Photobleaching מאפשר הדמיה ברזולוציה-העל של הטבעת FtsZ Cyanobacterium Prochlorococcus

כאן נתאר שיטת photobleaching כדי להפחית את autofluorescence של כחוליות. לאחר photobleaching, שחזור אופטי סטוכסטי מיקרוסקופ משמשת כדי לקבל תמונות סופר-ברזולוציה תלת מימדי של הטבעת FtsZ cyanobacterial.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח על לוקליזציה של חלבונים ועל הדינמיקה באורגניזמים פוטוסינתטיים. על ידי שילוב שיטת photobleaching עם מיקרוסקופ ברזולוציה סופר, אנו מסוגלים לזהות את דינמיקת החלבון של אורגניזמים פוטוסינתטיים בפירוט מדהים. שיטה זו לא רק מספקת תובנה על דינמיקת החלבון של פרוכלורוקוק.

זה יכול להיות מיושם גם על אורגניזמים רבים אחרים המכילים רדיו-re-dop-לשיר ו bacteriochlorophyll. הוכחת הליך זה תהיה Yanxin ליו, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, להוסיף חמישה מיליליטר של מי ים מבוססי Pro99 בינוני לבקבוק תרבות לחסן אותו עם מיליליטר אחד של Prochlorococcus MED4.

לגדל את Prochlorococcus ב 23 מעלות צלזיוס תחת אור בעוצמה של 35 פוטונים micromole למ"ר. לאחר חמישה ימים, לאסוף מיליליטר אחד של התרבות לתוך צינור 1.5 מיליליטר. הוסף 100 microliters של פורמלדהיד מוכן טרי לצינור כדי לתקן את התרבות.

דגירה בחושך בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות. לאחר מכן, לסובב את המדגם ב 13, 500 פעמים G לדקה אחת. הסר את supernatant ו resuspend התאים ב 100 microliters של מדיום Pro99.

לאחסן את המדגם בארבע מעלות צלזיוס בחושך עד מוכן לבצע immunostaining. ראשית, מערבולת הבקבוקון של גם גם פדיות פוליסטירן. באמצעות 50% אתנול, להכין אחד עד 20, 000 דילול כמו תרחיף עובד.

מפעילים את החום ומגדירים את הטמפרטורה ל-120 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, מניחים את הכיסויים על הצלחת החמה. לטעון 100 microliters של תרחיף עובד על כל coverslip ולהדק את הכיסויים על החם במשך 10 דקות.

לאחר מכן מעבירים בזהירות את הכיסויים למנות פטרי לצד חרוזים לאחסון בטמפרטורת החדר. כאשר מוכן לצפות את כיסויים, לאחזר אחד, לוודא שזה צד חרוז למעלה. הוסף 100 microliters של מיליגרם אחד לכל פתרון פולי-L-ליסין מיליליטר למרכז הכיסוי ולתת לו לשבת בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.

לאחר מכן, השתמש פיפטה כדי לשאף בזהירות כל פולי-L-לינזין מחובר ולהעביר אותו צינור 1.5 מיליליטר. אחסן פולי-ל-ליסין זה בארבע מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר. שוטפים את הכיסויים ב-10 מיליליטר של מים מסוננים במיוחד בצלחת פטרי 60 מ"מ ואז מייבשים אותה בקצרה במגבת נייר.

מעבירים את כיסוי מצופה לצלחת פטרי חדשה עם Parafilm בתחתית, אשר ישמש כצלחת הכתמים. לטעון 100 microliters של המדגם קבוע על coverslip ולתת לו לשבת במשך 30 דקות כדי לאפשר קובץ מצורף לתא. לאחר מכן, השתמש במגבת נייר כדי לספוג את הפתרון הנותר ולאחר מכן להעביר את כיסוי ל הבאר בצלחת 12 היטב לכביסה.

הוסף מיליליטר אחד של מאגר PBS ל באר לשטוף את הכיסוי. לאחר מכן להסיר את PBS ולהוסיף מיליליטר אחד של PBS טרי לשטוף את coverslip בפעם השנייה. השתמש פיפטה כדי להסיר את PBS ולהחליף אותו עם מיליליטר אחד של מאגר permeabilization מוכן טרי.

דגירה צלחת הכביסה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. לאחר מכן הסר את מאגר החיבור. התחל את תהליך הכביסה על-ידי הוספת מיליליטר אחד של מאגר PBS טרי.

מניחים את צלחת הכביסה על שייקר כדי להתסיס בעדינות את המנה במשך חמש דקות. לאחר מכן, להסיר את PBS ולחזור על תהליך הכביסה שלוש פעמים. מעבירים את הכיסויים השטופים לצלחת ההכתמות.

הוסף 50 מיקרוליטרים של מאגר חסימה בחלק העליון של הכיסוי. מניחים את כל צלחת הכתמים על קרח ולאחר מכן להזיז אותו תחת מקור אור קסנון עבור photobleaching לפחות 60 דקות. לאחר פוטובלאצ'ים וחסימה, השתמש בקצה מגבת נייר כדי להסיר את מאגר החסימה.

ראשית, לדלל מיקרוליטר אחד של נוגדן נגד FtsZ לתוך 99 microliters של חיץ חסימה. מניחים 50 microliters של הנוגדן העיקרי מדולל על כיסוי הדגירה אותו בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. מעבירים את הכיסויים לגם של צלחת הכביסה.

כדי להתחיל את הכביסה, להוסיף מיליליטר אחד של PBS. לאחר מכן מעבירים את צלחת הכביסה לשייקר ומנערים אותה בעדינות במשך חמש דקות. הסר את PBS וחזור על כל תהליך הכביסה שלוש פעמים.

לאחר מכן, מעבירים את הכיסויים לצלחת ההכתמות. מניחים 50 מיקרוליטרים של הנוגדן המשני המדולל על המכסה ומדגרים אותו בחושך וטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. מעבירים את הכיסויים בחזרה לצלחת הכביסה.

כדי להתחיל את הכביסה, להוסיף מיליליטר אחד של PBS. עוטפים את צלחת הכביסה בנייר אלומיניום כדי להגן עליה מפני אור. מעבירים את הצלחת לשייקר ומנערים אותה בעדינות במשך חמש דקות.

הסר את PBS וחזור על כל תהליך הכביסה שלוש פעמים. מיד לפני הדמיית STORM, הכן מיליליטר אחד של מאגר הדמיה כמפורט בפרוטוקול הטקסט. טען את הכיסויים לתא הטעינה.

מוסיפים את חיץ ההדמיה הטרי, להיות עדין כדי למנוע שטיפת תאים ציאנובקטריאליים. לאחר מכן, מניחים כיסוי מלבני על גבי מאגר ההדמיה כדי למנוע ממנו להגיב עם החמצן באוויר. הפעל את המצלמה, את אור ה-LED ואת הלייזר, ולפתוח את תוכנת STORM.

מוסיפים חצי טיפת שמן טבילה על גבי העדשה. לטעון את התא, לוודא כי העדשה האובייקטיבית היא יצירת קשר עם כיסוי. ולבדוק את האות עם לייזר 750 ננומטר.

זהה אזור דגימה המכיל הן תאים והן סמנים נאמנות. לאחר מכן הפעל את התוכנה לתיקון נסחף לדוגמה. לרכוש תמונה אחת רחבה מתויק כהפניה, עם רווח כפל אלקטרון המצלמה ב 300 ותזמן חשיפה של 30 אלפיות השניה.

הגדל את עוצמת הלייזר של 750 ננומטר ל-4.5 קילוואט לס"מ מרובע בקירוב. לאחר הפלואורופורים עברו לדפוס מהבהב דליל, לרכוש תמונה אחת ברזולוציה סופר על ידי איסוף 10, 000 מסגרות ב 33 הרץ. לאחר מכן בנה מחדש את התמונות ברזולוציית העל מהנתונים הגולמיים כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

במחקר זה, STORM משמש להשגת הדמיה ברזולוציה סופר על ידי הפעלת פלואורופורים בודדים הניתנים להחלפת תמונות באופן סטוצ'סט. המיקום של כל פלואורופור נרשם, ותמונה ברזולוציית-על נבנית לאחר מכן בהתבסס על מיקומים אלה. בעוד ספקטרום הספיגה של Prochlorococcus פסגות ב 447 ו 680 ננומטר ויש לו ספיגה מינימלית מעל 700 ננומטר, Prochlorococcus MED4 תאים עדיין פולטים שפעת אוטומטית גבוהה כאשר נחשפים לעוצמה גבוהה מאוד של לייזר 750 ננומטר, אשר נדרש עבור הדמיה STORM.

לאחר שימוש בשיטת photobleaching המתוארת כאן במשך 30 דקות, נראה כי שפעת התאים יורדת, אם כי מספר תאים עם שפעת אוטומטית עדיין מזוהים. הארכת הצילום ל-60 דקות גורמת לרוב התאים לאבד את שפעת הרכב שלהם. תוצאות אלה מצביעות על כך ששיטת הפוטובלצ'ינג המפותחת מסוגלת להפחית במידה ניכרת את שפעת הרכב של אורגניזמים פוטוסינתטיים.

לאחר photobleaching, STORM משמש כדי לדמיין את החלבון חלוקת התא, FtsZ, בתאים. באמצעות STORM, מורפולוגיה מפורטת של טבעת FtsZ מתגלה. על ידי סיבוב תמונות 3D STORM, זוהו ארבעה סוגים שונים של מורפולוגיות, אשכולות, טבעת לא שלמה, טבעת שלמה וטבעות כפולות.

חשוב לזכור כי עוצמת האור ומשך הזמן של photobleach עשוי להיות שונה עבור אורגניזמים שונים. לאחר התפתחותו, שיטה זו סוללת את הדרך לחוקרים שרוצים לחקור את ארגון החלבון ואת הפונקציה הפוטנציאלית בתאים פוטוסינתטיים בפירוט.