הערכה של מספר נפרורון בכליה שלמה באמצעות שיטת השימוש באסיד

שיטת maceration חומצה יכול לעזור לענות על שאלות מפתח על הכליה וכיצד גנים ספציפיים לתרום או להשפיע על התפתחות נפרונים, כמו גם כיצד תנאים ספציפיים, כגון סוכרת או יתר לחץ דם, להשפיע על מספר נפרונים. זה חשוב כמו מספר כולל של nephrons אנשים שנולדו עם נקבע במהלך התפתחות העובר ואובדן של נפרונים נקשר עם פתולוגיה כליות. היתרונות העיקריים של שיטת maceration חומצה הם שזה מהיר יותר, לשחזור יותר, זול, ופחות זמן רב מאשר שיטות אחרות ספירת נפרון, כמו דימות תהודה מגנטית.

טכניקה זו מקלה על המתאם של ההשפעה במספר נפרון על תפקוד הכלייתי, אשר חשוב לקדם את ההבנה שלנו כיצד גנים ספציפיים משפיעים על תפקוד והתפתחות נפרונים. המחקר של גנים או גורמים המשפיעים על מספר nephron הכולל יהיה אינסטרומנטלי בפיתוח של גישות תרופתיות או גנטיות שנועדו להגביל את אובדן נפרונים הקשורים למחלות. עם טכניקה ניסיונית טובה ותרגול, אנשים חדשים בשיטה זו צריכים בקלות להשיג שליטה בשיטת maceration חומצה המאפשר הערכות אמינות לשחזור של מספרי נפרון כליות שלמים.

התחל באמצעות מספריים כירורגיים עדין כדי לפתוח את חלל הבטן של העכבר לאורך קו האמצע. בזהירות להעביר את המעיים ואת שומן הרבייה לצד ימין של החיה. באמצעות ניתוח ברוטו, לבודד את הכליה השמאלית לחתוך את עורק הכליה השמאלית ואת וריד להסיר בזהירות את הכליה הצבת האיבר לתוך סירה כראוי שכותרתו לשקול של PBS.

לאסוף את הכליה הנכונה באותו אופן ולהנחות את שתי הכליות על גזה כירורגית מראש לח עם PBS. הסר במהירות כל רקמת כליות חסידה ואת כמוסות הכליה. לאחר מכן משקל כל כליה בנפרד הקלטת המשקל של האיבר השמאלי והימין בנפרד.

לאחר השקילה, מניחים כל כליה בחזרה לתוך סירת שקילה שכותרתו כראוי ללא PBS ולהשתמש סכין גילוח נקי לחתוך כל איבר בחצי אורך. מניחים כל כליה חצי לחתוך את הצד לחתוך כל חצי לשני מילימטר או חתיכות קטנות יותר. באמצעות אותו סכין גילוח, בזהירות להעביר את חתיכות הכליה קצוצה לתוך צינור חרוט 15 מיליליטר שכותרתו כראוי.

במכסה המנוע של אדים מאווררים היטב, הוסיפו חמישה מיליליטר של שש חומצה הידרוכלורית טוחנית לכל צינור. לאחר מכן, בעדינות להתסיס את תערובות חומצת הכליות לפני הצבת הצינורות לתוך 37 מעלות צלזיוס אמבט מים במשך 90 דקות. בסוף maceration חומצה, לצרף מחט אחד 18 מד מזרק אחד חמישה מיליליטר לכל כליה בזהירות להסיר את בוכנה מזרק.

מניחים את המזרקים בצינורות חרוטיים בודדים של 50 מיליליטר במכסה המנוע של האדים ויוצקים את פתרונות הכליות לקצה הפתוח של כל מזרק ומניחים את הצינורות הריקים בצד במתלה מבחנה. ואז בזהירות להחליף את הבוכנה עבור הבלטה איטית של כל פתרון דרך המחטים לתוך צינורות 50 מיליליטר. לשטוף את צינורות חרוט 15 מיליליטר עם חמישה מיליליטר של פתרון PBS לכל צינור מערבולת PBS כדי לבודד את כל רקמת הכליה שנותרה.

להבליט את תכולת לשטוף לתוך הצינור המתאים 50 מיליליטר כפי שהוכח רק. לאחר הבלטת הכביסה השלישית, לצייד כל מזרק עם מחט 21 מד. להבליט את התוכן של צינורות 50 מיליליטר לתוך קבוצה שנייה של צינורות 50 מיליליטר דרך שטיפת מחט נשא קטן יותר הבלטה הראשון 50 מיליליטר תוכן צינור שלוש פעמים עם PBS טרי כפי שהודגם.

לאחר הכביסה וההבלטה השלישית, מביאים את הנפח הכולל בכל צינור עד 50 מיליליטר עם PBS נוסף ומכניסים את הצינורות במדף על צלחת נדנדה בארבע מעלות צלזיוס בן לילה. בתוך חמישה ימים של עיבוד, למקם רשת המכילה 16 חלקים נפרדים על החלק התחתון של שש בארות של צלחת 12 באר. בעדינות להפוך את הצינורות של פתרון הכליות מספר פעמים כדי לעכל את הרקמות גלולה.

בזהירות להוסיף שלושה 500 aliquots microliter של כל פתרון הומוגני לכל כליה לכל אחת משלוש בארות של צלחת 12 גם. לדלל את התוכן של כל באר עם נפח שווה של PBS. מניחים את הצלחת על הבמה של מיקרוסקופ הפוך.

זהה את הגלומרולי לפי המבנה הכדורי שלהם, הגוון האדמדם, והעורקים שלפני או פוסט המחוברים לגופם של גלומרולי בודדים. ספור את מספר גלומרולי לכל מקטע מרותק כדי לסכם את הספירה לרשת לחישוב המספר הכולל של גלומרולי ל הבאר. ואז להכפיל את מספר glomeruli לגם פעמים 100 כדי לקבל את המספר הממוצע של glomeruli לכל כליה.

בניסוי מייצג זה, מספר nephron הכולל בעכברים חדורים ברכב במשך 14 ימים היה כ 12, 500 נפרונים לכל כליה. אנגיוטנסין שני עירוי עם זאת, הגדיל את הלחץ פרוזדורי על ידי כ 40 מילימטרים של כספית היה קשור עם ירידה משמעותית כמעט 26% במספר נפרונים הכולל. במודל גנטי זה של גילנאות כליות חולדה, בעלי חיים שנולדו עם שתי כליות חושבו להכיל כ 27, 500 נפרונים לכל כליה לאחר maceration חומצה כפי שהוכח, בעוד חולדות שנולדו עם כליה בודדת נמצאו בעלי מספרי נפרונים הכולל נמוך באופן משמעותי.

הערכות משני הניסויים תאם את הטווחים שדווחו בעבר בחולדות. שיטת ההאצה החומצית אידיאלית להערכת מספרי נפרונים בכליות שלמות, במיוחד במעבדות שלא מצוידות בטכניקות אינטנסיביות יותר לעבודה וחסכוניות לספירת נפרונים, כגון שיטת השברים של disector או דימות תהודה מגנטית. שיטה זו מאפשרת תפוקה גבוהה, הערכה יעילה וניתנת לשחזור של מספר נפרון כליה שלם שהם בטווח של 5% מהמספרים שנקבעו על ידי דימות תהודה מגנטית.

ההערכה של מספר נפרונים היא רלוונטית קלינית כמו מספרי נפרונים מופחתים קושרו עם סיכון מוגבר למחלות לב וכלי דם, כגון מחלת כליות כרונית. אל תשכח כי עבודה עם חומצה הידרוכלורית יכול להיות מסוכן מאוד, כי אמצעי זהירות יש לנקוט, כגון ללבוש כפפות, משקפי מגן, מעיל מעבדה.