדלל את התאים עם R10 בינוני. ראשית להסיר את מאגר החסימה ולשטוף את הצלחות.

עבור כל מדגם PBMC מצביעים על שליטה חיובית, שליטה שלילית וכל ממריצה ספציפית לניסוי. מדללים את בריכת החלבון פפטיד ב R10 בינוני עד שלוש פעמים את הריכוז הסופי הרצוי. לאחר מכן להוסיף 50 microliters של תערובת בינונית פפטיד R10 ל בארות בדיקה ממריץ של הצלחת.

לאחר מכן מוסיפים 50 מיקרוליטרים של ניסוח פפטיד MT במדיום R10 ל בארות הבקרה השליליות של הצלחת. הוסף ConA ב R10 בינוני לבארבות שליטה חיובית של הצלחת, ולאחר מכן להוסיף 100 microliters של ההשעיה PBMC לכל בארות. מניחים את צלחת ELISpot על משטח אחיד באינקובטור ולהימנע להפריע לצלחת במהלך תקופת הדגירה.

לאחר הסרת הצלחת בזהירות מן החממה, להפוך את הצלחת כדי להסיר את supernatant. ואז לשטוף את הצלחת שלוש פעמים. הוסף 100 microliters של זיהוי biotinylated מדולל ללכוד נגד גינאה חזיר אינטרפרון גמא נוגדן N-G3 לכל באר.

ואז לה הדגירה את הצלחת בטמפרטורת החדר במשך שעתיים. להפוך את הצלחת כדי להסיר את פתרון הנוגדן ולחזור על לשטוף שלוש פעמים. לאחר הסרת PBS מהצלחת, להוסיף 100 microliters של ALP נדנוד סטרפטבידין מדולל חוצץ חסימה לכל באר.

ואז לה הדגירה את הצלחת בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת. להפוך את הצלחת כדי להשליך את פתרון סטרפטבידין ALP ולשטוף את הצלחת פעמיים. להפוך את הצלחת כתם אותו נגד מגבת נייר נקייה כדי להסיר כל PBS עודף.

לאחר מכן לשטוף את הצלחת עם 250 microliters של מים DI Ultrapure לכל באר. להפוך את הצלחת ולהסיר את המים העודפים עם מגבת נייר נקייה. הבא להוסיף 100 microliters של פתרון מצע BCIP / NBT לכל באר.

הדגירה את הצלחת בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות מוגן מפני אור. יש לשטוף את הצלחת ארבע פעמים במים DI. לאחר מכן היפוך והקש על הצלחת כדי להסיר מים עודפים.

לבסוף, להסיר את ניקוז הפלסטיק מתחתית הצלחת ולאפשר את הממברנה להתייבש לחלוטין. לאחר צנטריפוגה הדרגתית צפיפות מוצלחת כפי שהוכח בעבר, הנוזל צמיג אדום בתחתית הצינור צריך להכיל את רוב תאי הדם האדומים. שכבת מעיל באפי היא בין שכבת הפלזמה למדיום שיפוע הצפיפות.

טיפול מקדים בארות לפני הוספת נוגדן לכידה, הראי הציג הגדרה משופרת יחד עם ירידה במספר כתמים לא ספציפיים בארות שליטה שלילית. כתמים מעידים על אינטרפרון גמא המייצר תאי T בתוך אוכלוסיית PBMC. כאשר מנסים טכניקה זו, חשוב לזכור בזהירות אבל במהירות לעבד את הדם.

זה ישפר את הכדאיות התאית, ישפר את היווצרות הנקודה ויפחית את היווצרותם של כתמים לא ספציפיים. אל תשכח כי עבודה עם דם ומצע BCIP / NBT יכול להיות מסוכן אמצעי זהירות כגון לבישת PPE המתאים תמיד צריך להילקח בעת ביצוע הליך זה. אני מאמין כי פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים לחקור מחלות עם מרכיב חשוב של תאי T כגון TB, אבולה, ו HSV.

חשוב לציין, זה יהיה לחדד את הפיתוח של פרוטוקולי חיסון במודל שרקן חזיר וזה יקטין את השימוש במודלים בעלי חיים פחות רלוונטיים.