זיהוי של אמנון אגם וירוס באמצעות קונבנציונאלי RT-PCR ו SYBR ירוק RT-qPCR

ברוכים הבאים כולם. שמי הוא ווינ סוראצ'טפונג. אני פרופסור למיקרוביולוגיה וטרינרית ופקולטה לאימונולוגיה לרפואה וטרינרית באוניברסיטת קסטסטארט, תאילנד.

אני והצוות שלי מתמחים במחלה נגיפית מתפתחת באנאפיה. עכשיו אנחנו עובדים על וירוס אגם אמנון אשר גורמים לתמותה גבוהה אמנון. מאז אמנון הוא מין הדגים השני החשוב ביותר כי הוא תרבות ברחבי העולם, הוא מספק מקור חלבון עבור מיליון אנשים לשחק תפקיד חשוב לביטחון המזון.

אז ההתפרצות האחרונה של נגיף אגם אמנון גורמת להשפעה חברתית-כלכלית שהובילה מדענים רבים לנסות למצוא פתרון לבעיה זו. עד כה אנו זקוקים לשיטה רגישה, מהירה ומדויקת מאוד כדי לזהות את הנגיף. בסרטון זה, אנו נראה לך צעד אחר צעד כדי לזהות וירוס אגם אמנון ברקמת דגים החל איסוף מדגם, אוכלוסיית מדגם, וניתוח PCR בזמן אמת.

ראשית, לבודד את מנת יתר של שמן בד במים כדי להנחית את הדגים. מניחים את הדגים המתים על מגש, מעקרים את הציוד באמצעות 95% אתנול, ואז נשרפים עם מבער אלכוהול. לאט לחתוך לפתוח את הדגים מהבטן התחתונה כלפי מעלה, כדי לאסוף את הכבד.

לאסוף חלק מהכבד לתוך צינור צנטריפוגה 1.5 מיליליטר. החלק הראשון של מיצוי RNA צריך להתבצע ברדס זרימה למינאר, וללבוש ציוד מגן. הוסף מיליליטר אחד של רה"מ מיצוי RNA לתוך הצינור.

לרסק את הכבד באמצעות עלה רקמה לתוך הומוגני. הוסף 200 מיקרוליטרים של כלורופורם לצינור. לאחר מכן, מערבבים בעדינות על ידי היפוך הצינור מספר פעמים.

מניחים בצד לשלוש דקות בטמפרטורת החדר. צנטריפוגה בארבע מעלות צלזיוס ב 12, 000 RCF במשך 15 דקות. בזהירות לאסוף את הצינורות מן הצנטריפוגה.

מעבירים בעדינות 500 מיקרוליטרים של השלב הממימי העליון חסר הצבע לצינור חדש. הוסף נפח אחד של isopropanol לתוך הצינור. מחממים במינוס 20 מעלות צלזיוס במשך שעתיים או עד לילה כדי לזרז את ה-RNA.

לאחר הדגירה, צנטריפוגה הפתרון באותו מצב צנטריפוגה. לאסוף את הצינורות מן הצנטריפוגה, ולאחר מכן להשליך את supernatant. גלולת RNA ניתן לראות מחודד על ידי החץ.

מוסיפים מיליליטר אחד של 75%אתנול לתוך הצינור כדי לשטוף את גלולת RNA, ולהפוך מספר פעמים. צנטריפוגה בארבע מעלות צלזיוס, ב 10, 000 RCF במשך 15 דקות. לאסוף את הצינורות מן הצנטריפוגה, ולאחר מכן להשליך את supernatant.

משוך את שאריות האתנול באמצעות צינור אוטומטי, ואוויר יבש בטמפרטורת החדר במשך חמש עד 10 דקות. הוסף 30 עד 60 microliters RNase מים חינם, מחומם מראש ל 55 עד 60 מעלות צלזיוס כדי לבודד את גלולת RNA. השתמש 1-2 microliters של פתרון RNA כדי למדוד את הריכוז באמצעות ספקטרופוטומטר מיקרו נפח.

התוצאות יופיעו על המסך. מדללים את הריכוז ל-200 ננוגרם למיקרוליטר באמצעות מים חופשיים של RNase. בצע סינתזת cDNA באמצעות הכימיקלים והתנאים המפורטים כדלקמן.

השתמש בתרמוציקלר כדי להמיר RNA ל- cDNA עם תנאים מוצעים. להלן הכימיקלים והתנאים המשמשים לקביעת עומס TiLV באמצעות PCR בזמן אמת. לוותר על שישה מיליליטר של תערובת מאסטר qPCR לתוך כל בקבוקון של צינור רצועת qPCR לבן.

לאחר מכן, ארבעה מיליליטר של מדגם cDNA נטען לתוך באר. בשלב זה יש לשנות קצה צינור חדש בכל באר, כדי למנוע זיהום מדגימה לדגימה. לאטום את רצועת qPCR בחוזקה עם כובע רצועת qPCR שקוף.

מערבבים בעדינות את הפתרון על ידי החלקה בקצה הרצועה. ואז להסתובב למטה באמצעות מיקרו צנטריפוגה כדי לאסוף את כל הנוזל בתחתית כלי הדם. השתמש בתנאי שני השלבים כפי שמוצג בסרטון, בחר את הבאר ב- 96 לוחית היטב בה תשתמש.

בחר ירוק סייבר כצמחייה לצבע. בחר לא ידוע כסוג לדוגמה והוסף שם לתיבה שם לדוגמה. פתח את המכסה של מכונת PCR בזמן אמת והצב את רצועת qPCR לתוך באר שהוקצתה.

אז תסגור את המכסה. הפעל את המחשב עם התנאי שנבחר. המכונה תתחיל ותפעל לאחר שהמכסה הגיע לטמפרטורה הרצויה.

לאחר סיום תנאי qPCR, מוצגת עקומת הגברה. כאן, חץ הקצב מציין היכן רמת הסף חותכת בין השלב המעריכי לשלב ליניארי שתביאו לערך CT. לאחר מכן, ערך ה- CT מנופח למספר עותק של יומן וירוסים כדי לחשב מספר שרידי וירוסים באמצעות העקומה הסטנדרטית.

שיא ההמסה מוצג גם כדי לזהות אם הנגיף שזוהה על ידי qPCR הוא, אכן, TiLV שבו פסגות ההמסה נעות בדרך כלל בין 79.5 ל -80.5 מעלות צלזיוס. לכן אנו מקווים כי שיטה זו תהיה כלים חשובים עבור חקלאים וארגון ברחבי העולם, אשר עשויים לדרוש ליישם שליטה ולהגביל את התפשטות זיהום TiLV.